馬金,張艷

(1.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院,遼寧 沈陽 110101；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032)

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益氣活血復(fù)方聯(lián)合運動訓(xùn)練對慢性心衰大鼠GAP-43基因及蛋白表達的影響

馬金1,張艷2

(1.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院,遼寧 沈陽 110101；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032)

目的：觀察益氣活血復(fù)方聯(lián)合運動訓(xùn)練對慢性心衰左室重構(gòu)模型大鼠心肌組織中GAP-43 mRNA及蛋白差異表達，探討益氣活血復(fù)方聯(lián)合運動訓(xùn)練減輕慢性心衰大鼠左室重構(gòu)的機制。方法：選取普通級健康SD雄性大鼠，以冠脈結(jié)扎法配合力竭式游泳、減食等方法復(fù)制慢性心衰大鼠模型，隨機將造模成功大鼠分為心衰模型組、益氣活血中藥組、運動訓(xùn)練組、益氣活血復(fù)方聯(lián)合運動訓(xùn)練組、西藥組、西藥聯(lián)合運動訓(xùn)練組及假手術(shù)組，每組10只。分別給予藥物治療和(或)運動訓(xùn)練，治療6周后處死取材。采用HE染色、光鏡下觀察各組大鼠心肌細胞的形態(tài)學(xué)變化；采用RT-PCR及Western-blot技術(shù)分別測定各組大鼠心肌組織中GAP-43基因及蛋白表達變化。結(jié)果：心衰模型組GAP-43 mRNA及蛋白表達均明顯升高，與假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物和(或)運動訓(xùn)練干預(yù)后，與心衰模型組相比，各治療組均明顯下降(P<0.05)，但中藥聯(lián)合運動組效果最明顯，運動組則最差，中藥組與西藥組效果基本相同。結(jié)論：益氣活血復(fù)方聯(lián)合運動訓(xùn)練降低模型大鼠心肌組織中GAP-43蛋白及基因表達，通過抑制缺血心肌神經(jīng)元的代償和修復(fù)機制從而減輕心室重構(gòu)，這將為CHF的治療方法的進一步探討提供實驗依據(jù)。

益氣活血復(fù)方；運動訓(xùn)練；慢性心衰；生長相關(guān)蛋白-43

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure，CHF)是一種由于任何原因引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化,導(dǎo)致心室充盈與射血障礙而引起的臨床綜合征[1]。其發(fā)病機制較為復(fù)雜，隨著研究的不斷深入，大多數(shù)學(xué)者普遍認為心室重構(gòu)是其基本發(fā)病機制，并證實了多種神經(jīng)內(nèi)分泌因子參與了心室重構(gòu)的過程[2-4]。GAP-43(Growth Associated Protein-43，GAP-43)作為一種軸突膜神經(jīng)特異性蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)細胞外生長及突觸發(fā)育形成和神經(jīng)細胞再生等過程，很有可能也參與心室重構(gòu)。因此，本課題組針對CHF心室重構(gòu)發(fā)病機制，選用益氣活血復(fù)方聯(lián)合運動訓(xùn)練作為治療手段，從CHF模型大鼠心肌組織中GAP-43基因及蛋白的差異表達來進一步探討益氣活血復(fù)方聯(lián)合運動訓(xùn)練減輕慢性心衰大鼠左室重構(gòu)的機制，為CHF的治療及康復(fù)提供科學(xué)依據(jù)和有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料

益氣活血復(fù)方(黃芪、人參、紅花、丹參、益母草、三七粉、葶藶子)，按照相對密度為1.05～1.08進行煎煮、濃縮成湯液。賴諾普利片(上海信誼萬象藥業(yè)股份提供，每片10 mg，國藥準字：H10960265)。以上所有藥物均購自于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科。

1.2 方法

1.2.1 慢性心衰大鼠模型塑造

3月齡健康SD大鼠(普通級)70只，雄性，體質(zhì)量200～230 g，購買于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采用冠脈結(jié)扎，配合力竭式游泳、減食等方法復(fù)制CHF大鼠模型。大鼠腹腔麻醉，經(jīng)喉氣管插管術(shù)連接小動物呼吸機，頻率50～55次/min，潮氣量0.6～0.9 ml，描記正常心電圖(圖1)。行開胸手術(shù)，于左冠狀動脈前降支起源點1～5 mm處用結(jié)扎左冠狀動脈主干，心電示波器顯示ST段及T波有明顯異常改變(圖2)，縫合并處青霉素鈉敷傷口，康復(fù)后將其飼料減半，同時每天游泳至其疲乏，每日1次，4周后多普勒超聲心動圖檢測(圖3、圖4)，以左室射血分數(shù)小于60%作為心衰模型成功的標志,同時大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，精神萎靡，毛色無光澤等表現(xiàn)，列入觀察對象。

圖1 大鼠行冠脈結(jié)扎術(shù)前心電圖

圖2 大鼠行冠脈結(jié)扎術(shù)后心電圖

圖4 4周后造模成功大鼠超聲心動圖

將造模成功的60只大鼠，隨機分成6組，每組10只，分別為：心衰模型組、益氣活血中藥組、運動訓(xùn)練組、益氣活血中藥聯(lián)合運動訓(xùn)練組、西藥組、西藥聯(lián)合運動訓(xùn)練組，余下10只大鼠為假手術(shù)組。除心衰模型組、假手術(shù)組予常規(guī)等容積生理鹽水灌胃外，其余各組于造模成功后給予藥物治療。各給藥組大鼠運動訓(xùn)練于造模成功后1周進行。每次50 min，6周超聲心動圖檢測后，麻醉處死，摘取心臟組織-80℃保存待測。

1.2.2 HE染色，光鏡下觀察心肌形態(tài)學(xué)變化

將制備好的標本在10%福爾馬林中固定；梯度酒精脫水；中性樹膠封固，加蓋玻片封固后，在顯微鏡下觀察。

1.2.3 RT-PCR法檢測大鼠心肌組織中GAP-43 mRNA表達

參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA；紫外光分光光度計測定并計算總RNA濃度和純度；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；反轉(zhuǎn)錄后以cDNA 為模板進行PCR擴增。GAP-43引物為：上游5′-AGGAAAGGAGAGAAGGCAGG-3′，下游為:5′-GCAGGAGAGACAGGGTTCAG-3′,擴增長度為778 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列為：上游5'-GCAAGTTCAACGGCACA-3'下游5'-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3'，擴增長度為201 bp。擴增條件為：95℃，5 min→95℃，45 s；60℃，34 s；95℃，45 s(35個循環(huán))→60℃，1 min。然后按照取上述產(chǎn)物4 μl 與上樣緩沖液1 μl混勻，進行5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V， 45 min后取下凝膠，Gel-Pro AnalyzerVersion3.0軟件進行結(jié)果分析。

1.2.4 Western-blot法檢測各組大鼠心肌組織中GAP-43蛋白表達

蛋白裂解液提取大鼠心肌組織中GAP-43的總蛋白；96孔酶標板法對蛋白定量，繪制標準曲線，并計算待測樣品濃度及上樣量；根據(jù)分離蛋白質(zhì)的分子量，室溫下配制凝膠；待聚合后，電壓150 V下行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離；采用半干式轉(zhuǎn)膜法進行蛋白轉(zhuǎn)移；1∶1000稀釋一抗，1∶2000稀釋二抗；ECL法在暗室中進行X光膠片曝光；凝膠成像分析、記錄蛋白電泳帶灰度值，并進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌細胞的形態(tài)學(xué)變化

經(jīng)HE染色后，在40倍光鏡下觀察各組大鼠心肌細胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列規(guī)整，橫紋清晰，大小、形態(tài)正常，肌纖維未見空白、斷裂及缺損區(qū)；心衰模型組則見心肌細胞相互交織，核固縮，出現(xiàn)部分空白區(qū)，異染色質(zhì)呈現(xiàn)團塊狀，相鄰細胞閏盤間隙明顯增寬，粒粒連接及緊密連接消失，肌原纖維排列紊亂、斷裂及缺失；經(jīng)中藥、運動及西藥干預(yù)各組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)均呈心肌細胞排列比較有序，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致，肌纖維排列較規(guī)整，有部分斷裂及缺損，偶有空白區(qū)等情況，但以中藥聯(lián)合運動組大鼠心肌細胞組織形態(tài)基本正常(見圖5)。

圖5 HE染色各組慢性心衰大鼠心肌組織形態(tài)特征

2.2 RT-PCR法檢測各組大鼠心肌組織中GAP-43 mRNA表達情況

在Marker DL 778 bp處和201 bp處分別為GAP-43和GAPDH的擴增帶。取兩者的比值為基因表達量。結(jié)果顯示,心衰模型組GAP-43 mRNA表達明顯升高，與假手術(shù)組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物和(或)運動訓(xùn)練干預(yù)后各治療組GAP-43 mRNA明顯下降，與心衰模型組相比，均有顯著性差異(P<0.05)，但中藥聯(lián)合運動組效果最明顯，運動組則最差，中藥組與西藥組效果基本相同(見表1、圖6)。

表1 各組大鼠心肌組織中GAP-43 mRNA表達水平

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖6 各組大鼠心肌中GAP-43 mRNA表達凝膠示意圖注：1.心衰模型組；2.假手術(shù)組；3.中藥組；4.中藥配合運動組；5.西藥組運動組；6.西藥配合運動組；7.運動組。

2.3 Western-blot法檢測各組大鼠心肌組織中GAP-43蛋白表達情況

與假手術(shù)組對比，心衰模型組GAP-43蛋白表達明顯升高(P<0.05)；經(jīng)藥物和(或)運動訓(xùn)練干預(yù)后各治療組GAP-43蛋白表達量明顯下降，但均未達到正常水平，與心衰模型組相比，均有顯著性差異(P<0.05)，但中藥聯(lián)合運動組效果最明顯，運動組則最差，中藥組與西藥組效果基本相同。見表2、圖7。

表2 各組大鼠心肌組織中GAP-43蛋白表達水平

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖7 各組大鼠心肌組織中GAP-43蛋白表達示意圖

3 討論

慢性心衰(CHF)作為臨床多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，因其致殘率高，死亡率高，治療棘手，對于CHF病理機制的研究及有效治療方法的探求，一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界長期探討的熱點問題之一[5-10]。隨著對心衰發(fā)病機制認識的深入，發(fā)現(xiàn)心室重構(gòu)是心衰發(fā)生的基本機制，并認識到心衰的惡化是由于多種神經(jīng)內(nèi)分泌因子參與了心室重構(gòu)的過程。心衰時，機體激活內(nèi)源性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)而改變血流動力學(xué)異常，并直接作用于心肌細胞，而心臟作為交感神經(jīng)的“司令部”，通過釋放去甲腎上腺素到突觸間隙中，通過再攝取對心臟發(fā)揮正性變時、變力、變傳到作用[11]。在壓力超負荷狀態(tài)下，機體將平衡減少NE存儲量，誘導(dǎo)心臟交感神經(jīng)密度增高，活性失調(diào)，對心臟功能降低代償反應(yīng)；另一方面，TH表達增多，心肌纖維化并伴隨Ⅰ,Ⅲ型膠原高釋放且排列紊亂。由此，臨床上對于心衰的治療模式也從傳統(tǒng)的“強心、利尿、擴血管”的模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤白铚窠?jīng)體液因子和細胞因子的激活”，并不斷研發(fā)和改良了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、AngⅡ受體阻滯劑等抑制和延緩心室重構(gòu)藥物，臨床療效顯著。

而GAP-43作為一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，其主要調(diào)控著生長錐的形成、附著、延伸和抵抗回縮，是軸突生長及調(diào)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，它在組織中存在量的多少直接決定該部分神經(jīng)發(fā)育、軸突再生、突觸重建等生物活動的發(fā)生，在國際上，已將其做為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)等神經(jīng)可塑性的首選分子探針[12-13]。近年來，隨著研究的深入，大量文獻證實心肌在缺氧缺血狀態(tài)下， GAP-43 的異常表達將增加心肌交感神經(jīng)的分布和密度而致使心肌細胞及組織重塑[14]。本課題組根據(jù)中醫(yī)“虛則補之”理論，選用人參與黃芪的經(jīng)典益氣溫陽配伍，合理搭配藥物，自成益氣活血復(fù)方，并應(yīng)用于臨床治療，療效顯著。同時對該方藥進行了大量的動物實驗與臨床療效觀察，研究結(jié)果均顯示其既可以強心、利尿、擴血管以治標，又可以抑制神經(jīng)內(nèi)分泌過度激活，減少心室重構(gòu)以治本，能降低大鼠血漿及局部的PRA(腎素活性)、AngⅡ水平，以抑制RAS的激活；能改善心衰大鼠的癥狀和心肌細胞變化，能降低TXB2(血栓素B2)，PAI-I、TGF-β水平等，為防治CHF提供了有力的科學(xué)依據(jù)[15]。

由此，筆者大膽推測，GAP-43很有可能是參與并調(diào)控心室重構(gòu)的關(guān)鍵蛋白。并在益氣活血復(fù)方基礎(chǔ)上配合運動訓(xùn)練對多個實驗組進行對比觀察，采用HE染色、RT-PCR及Western-blot實驗手段，從組織、基因和蛋白水平共同觀察益氣活血復(fù)方聯(lián)合運動訓(xùn)練對慢性心衰心室重構(gòu)的干預(yù)作用及其與GAP-43的關(guān)系機制，為慢性心衰的機制研究及慢性心衰的康復(fù)治療提供科學(xué)依據(jù)和有效方法。

[1] Thorn T,Haase N,Rosamond W,et al.Heart disease and stroke statistics-2006 update：a report from tlle American Heart Association StatisticsCommittee and Stroke Statistics Subcommittee[J].Circulation,2006,113(85):151-158.

[2] Lee AP,Ice R, Blessey R,et al.Long term effects of physical training on coronary patients with impaired ventricular function[J].Circulation,1979,60(7):1519-1526．

[3] Ries C, Petrides PE. Cytokine regulation of matrix metalloproteinases activity and is regulatory dysfunction in disease[J].Biol Chem,1995,376:345-355.

[4] Cottone S,Nardi E,Mule G,et al．Associaton between biomarkers of intim ation and left ventricular hypertrophy in moderate chronic kidney disease[J].Clin Nephrol,2007,64(4):109-112．

[5] 程丹,程曉昱.益氣溫陽活血利水法治療慢性心力衰竭的研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(1):111-113.

[6] 唐洪波，雷夢覺.強心湯治療慢性心力衰竭臨床研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2015,43(6):62-65.

[7] Jiang ZS,Jeyaraman M,Wen GB.High but not Low-molecular weight FGF-2 causes eordiae hypertrophy in vivo；possible involvement of cardiotrophin-1[J].MOL Cell Carid,2007,42(1):222-233．

[8] 全振華，艾民，金娟,等.芪藶強心膠囊對慢性心衰的治療作用及機制的研究進展[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2016,44(2):108-110.

[9] 郭美珠，嚴驊，黃國毅,等.嚴世蕓教授治療慢性心力衰竭的Logistic回歸分析[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2014,42(4):42-44.

[10] 蔡鎮(zhèn).中藥人參煎劑對慢性心力衰竭患者心功能及血漿腦鈉肽水平的影響[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(1):56-59.

[11] Freed DH,Cunnington RH,Dangedield AL,et al.Emerging evidence for the role of eardiotmphin in cardiac repair in the infracted heart[J].Cardiovasc Res,2005,65(4):782-792．

[12] Dixon IMC,Ju H,Reid NL,et al.Cardiac collagen remodeling in the cardiamyopathic Syrian hamster and the effect ot losartan[J].Mol Cell Cardio,1997,29:1837-1850.

[13] 顧水明,吳宗貴,魏盟.大鼠急性心肌梗死后心室重構(gòu)進展中基質(zhì)金屬蛋白酶活性的變化[J].上海醫(yī)學(xué),2004,27(9):670-673.

[14] 張艷,楊碩,龐敏,等.益氣活血復(fù)方對慢性心衰大鼠心肌組織AngⅡ及PKC的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(11):999-1001.

[15] 陳國偉.藥物治療慢性心力衰竭的若干進展[J].新醫(yī)學(xué),2007,27(11):704-708.

遼寧省教育廳基金資助項目(No.L2012498)

馬金(1976-)，女，副教授，博士，主要研究方向：康復(fù)醫(yī)學(xué)。

2016-01-12

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0035-04

修回日期：2016-02-10