邊遜，陳超

(南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210014)

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基于GC-MS技術毛細支氣管炎痰熱閉肺證和風熱閉肺證的代謝組學研究

邊遜，陳超*

(南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210014)

目的：采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術的代謝組學方法，分析毛細支氣管炎中醫(yī)痰熱閉肺證與風熱閉肺證在尿樣代謝物的變化差異。方法：收集毛細支氣管炎患兒痰熱閉肺證(痰熱組)57例、風熱閉肺證(風熱組)20例和健康兒童(對照組)22例。以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對各組受試患兒的尿液樣本進行代謝圖譜分析，并對潛在的生物標記物進行鑒定。結果：RSV感染組與正常對照組在尿樣小分子代謝物表達上存在著明顯差異，研究篩選出21種差異性代謝物標志；中醫(yī)不同證型間亦存在小分子代謝物含量的明顯差異，篩出兩證型間具有統(tǒng)計學差異的差異生物標志物共13種。結論：痰熱閉肺證與風熱閉肺證之間的代謝通路改變具有差異性。

代謝組學；毛細支氣管炎；痰熱閉肺證；風熱閉肺證；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術

自1999年Nicholson[1]和FiehntW[2]先后提出代謝組學的概念，并將其運用于疾病診斷及藥物篩選，在醫(yī)學科學領域使用越來越廣泛。在中醫(yī)藥研究各領域也得到了越來越多的學者關注，在中醫(yī)兒科證候?qū)W研究中的運用尚處于起步階段[3-4]。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用代謝組學技術對毛細支氣管炎痰熱閉肺證和風熱閉肺證患兒尿液小分子代謝物的變化差異進行分析，探析毛細支氣管炎中醫(yī)不同證型的代謝組學特征，以期為毛細支氣管炎中醫(yī)證候?qū)W研究提供代謝組學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

全部病例均為2012年2月—2014年4月南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院兒科、南醫(yī)大二附院RSV毛細支氣管炎住院患兒，共77例，其中痰熱閉肺證57例，年齡最小4個月，最大4.2歲；風熱閉肺證組20例，年齡最小6個月，最大4歲。2014年3月—2015年10月南京市婦幼保健醫(yī)院預防保健科健康體檢患兒22例。簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

西醫(yī)參照全國高等學校教材《兒科學》(第7版);中醫(yī)疾病診斷參照普通高等教育“十一五”國家級規(guī)劃教材、新世紀全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中醫(yī)兒科學·肺系疾病·肺炎喘嗽》;證候診斷參照國家技術監(jiān)督局發(fā)布《中華人民共和國國家標準·中醫(yī)臨床診療術語證候部分》及新世紀全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中醫(yī)兒科學·肺系疾病·肺炎喘嗽》的相關內(nèi)容。排除應激和先天性心臟病、支氣管肺發(fā)育不良、早產(chǎn)及免疫缺陷等患兒。

1.3 儀器與試劑

旋渦振蕩器(型號XW-80A,上海醫(yī)大儀器廠)；渦旋混合儀(QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；氮氣濃縮儀(D10-32，杭州奧盛儀器有限公司)；干燥箱(MOV-212，SANYO，日本)；色譜-質(zhì)譜分析儀(Thermo，美國)；恒溫離心機(Eppendorf，德國)；上樣瓶、瓶帽及進樣管(CNW，德國)；移液槍若干。

丙酮(色譜純,南京化工廠)；氯仿(分析純,南京化工廠)；甲醇(分析純,南京化工廠)；乙腈(色譜純,fisher scientific，美國)；雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)含 1%三甲基氯硅烷(TMCS,sigma，美國)；核糖醇(sigma，美國)；氮氣(北京華宇辰氣體合成公司)；碎冰(自制)。

1.4 標本采集與制備

根據(jù)知情同意書，于患兒入院第2天，取清晨取清晨空腹時中段尿液5 mL，經(jīng)13000 r/min離心10 min。取上清3 mL，分裝，先置于-20℃，1周后置-80℃保存；標本測試時將凍存的血清樣本在室溫下解凍，取200 μL置離心管中，加入20 μL脲酶渦旋充分混勻，置于37℃水浴。并進行常規(guī)氣相色譜-質(zhì)譜檢測進樣前處理工作后，待進樣分析。

1.5 分析條件 見表1～2。

表1 兩種進樣方式

表2 三種升溫程序

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

1.6.1 數(shù)據(jù)提取

在樣品測定時，用Agilent MassHunter Workstation軟件包中的Data Acquisition軟件進行數(shù)據(jù)采集，然后用Qualitative Analysis對獲得的數(shù)據(jù)進行分子特征識別，分析處理獲得的尿樣圖譜，利用解卷積(分子特征提取算法)功能，尋找豐度隨時間一起升高和降低的離子，鑒定它們屬于同一化合物。對總離子流(TIC)圖進行精確的特征分子提取，提取結果轉(zhuǎn)化為CEF格式文件，導入Mass Profiler Professional(MPP)軟件。

1.6.2 統(tǒng)計分析

利用MPP軟件處理數(shù)據(jù)，首先使用精確質(zhì)量數(shù)和保留時間對原始數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)對齊。對齊后對數(shù)據(jù)歸一化處理和數(shù)據(jù)篩選，即篩選在任意一組超過70%樣品中能被檢測到的化合物，進而對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用主成分分析(principal component analysis,PCA)法來描述數(shù)據(jù)內(nèi)部的特征。通過PCA得分圖(Score plot)獲得樣本分類信息，發(fā)現(xiàn)可作為生物標記物的化合物。本實驗對數(shù)據(jù)進行PCA，通過PCA得分圖(Score plot)獲得樣本分類信息，通過PCA載荷圖(Loading plot)發(fā)現(xiàn)可作為生物標記物的化合物。在PCA尋找到的生物標記物的基礎上用PLS-DA 進行建模，來考察生物標記物對于毛細支氣管炎中醫(yī)不同證候篩選的準確度和靈敏度。多維統(tǒng)計中找出差異代謝物，并應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行Kruskal-Wallis檢驗和單因素ANOVA分析的驗證，結合VIP值大于1并具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的代謝物確定為潛在標記物。

2 結果

2.1 尿液氣相色譜-質(zhì)譜代謝輪廓分析

對比三組尿液樣本氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用總離子色譜流圖，具體見圖1～3，可以看出在相同保留時間下毛細支氣管炎組與正常對照組相比很多離子峰高、峰面積存在著明顯差異。證明同一物質(zhì)在兩者之間含量不同，表明在RSV感染的疾病狀態(tài)下，體內(nèi)的一些小分子代謝物通路發(fā)生了異常；中醫(yī)不同證型間亦存在小分子代謝物含量的明顯差異。

圖1 對照組總離子圖

圖2 風熱閉肺組總離子圖

圖3 痰熱閉肺組總離子圖

2.2 潛在標志物

采用GC-MS儀器自帶的相似匹配軟件結合保留時間，通過PCA法等分析，經(jīng)SIMCA-P軟件分析并經(jīng)過譜庫鑒定得出差異代謝物，具體代謝差異物生物標志熱圖見圖4，圖中每列代表一個代謝物，每行代表一個樣本，樣本排序為正常對照組、風熱閉肺組、痰熱閉肺組。分析得出毛細支氣管炎患兒相比健康對照組有統(tǒng)計學意義的差異表達血清代謝物有21種：尿酸，黃嘌呤核苷，肉毒堿，嘧啶，呋喃酮，1-蘇氨酸，丙酸，1-丙氨酸，乙酸，1H-咪唑-胺類，D-左旋糖，L-蘇糖醇，丁酸，L-蘇糖酸，赤蘚糖醇，L-谷氨酰胺，L-賴氨酸，犬尿酸，色胺酸，肌酐，4,8-二羥基喹啉-2-甲酸，其中痰熱閉肺組與風熱閉肺組之間相比具有統(tǒng)計學差異的表達代謝物有13種：肉毒堿，尿酸，1-蘇氨酸，嘧啶，丁酸，L-蘇糖酸，赤蘚糖醇，L-蘇糖醇，果糖，1-賴氨酸，，L-谷氨酰胺，犬尿酸，肌酐。具體差異性比較見表3。

表3 各組尿液樣本差異代謝標志物篩選結果比較

圖4 尿液樣本中篩選所得生物標志物的熱圖

3 討論

急性毛細支氣管炎是嬰幼兒時期臨床最為常見的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床上以喘憋為特征，好發(fā)于3歲以內(nèi)患兒，沈軍等收集了2007全年的992例急性下呼吸道感染患兒痰標本進行病原學分析，結果發(fā)現(xiàn)RSV陽性標本268份，為最重要的感染病原，且冬季為RSV感染高峰，3月齡以下兒童檢出率為36．4%，3足月到6月齡以下兒童檢出率為49．5%，2歲以下兒童占92.5%[5]，近年來隨著越來越多的臨床研究表明，RSV毛細支氣管炎后易發(fā)生反復喘息，且RSV感染與小兒支氣管哮喘的形成和反復發(fā)作的關系最為密切[6]。Sigurs等對年齡小于1歲RSV下呼吸道感染患兒進行長達7年的前瞻性研究，結果顯示其日后反復喘息及哮喘的發(fā)生率分別為68%和30%[7]。臨床以中醫(yī)痰熱閉肺證居多數(shù)，汪受傳[8]等觀察75例病毒性肺炎住院患兒，其中80%屬痰熱閉肺證，其余為風熱犯肺證(8.0%)、肺脾氣虛證(5.3%)、陰虛肺熱證(4.0%)和風寒襲肺證(2.7%)，認為痰熱壅阻、肺氣閉塞是小兒病毒性肺炎的主要病機。

代謝組學是現(xiàn)代系統(tǒng)生物學中的一門新興學科，自2009年SlupskyCM[9]首次提出基于NMR的代謝組學研究方法可能適用于肺炎的病因快速診斷，在未來肺炎的醫(yī)學研究中具有明顯優(yōu)勢，通過尋找與生長發(fā)育及疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸相關的生物標記物群，確定代謝物與健康和疾病的關聯(lián)性，從而為臨床干預治療提供科學依據(jù)。本研究采用GC-MS代謝組學技術分析毛細支氣管炎中醫(yī)不同證候患兒尿液代謝物發(fā)現(xiàn)，毛細支氣管炎患兒與健康對照組之間在小分子代謝物表達水平具有明顯差異，共篩出具有統(tǒng)計學意義的差異表達血清代謝物21種：尿酸，黃嘌呤核苷，肉毒堿，嘧啶，呋喃酮，1-蘇氨酸，丙酸，1-丙氨酸，乙酸，1H-咪唑-胺類，D-左旋糖，L-蘇糖醇，丁酸，L-蘇糖酸，赤蘚糖醇，L-谷氨酰胺，L-賴氨酸，犬尿酸，色胺酸，肌酐，4,8-二羥基喹啉-2-甲酸，其肉毒堿、尿酸、呋喃酮、1-蘇氨酸、乙酸、L-蘇糖酸、L-谷氨酰胺、L-賴氨酸、肌酐、2氨-咪唑這11種代謝物具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.001)；痰熱閉肺組與風熱閉肺組之間相比具有統(tǒng)計學差異的表達代謝物有13種：肉毒堿、1-賴氨酸、L-谷氨酰胺、肌酐(P<0.001)，L-蘇糖醇、1-蘇氨酸、赤蘚糖醇、尿酸(P<0.01)，提示痰熱閉肺證與風熱閉肺證之間的代謝通路改變具有差異性。

代謝組學是通過分析生物體內(nèi)內(nèi)源性小分子代謝物的動態(tài)變化，描繪出生物體代謝輪廓，現(xiàn)代醫(yī)學運用代謝組學技術描繪并篩選機體疾病狀態(tài)下的小分子代謝物的差異性生物標志物，可以進一步探索內(nèi)源性物質(zhì)代謝與疾病的關系[10-11]，本研究采用GC-MS代謝組學技術從代謝組學小分子水平初步反映了小兒毛細支氣管炎痰熱閉肺證、風熱閉肺證的尿樣代謝特征，為從生物代謝的角度研究中醫(yī)證候的現(xiàn)代科學內(nèi)涵提供了一定的實驗依據(jù)，為今后中醫(yī)兒科證候?qū)W研究做出了有益探索。

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南京市醫(yī)學科學發(fā)展十二五重大項目(No.ZDX12012)

邊遜(1962-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向：小兒呼吸系統(tǒng)疾病。

陳超*(1977-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要研究方向：中醫(yī)兒科肺系疾病。

2016-04-06

R285.6

A

1002-2406(2016)06-0066-04

修回日期：2016-05-01