葛鵬玲，張宇馳，韓東衛(wèi)，郭文超

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

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花旗澤仁對胰島素抵抗大鼠胸主動脈血管張力、血清一氧化氮含量以及骨骼肌胰島素受體mRNA基因表達的影響

葛鵬玲，張宇馳，韓東衛(wèi)，郭文超*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察花旗澤仁對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠胸主動脈血管張力、一氧化氮(NO)含量以及大鼠骨骼肌組織中胰島素受體(INSR)mRNA基因表達的影響，探討花旗澤仁改善2型糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷及其抗2型糖尿病胰島素抵抗作用的分子機制。方法：用連續(xù)灌胃脂肪乳配合雙次腹腔注射鏈脲佐菌素的方法復(fù)制2 型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型。將造模成功大鼠隨機分為模型對照組、花旗澤仁組和陽性對照組?；ㄆ鞚扇式M灌胃給予花旗澤仁中藥煎煮液，陽性對照組灌胃給予羅格列酮藥液，模型對照組和空白對照組灌胃給予相應(yīng)體積的蒸餾水。灌胃4周后，檢測空腹血糖(FBG)及空腹血清胰島素(FINS)，并計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)；采用離體血管灌流法檢測大鼠主動脈內(nèi)皮舒張力反應(yīng)，用硝酸還原酶法檢測血清NO含量，同時取各組大鼠骨骼肌組織，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測胰島素受體(INSR)mRNA基因表達水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組大鼠的空腹血糖(FBG)及空腹胰島素(FINS)水平顯著升高(P<0.001)，血管張力明顯降低(P<0.01)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)、NO含量以及胰島素受體mRNA基因表達水平顯著下調(diào)(P<0.001)；與模型對照組比較，花旗澤仁組的FBG及FINS水平顯著降低(P<0.001)，ISI、血管張力明顯上升(P<0.01)，NO含量及INSR mRNA基因表達水平顯著上調(diào)(P<0.001)；同時與模型對照組比較，陽性對照組大鼠FBG及FINS水平顯著降低(P<0.001)，ISI、血管張力上升(P<0.05)，NO含量顯著升高(P<0.001)，INSR mRNA基因表達水平明顯上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論：花旗澤仁可改善2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血管張力，其機制可能與上調(diào)活性因子NO含量有關(guān)；同時花旗澤仁能促進2型糖尿病胰島素抵抗大鼠骨骼肌組織胰島素受體(INSR)mRNA基因表達水平的上調(diào)，這可能是其降血糖并改善組織胰島素敏感性的作用機制之一。

花旗澤仁；2型糖尿病；胰島素抵抗；血管張力；胰島素受體(INSR)

2型糖尿病是嚴重危害人類健康的重大疾病之一[1]。心腦血管疾病是2型糖尿病患者死亡的主要原因，而血管病變發(fā)生的前提是血管內(nèi)皮功能損傷[2-3]。血液中的一系列生物分子和細胞因子調(diào)控失衡從而產(chǎn)生各種血管并發(fā)癥。一氧化氮(NO)是血管內(nèi)皮細胞行使其正常生理功能的重要信息分子，具有舒張血管的功能，血液中NO含量降低可能造成血管收縮舒張功能障礙[4-5]。本研究通過觀察大鼠血管張力收縮幅度及NO含量變化，探討花旗澤仁對2型糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷的保護作用。

骨骼肌對人體內(nèi)的糖脂代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用，同時也是胰島素作用的主要靶器官之一。胰島素與胰島素受體(INSR)結(jié)合后，并與胰島素受體底物-2(IRS-2)結(jié)合，形成信號蛋白復(fù)合物，以介導(dǎo)胰島素信號的傳導(dǎo)[6]。近年來在2型糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，胰島素受體(INSR)數(shù)量減少可形成胰島素抵抗[7]。在前期研究工作的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測大鼠骨骼肌中胰島素受體(INSR)mRNA基因的表達，為花旗澤仁抗2型糖尿病胰島素抵抗的分子機制提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康Wistar大鼠30只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(黑)2013-004。分籠飼養(yǎng)，房間溫度(20±2) °C，相對濕度50%左右，自由攝食、飲水，適應(yīng)喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物

花旗澤仁復(fù)方(西洋參、澤瀉和薏苡仁，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局)；鏈脲佐菌素STZ(BIOSHARP公司，批號S0130)；丙硫氧嘧啶(精華制藥集團股份有限公司，國藥準字H32020795，批號31131202)；馬來酸羅格列酮(天津葛蘭素史克有限公司，國藥準字H20020475，批號10025102)；諾和靈R生物合成人胰島素(丹麥諾和諾德公司，國藥準字J20070043，批號BVG0363)；谷氨酸鈉(中國惠世生化試劑有限公司，批號20131127)。

1.3 主要試劑

羅康全活力型血糖試紙(德國羅氏診斷有限公司)；ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；一氧化氮(NO)測試盒(南京建成生物工程研究所)；Krebs-Henseleit緩沖液(北京中科邁晨科技有限公司)；TRIzol Reagen(Invitroge公司)；DEPC焦炭酸二乙酯(Amresco公司)；AccuPower RocketScript RT PreMix、AccuPower GreenStar qPCR PreMix(Bioneer公司)；RNase-free water (去離子水加入0.01%的DEPC，Sigma公司)；引物設(shè)計使用Primer 5.0軟件(蘇州金唯智生物科技有限公司合成)；無水乙醇、氯仿、異丙醇(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)。

1.4 儀器

Infinite M200 Pro多功能酶標儀(瑞士帝肯)；生物機能實驗系統(tǒng)BL-420S(成都泰盟科技)；Mircro 17R型號微量臺式低溫離心機(Thermo公司)；UV-2550紫外分光光度計(日本島津有限公司)；S1000型號Bio-RAD梯度單頭PCR儀、CFX96型號Bio-RAD Real-time PCR儀(美國伯樂公司)。

1.5 造模與分組

在艾靜和魏偉等[8-9]建立2型糖尿病胰島素抵抗模型基礎(chǔ)上加以改進，復(fù)制2型糖尿病胰島素抵抗模型。將Wistar大鼠隨機分為模型對照組(24只)和空白對照組(6只)，模型對照組大鼠灌胃脂肪乳10 ml/(kg·d)，連續(xù)灌胃20天后，禁食12 h，水正常給予，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)40 mg/(kg·d)，連續(xù)注射2天，每次腹腔注射STZ 15 min后，給大鼠腹腔注射胰島素0.4 U，并于2.5 h和5 h后分別灌胃給予25 %葡萄糖10 ml/kg。最后一次注射STZ 72 h后，空腹血糖值≥ 16.7 mmol/L，且胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitivity Index，ISI)與空白對照組比較具有顯著差異的大鼠作為胰島素抵抗模型大鼠。

取建模成功大鼠24只隨機分成三組，即模型對照組(6只)、花旗澤仁組(6只)和陽性對照組(6只)。

1.6 給藥

花旗澤仁組按5.4 g/kg劑量灌胃給藥；陽性對照組按0.4 mg/kg劑量灌胃給藥；空白對照組和模型對照組給予等體積蒸餾水10 ml/kg，共灌胃4周。

1.7 取材

4周后，各組大鼠眼眶靜脈叢取血，滴于血糖儀上，檢測空腹血糖(FBG)。然后腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)進行麻醉，腹主動脈取血，血液靜置30 min后，4℃ 3000 rpm離心15 min，吸取上清液，-80℃保存待測；迅速分離胸主動脈，小心剔去結(jié)締組織后制成長2.5～3.0 mm動脈環(huán)，立即投入預(yù)冷的營養(yǎng)液(Krebs-Henseleit緩沖液)中待測，并持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣體；最后分離大鼠左右兩側(cè)股四頭肌，用PBS緩沖液洗去血跡，并剔除明顯的結(jié)締組織、污染物等，將骨骼肌組織放入凍存管，液氮凍存待測。

1.8 空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及胰島素敏感指數(shù)(ISI)檢測

采用血糖儀檢測FBG。取適量血清，按胰島素放射免疫分析試劑盒說明書方法進行操作，檢測FINS。用李光偉法[10]計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。

ISI=ln[1/(FBG×FINS)]

1.9 血管張力及一氧化氮(NO)含量的檢測

將血管環(huán)懸掛于持續(xù)通有95% O2+5% CO2混合氣體且37 °C恒溫的麥氏槽中，連接張力傳感器，將血管張力變化用生物信號定量記錄分析系統(tǒng)對實驗數(shù)據(jù)進行分析。調(diào)整靜息張力為1.0 g，平衡60 min。加入KCl 溶液(使浴槽中終濃度為30 mmol/L)預(yù)刺激2次。血管條張力平衡后，于浴槽中加入濃度為5×10-8mol/L的去甲腎上腺素，記錄血管張力G1。待動脈環(huán)收縮達峰值后，加入濃度分別為1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-6mol/L和1×10-5mol/L的乙酰膽堿誘導(dǎo)血管舒張。觀察血管的舒張反應(yīng)，達到穩(wěn)定濃度記錄血管環(huán)張力G2，計算血管環(huán)收縮幅度(G2/G1×100%)。

根據(jù)一氧化氮(NO)試劑盒說明書操作方法，采用硝酸還原酶法檢測各組血清一氧化氮(NO)含量。

1.10 胰島素受體(INSR)mRNA實時熒光定量PCR檢測

解凍后，將骨骼肌組織用研缽研磨至粉末狀。取50 mg骨骼肌組織粉末移入預(yù)冷的1.5 ml離心管中，采用TRIzol方法提取后，用AccuPower RocketScript RT PreMix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在配套的PCR反應(yīng)管中加入樣本溶液以及相應(yīng)的試劑，將溶液混合并按30℃ 5 min，60℃ 60 min，95℃ 5 min和4℃ 5 min的條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進行PCR的擴增，cDNA樣本2.0 μl，2×Greenstar Master Mix 12.5 μl，引物F-primer(內(nèi)參β-actin F 10 pM)、引物R-primer(內(nèi)參β-actin R 10 pM)各1.0 μl，DEPC溶液 8.5 μl共25.0 μl。將溶液混合并按95℃ 10 min，95℃ 10 s和47℃ 30 s條件進行PCR反應(yīng)，40個循環(huán)周期。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 花旗澤仁對大鼠體質(zhì)量、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及胰島素敏感指數(shù)(ISI)的影響

如表2、圖1所示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠體質(zhì)量減少，具有顯著差異(P<0.01)；與模型對照組比較，花旗澤仁組及陽性對照組大鼠體質(zhì)量升高，但不具有顯著性差異(P>0.05)。

如表2、圖2、圖3和圖4所示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠血糖(FBG)和胰島素(FINS)水平明顯升高，胰島素敏感指數(shù)(ISI)顯著降低(P<0.001)；與模型對照組比較，花旗澤仁組和陽性對照組的空腹血糖(FBG)和空腹胰島素(FINS)水平明顯下降，胰島素敏感指數(shù)(ISI)顯著升高(P<0.001)。

表2 花旗澤仁對各組大鼠體質(zhì)量、空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數(shù)的影響

注：與空白對照組比較，△△△P<0.001，△△P<0.01；與模型對照組比較，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

圖1 花旗澤仁對大鼠體質(zhì)量的影響

圖2 花旗澤仁對大鼠空腹血糖(FBG)的影響

圖3 花旗澤仁對大鼠空腹胰島素(FINS)的影響

圖4 花旗澤仁對大鼠胰島素敏感指數(shù)(ISI)的影響

2.2 花旗澤仁對大鼠血管內(nèi)皮功能的影響

離體血管環(huán)收縮功能結(jié)果如表3顯示，與正常對照組比較，模型對照組血管張力顯著降低(P<0.001)；與模型對照組相比，隨著乙酰膽堿濃度升高，花旗澤仁組及陽性對照組血管張力明顯升高，且顯著性越來越明顯。

表3 花旗澤仁對大鼠血管收縮幅度的影響

注：與正常對照組比較，△△△P<0.001；與模型對照組比較，***P<0.001，*P<0.05。

表4 花旗澤仁對大鼠NO含量的影響

注：與正常對照組比較，△△△P<0.001；與模型對照組比較，***P<0.001。

血清一氧化氮(NO)含量實驗結(jié)果如表4顯示，與正常對照組比較，模型對照組一氧化氮(NO)含量顯著降低(P<0.001)；與模型對照組相比，花旗澤仁組及陽性對照組NO含量顯著升高(P<0.001)，且趨于正常對照組。

2.3 花旗澤仁對胰島素受體(InSR)mRNA基因表達水平的影響

研究結(jié)果如表5所示，在骨骼肌組織中，與空白對照組比較，模型對照組胰島素受體(INSR)mRNA表達水平顯著下調(diào)(P<0.001)；與模型對照組比較，花旗澤仁組及陽性對照組INSR mRNA的表達水平顯著上調(diào)(P<0.001，P<0.01)。

表5 花旗澤仁對胰島素受體(InSR)mRNA

注：與正常對照組比較，△△△P<0.001；與模型對照組比較，***P<0.001，**P<0.01。

3 討論

在2型糖尿病早期內(nèi)皮功能紊亂現(xiàn)象就可發(fā)生，他既是2型糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的前兆，也是其產(chǎn)生的主要病理基礎(chǔ)[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病時乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能嚴重受損[12-13]。乙酰膽堿引起的血管內(nèi)皮依賴性舒張主要由一氧化氮(NO)等活性因子調(diào)節(jié)，其中NO是最主要的內(nèi)皮依賴性舒張因子，其作用是舒張血管。血液中NO水平顯著下降也可以作為血管內(nèi)皮細胞損傷的標志物之一[14]。血液中NO含量減少或生物活性降低是導(dǎo)致胸主動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能損傷、內(nèi)皮功能障礙和血管并發(fā)癥的主要原因之一。本研究中，與正常大鼠對比，脂肪乳聯(lián)合雙次腹腔注射鏈脲佐菌素的方法復(fù)制的2 型糖尿病胰島素抵抗大鼠血管張力顯著下降，血清NO含量明顯降低，提示2型糖尿病胰島素抵抗大鼠可能存在內(nèi)皮功能損傷現(xiàn)象。在給予花旗澤仁干預(yù)4周后，花旗澤仁組大鼠NO含量明顯上升，血管張力顯著升高。但有關(guān)花旗澤仁改善內(nèi)皮功能障礙的機制尚需進行更深入的探討。

2型糖尿病的主要特征是存在胰島素抵抗及胰腺β細胞分泌功能異常[15]，其原因與胰島素和胰島素受體結(jié)合后信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)所引起的一系列代謝過程有關(guān)[16-20]。胰島素受體(INSR)是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵分子[21-22]。胰島素信號通路中關(guān)鍵分子表達降低、磷酸化水平下降等都可引起胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。從而導(dǎo)致胰島素抵抗，繼而引發(fā)2型糖尿病[23]?，F(xiàn)已有大量研究表明，胰島素受體功能改變與2型糖尿病胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[24]?；ㄆ鞚扇示哂薪档涂崭寡?，提高胰島素敏感性，抗氧化應(yīng)激，改善胰島素抵抗等作用[25-26]。通過本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病胰島素抵抗大鼠INSR的mRNA基因表達水平較正常對照組顯著降低，花旗澤仁組INSR的mRNA基因表達水平較模型對照組顯著增高，表明花旗澤仁有上調(diào)2型糖尿病胰島素抵抗大鼠INSR mRNA基因表達水平的作用。提示花旗澤仁對2型糖尿病胰島素抵抗的改善作用可能通過胰島素受體，改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，從而提高胰島素敏感性。

[1] Tripathy D,Mohanty P,Dhindsa S,et al. Elevation of free fatty acids induces inflammation and impairs vascular reactivity in healthy subjects[J].Diabetes,2003,52(12):2882-2887.

[2] Morcos M1, Sayed AA, Bierhaus A, et al. Activation of tubular epithelial cells in diabetic nephropathy[J].Diabetes, 2002, 51(12): 3532-3544.

[3] Calles-Escandon J, Cipolla M. Diabetes and endothelial dysfunction: a clinical perspective[J]. Endocr Rev,2001,22(1):36-52.

[4] Kaneto H,Nakatani Y,Kawamori D,et al.Role of oxidative stress，endoplasmic reticulum stress ，and c-Jun Nterminal kinase in pan-creatic beta-cell dysfunction and insulin resistance[J]. Int J Bio-chem Cell Biol,2005,37:1595-1598．

[5] Reed MJ, Meszaros K, Entes LJ, et al. A new rat model of type 2 diabetes: the fat-fed, streptozotocin-treated rat[J].Metabolism,2000,49:1390-1394．

[6] 于東,趙立娜,郝麗萍,等.長期酒精攝入引起大鼠胰島素抵抗及其分子機制[J].營養(yǎng)學(xué)報,2008,30(6):584-587.

[7] 彭定瓊,郭曉蕙,陳宇,等.胰島素受體底物2在2型糖尿病大鼠肌肉、脂肪、肝臟中的蛋白表達及其意義[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2006,7(5):405-407.

[8] Jing Ai, Ning Wang, Mei Yang, et al. Development of Wistar rat model of insulin resistance[J].World J Gastroenterol,2005,11(24):3675-3679.

[9] 魏偉,吳希美,李元建.藥理實驗方法學(xué)[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010：1698.

[10] 李光偉,潘孝仁.檢測人群胰島素敏感性的一項新指數(shù)[J].中華內(nèi)科雜志,1993,32(10):656-660.

[11] King GL,Shiba T,Oliver J,et al.Cellular and molecular abnormalities in the vascular endothelium of diabetes mellitus[J]. Annu RevMed,1994,45:179.

[12] Fu GS, Huang H, Chen F, et al. Carvedilol ameliorates endothelial dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats [J]. Eur J Pharmacol, 2007,567(3):223-30.

[13] Tawfik HE,El-Remessy AB,Matragoon S,et al.Simvastatin improves diabetes-induced coronary endothelial dysfunction [J].J Pharmacol Exp Ther,2006, 319(1): 386-395.

[14] Vanhoutte PM,Shimokawa H,Tang EH,et al.Endothelial dysfunction and vascular disease [J]. Acta Physiol (Oxf),2009,196(2):193-222.

[15] Kahn BB.Type 2 diabetes：when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance[J].Cell,1998,92:593-596.

[16] 李士穎,朱鐵虹.肝胰島素抵抗的研究進展[J].中國慢性病預(yù)防與控制,2008，16(2):206-208.

[17] 葛鵬玲,李慶云,旺健偉,等.花旗澤仁對胰島素抵抗大鼠脂代謝的影響[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(5):87-89.

[18] 張敏霞，王昊泉，胡竹元，等.補腎益氣活血法對老年2型糖尿病頸動脈硬化和內(nèi)皮功能的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2014,42(5):138-140.

[19] 王亞威，王鑑威.養(yǎng)陰健脾湯對胰島素抵抗的2型糖尿病患者的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2016,44(2):87-88.

[20] 任巖海，劉洪鳳，韓智學(xué).桑葉多糖對2型糖尿病大鼠血糖血脂的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2013,41(1):20-21.

[21] Kyuichi K, Keisuke S, Itsuko F, et al. Prenylated chalcone 4-hydroxyderricin and xanthoangelol stimulate glucose uptake in skeletal muscle cells by inducing GLUT4 translocation[J].Nutr Food Res,2011,55:467-475.

[22] 董培良,韓華,舒尊鵬,等.復(fù)方靈芝降糖膠囊對2 型糖尿病大鼠骨骼肌GluT-4及脂肪組織胰島素受體mRNA基因表達的影響[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(3):123-125.

[23] Isa NM, Abdelwahab SI, Mohan S, et al. In vitro anti-inflammatory, cytotoxic and antioxidant activities of boesenbergin A, a chalcone isolated from Boesenbergia rotunda (L.) (fingerroot)[J].Braz J Med Biol Res,2012,45:524-530.

[24] 馬建，姚秀明，趙娜,等.祛胰抵方對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠PI-3K的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2013,41(5):50-53.

[25] 葛鵬玲,劉萍,馬育軒,等.花旗澤仁對胰島素抵抗大鼠胰島素敏感性的影響[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(6):99-101.

[26] 葛鵬玲,趙靜,闞玉娜,等.花旗澤仁對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠氧化應(yīng)激的影響[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(5):1-4

國家科技重大專項(No.2012ZX09103201-018)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81273650)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃”項目(No.2012RCD19)；黑龍江省博士后落地科研啟動金項目(No.LBH-Q15136)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項目(No.201515)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目(No.yjscx2016016)

葛鵬玲(1974-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥防治2型糖尿病的現(xiàn)代藥理學(xué)研究。

郭文超*(1988-)，女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生在讀，主要研究方向：中藥防治2型糖尿病的現(xiàn)代藥理學(xué)研究。

2016-05-12

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0023-05

修回日期：2016-06-10