楊續(xù)艷，王玲姝，謝梁振，張潤桐,劉樹民

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，

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清蘚飲調(diào)控Th1、Th2型細(xì)胞因子治療口腔扁平苔蘚的作用機制研究

楊續(xù)艷1,2，王玲姝2，謝梁振2，張潤桐1,劉樹民3*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，

黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：評價“清蘚飲”對口腔扁平苔蘚患者外周血中Th1、Th2型細(xì)胞因子表達的影響。方法：40例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的OLP患者口服清蘚飲，每日1劑，早、晚餐后各1次，連續(xù)8周?？瞻讓φ战M40例為健康志愿者，不服藥。采用空白對照方法，使用ELISA法檢測空白對照組與治療組治療前后外周血中Th1型細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6的表達情況，并觀察評定“清蘚飲”臨床療效。結(jié)果：患者經(jīng)過8周的治療后，顯效28例，有效8例，無效4例，總有效率為90℅?；颊咧委熐巴庵苎蠺NF-α、IL-4和IL-6表達水平,TNF-α/IL-4比值均有明顯變化，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：清蘚飲治療口腔扁平苔蘚有良好的臨床療效，其作用機制可能調(diào)整患者體內(nèi)Thl/Th2漂移，從而起到對機體的免疫調(diào)節(jié)作用。

清蘚飲；口腔扁平苔蘚；Th1型細(xì)胞因子；Th2型細(xì)胞因子

口腔扁平苔蘚(orallichenplanus，OLP)是一種口腔黏膜慢性非感染性炎癥性疾病，以口腔黏膜灰白色角化的丘疹交織呈珠光色條紋或斑塊網(wǎng)狀、環(huán)狀、樹枝狀花紋樣損害為特點，有時病損中央可見糜爛、色素沉著,可累及雙頰、舌及附著齦等位置的黏膜。由于其有“癌前狀態(tài)”及纏綿難愈的特點，在臨床上成為研究熱點[1]。以細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IL-4、IL-6比例為表征的輔助性 T 細(xì)胞 1(helper T cell，Th1)與輔助性 T 細(xì)胞 2(helper T cell，Th2)比例失衡，存在于OLP患者的血清、唾液和病損局部，提示有可能OLP的發(fā)病機制與CD4+的Th細(xì)胞分化失衡有關(guān)[2-5]。其中IL-2、TNF-α為Th1細(xì)胞因子，IL-4、IL-6為Th2細(xì)胞因子。目前對于OLP患者外周血中Th1、Th2細(xì)胞平衡狀態(tài)的研究結(jié)果存在差異[2,6-7]。

本研究通過對OLP患者口服“清蘚飲”治療前后與健康正常人外周血中Th1、Th2細(xì)胞因子的表達變化水平進行檢測,揭示黑龍江地區(qū)OLP患者外周血Th1、Th2細(xì)胞比例變化情況。同時，探索中藥復(fù)方清蘚飲治療OLP的臨床療效、及其細(xì)胞因子水平的作用機制，為中藥復(fù)方治療OLP提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取于2014年8月—2016年1月我院口腔科黏膜病診室收治的40例經(jīng)臨床及病理檢查確診為OLP患者為研究對象。其中男23例，女17例，年齡37～67歲，平均年齡(43.19±14.57)歲，病程3～54個月，平均病程(10.51±7.61)個月。發(fā)病部位以頰部和舌背為主。臨床表現(xiàn)為黏膜網(wǎng)狀、條索狀的白色病損，可伴見糜爛、水皰等，頰部病損多左右對稱，隨著病程延長，病損程度加重時，患者可出現(xiàn)舌舔黏膜粗澀，進食燒灼感[8]。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

1)對照組患者符合健康人的診斷標(biāo)準(zhǔn)；2)治療組患者臨床癥狀及病理檢查符合OLP表現(xiàn)；3)自愿簽署知情同意書者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

1)不符合上述健康人診斷標(biāo)準(zhǔn)者；2)病理示上皮異常增生者；3)近期內(nèi)(周內(nèi))有各種感染者；4)妊娠或哺乳期婦女，對中藥復(fù)方過敏者；5)患者伴有全身系統(tǒng)性疾病(包括糖尿病、心血管疾病、肝炎等)；6)未簽署知情同意書者；7)研究人員認(rèn)為其他原因不適合臨床試驗者；8)有家族遺傳性疾病者;9)既往有免疫系統(tǒng)性疾病，如SLE、類風(fēng)濕等；10)近期全身使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或疫苗等藥物；11)惡性腫瘤病史。

1.4 治療方法

治療組：40例OLP患者，給予服用中藥復(fù)方“清蘚飲”(組方：白蘚皮、僵蠶、皂角刺、連翹、白芍等)，每日1劑，開水沖服(天江中藥免煎顆粒劑)，早、晚餐后30 min口服，每周復(fù)診1次記錄癥狀變化情況，8周后完成治療，并進行臨床癥狀記錄及療效評價。

空白對照組：選取健康志愿者40例。年齡和性別與治療組匹配，“齊性試驗”(P>0.05)。研究對象均簽署知情同意書。

1.5 臨床療效評價標(biāo)準(zhǔn)

采用中華口腔醫(yī)學(xué)會口腔扁平苔蘚(萎縮糜爛型)療效評價標(biāo)準(zhǔn)(試行)[9]。

顯效：充血糜爛完全消失，白色條紋無或輕微，患者無自覺癥狀，疼痛完全消失；有效：充血糜爛的面積縮小，白色條紋減少；自覺癥狀不明顯，疼痛減輕。無效：充血糜爛面無變化或增加，白色條紋無變化或增加，自覺癥狀明顯，疼痛無減輕或加重。

總有效率(%)=(顯效+有效)/總例數(shù)×100%

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 標(biāo)本采集及處理

80名治療組患者及空白對照組志愿者，分別于清晨空腹使用紅色空白采血管采集外周靜脈血約5 ml，高速冷凍離心，轉(zhuǎn)速3000 r/min、溫度4℃。離心時間為10 min，取上層血清，移液槍分裝貯存于-80℃超低溫冰箱。

1.6.2 Th1、Th2型細(xì)胞因子檢測

使用免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法對兩組研究對象外周靜脈血中Th1細(xì)胞因子TNF-α、IL-2和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-6的表達情況進行檢測。嚴(yán)格按照TNF-α、IL-2和IL-4、IL-6試劑盒(BD，美國)說明書中的實驗步驟進行操作，測定外周血清中TNF-α、IL-2和IL-4、IL-6的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS19.0軟件對得到的數(shù)據(jù)進行分析處理，各組外周血中TNF-α、IL-2和IL-4、IL-6含量檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間比較使用t檢驗，計數(shù)資料使用卡方檢驗；P<0.05，P<0.01為差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效評價

治療組40例OLP患者口服清蘚飲8周后，僅有4例患者癥狀變化不著，其余36例均有不同程度改善。其中顯效28例(70%)，有效8例(20%)，總有效率為90%。

2.2 外周血中TNF-α、IL-2和IL-4、IL-6的表達水平比較

患者治療前外周血中TNF-α、IL-4、IL-6表達水平明顯高于正常對照(P<0.01)，IL-2表達水平與正常對照組相較，變化不著(P>0.05)；治療后TNF-α、IL-4、IL-6較治療前有明顯下降(P<0.01)，IL-2較治療前變化不著(P>0.05)，與正常對照組比較無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者外周血中Th1型細(xì)胞因子TNF-α、IL-2和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6的表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，☆P<0.01，※P>0.05；與本組治療前比較，#P<0.01，△P>0.05。

3 討論

OLP發(fā)病病因不明確，治療過程中反復(fù)發(fā)作遷延難愈的特點，很多相關(guān)研究認(rèn)為該病歸屬于自身免疫性疾病[10-11]。OLP病損黏膜局部上皮不全角化，基底細(xì)胞液化變性，固有層密集淋巴細(xì)胞帶狀浸潤的病理變化是一個細(xì)胞免疫介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程[12]。在細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中，細(xì)胞因子的產(chǎn)生和遷移對淋巴細(xì)胞吸附、浸潤、分化、滯留具有重要的調(diào)節(jié)作用。

TNF-α是一種促炎性細(xì)胞因子，能促進 Th 細(xì)胞向Th1 細(xì)胞分化，其過量釋放可能會引起T 淋巴細(xì)胞的趨化聚集在上皮細(xì)胞固有層引起上皮損傷及萎縮[13]。Khan等[14]研究發(fā)現(xiàn),OLP患者固有層內(nèi)淋巴細(xì)胞TNF-α表達較正常人明顯增強，Rhodus等[15-16]通過對OLP患者唾液及病損組織濾液中TNF-α水平的檢測，發(fā)現(xiàn)在這些體液中TNF-α的表達水平較正常人群高。Khan等[17]發(fā)現(xiàn),OLP病損黏膜上皮內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞表達TNF-α，說明OLP患者全身TNF-α的變化可能與OLP的發(fā)病具有相關(guān)性。本研究中OLP患者治療前血清中TNF-α表達水平顯著高于正常對照組，在服用中藥復(fù)方清蘚飲治療后TNF-α水平降低，研究結(jié)果提示TNF-α可以作為OLP的診斷及評價藥物療效的一個有效指標(biāo)。

一旦有外來抗原集聚于口腔黏膜局部或者自身組織抗原在某些因素作用下發(fā)生異常變化。這些異動信息即會被黏膜上皮內(nèi)的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞提呈給T細(xì)胞并使其活化，被活化的CD4+T細(xì)胞增殖活化為Th0細(xì)胞，Th0細(xì)胞進而分化為Th1和Th2細(xì)胞亞群。其中Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2升高又可促進CD4+T細(xì)胞、Th1的活化、分化和增殖。IL-2可激活Th1分泌IL-2，二者升高均可，放大T細(xì)胞活性誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[18]。Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫可以在Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子INF-γ的參與下激活巨噬細(xì)胞，促進溶酶體與吞噬體融合，合成釋放各種抗菌肽和蛋白酶。活化后的巨噬細(xì)胞釋放的IL-12，有可促進Th1的分化；促使INF-γ和IL-2同時增加，進而可以促進CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成CTL；活化中性粒細(xì)胞，促進其殺傷靶細(xì)胞或抗原。同時IL-2能誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖，增強NK細(xì)胞的生物活性，提高單核巨噬胞產(chǎn)生更多的致炎細(xì)胞起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[19]。本研究的結(jié)果表明,OLP組患者血清中IL-2的含量較正常組變化不著(P>0.05)。

IL-4、IL-6均為由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IL-4可促進T，B淋巴細(xì)胞的發(fā)育、活化體液免疫和抗體。同時IL-4又可促進Th2細(xì)胞的活化，抑制Th1細(xì)胞增殖及其免疫應(yīng)答[20]。IL-6可刺激T細(xì)胞增殖參與炎癥反應(yīng)。盧銳等研究發(fā)現(xiàn)[21],OLP局部病損的角質(zhì)形成細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)IL-6陽性表達，病損局部的單核細(xì)胞較OLP患者PBMC分泌更多的IL-6，提示IL-6可能在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、上皮增生過程中發(fā)揮重要作用。本研究使用ELISA法檢測血清中的IL-4、IL-6水平，結(jié)果顯示OLP患者治療前組均明顯高于正常對照組，且OLP治療前后IL-4、IL-6水平變化也非常明顯。同時以TNF-α/IL-4比值為代表的Th1/Th2在OLP患者治療前和正常空白對照組也有明顯的下調(diào)，并且服用清蘚飲治療后Th1/Th2的比值有所回調(diào)。

正常狀態(tài)下，Th1/Th2處于相對平衡狀態(tài)時，T 細(xì)胞亞群之間保持一種動態(tài)平衡，機體的免疫效應(yīng)和免疫抑制處保持精細(xì)而復(fù)雜的平衡狀態(tài)。一旦Th1/Th2的平衡被擾動，比值發(fā)生變化即會出現(xiàn)細(xì)胞免疫亢進或者體液免疫亢進。Th1細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。Th2細(xì)胞和細(xì)胞因子亞群功能變化主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)體液免疫[22]。本研究中，在OLP 患者治療前血清Th1型細(xì)胞因子TNF-α表達升高，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6也顯著升高，提示在OLP 患者發(fā)病過程中Th1、Th2細(xì)胞均有參與OLP 的病理變化。而治療前，由于TNF-α/IL-4比值下調(diào)，說明OLP患者外周血中免疫平衡向Th2偏移，屬于Th2呈現(xiàn)優(yōu)勢的免疫應(yīng)答[23]。由此可推測OL 患者外周血中體液免疫亢進，所形成的免疫復(fù)合物引發(fā)了口腔的局部病損。病損黏膜的沉積物刺激局部上皮細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)Th1淋巴細(xì)胞活化，引起病損處細(xì)胞免疫功能亢進，出現(xiàn)固有層淋巴細(xì)胞帶狀浸潤、基底細(xì)胞空泡液化。

清蘚飲由白蘚皮、皂角刺、白芍、僵蠶、連翹等中藥組成，組方中白蘚皮苦寒，清熱、祛風(fēng)解毒為治癬要藥；皂角刺消腫排膿；僵蠶祛風(fēng)止痙、軟堅散結(jié)、溫行血脈；連翹清熱解毒、消癰散結(jié)；百合安心、益志、清心安神。諸藥相合共奏通絡(luò)、散結(jié)、祛邪、逐瘀的功效[24]。本研究結(jié)果提示，OLP患者服用“清蘚飲”治療后，病損局部白色角化條紋(斑塊)的質(zhì)地、厚度、面積等癥狀和體征均明顯改善，黏膜糜爛面及充血發(fā)紅點消失。因此提示“清蘚飲”的作用機制可能在于改變了患者體內(nèi)Thl/Th2 漂移趨勢。但清蘚飲方劑降低TNF-α、IL-4、IL-6等細(xì)胞因子水平的作用機制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其作用的靶細(xì)胞有待進一步研究探討。

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《中醫(yī)藥信息》2016年版中國科技期刊引證報告(核心版)

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(No.81403441)；黑龍江省博士后資助項目(No.LBH-Z11016)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?；痦椖?No.201010)

楊續(xù)艷(1979-)，女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)博士后科研流動站在站博士后。

劉樹民*(1963-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向:中藥藥性理論研究。

2016-07-31

R285.6

A

1002-2406(2016)06-0045-04

修回日期：2016-08-10