翟文姬，代洪緒，陳會君

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

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蘇木乙酸乙酯提取物對急性病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

翟文姬1，代洪緒2，陳會君3*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：觀察蘇木乙酸乙酯提取物對CVB3小鼠心肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)Bc1-2、Bax蛋白表達的影響，探討蘇木乙酸乙酯提取物在急性病毒性心肌炎的作用機制。方法：50只雄性 Balb/c小鼠隨機分為3組：空白組10只，蘇木乙酸乙酯提取物組(蘇木組)20只，模型對照組(模型組)20只。模型組、蘇木組每只小鼠腹腔注射1×TCID50為10-7CVB3Nancy 標(biāo)準(zhǔn)株病毒液0.3 ml，建立VMC小鼠模型，連續(xù)給藥14天，第14天無菌摘取心臟，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。采用HE染色觀察心肌病理變化、TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡及免疫組化法檢測心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax的蛋白表達。結(jié)果：與空白組比較，模型組、蘇木組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，蘇木組心肌組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少，具有顯著性差異(P<0.05)。Bcl-2蛋白在空白組呈高表達，模型組呈低表達，蘇木組較模型組明顯增強，呈中表達。Bax蛋白在空白組呈低表達，模型組呈高表達，蘇木組較模型組明顯減弱，呈中表達。結(jié)論：蘇木乙酸乙酯提取物能夠上調(diào)Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，抑制心肌組織的細(xì)胞凋亡, 這可能是蘇木治療病毒性心肌炎的作用機制之一。

病毒性心肌炎；CVB3；蘇木乙酸乙酯提取物；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是指因嗜心肌性病毒感染引起的，以心肌非特異性間質(zhì)性炎癥為主要病變的心肌炎[1-3]。在病毒性心肌炎的發(fā)病過程中,病毒感染通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達的細(xì)胞表面分子、病毒自身基因的表達、病毒介導(dǎo)釋放的各種炎性因子、心肌細(xì)胞損傷后釋放的自身抗體、自身免疫后出現(xiàn)的免疫細(xì)胞表達的細(xì)胞表面分子,激活宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)基因啟動導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，Bcl-2、Bax是細(xì)胞凋亡過程中的一類重要的調(diào)節(jié)蛋白，促凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)及促凋亡蛋白Bax表達增加，是其受到外因刺激后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制。本研究通過觀察蘇木乙酸乙酯提取物對急性病毒性心肌炎小鼠的心肌病理變化、心肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)Bc1-2、Bax蛋白表達的影響，探討蘇木乙酸乙酯提取物在急性病毒性心肌炎的作用機制，為研究蘇木對病毒性心肌炎的治療作用奠定理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

4周齡近交系純種健康雄性Balb/c小鼠50只，體質(zhì)量14～16 g，(長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證號為SCXX吉2011-0004)飼養(yǎng)在恒溫(25±3)℃、恒濕(50±5)%的動物實驗室內(nèi)。

1.2 主要儀器

電子分析天平(瑞士Mettler公司)； 低溫高速離心機(日本日立公司)；烤片機(中國天津愛華公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；電子恒溫水浴鍋(上海森信儀器公司)。

1.3 主要試劑

多聚甲醛(北京化學(xué)試劑廠)；羧甲基纖維素鈉(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色劑(北京中杉生物工程技術(shù)有限公司)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche)。

1.4 藥物

1.4.1 柯薩奇病毒B3(CVB3)Nancy標(biāo)準(zhǔn)株

由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病原微生物實驗室提供。在 Hela 細(xì)胞上傳代，反復(fù)凍融 3次，并測得半數(shù)組織感染率(TCID50) 為10-7，-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 蘇木乙酸乙酯提取物

蘇木，產(chǎn)地云南，購自黑龍江省藥材公司，經(jīng)生藥鑒定符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。將蘇木原材置于75%乙醇溶液浸泡4 h,加熱至85℃，回流提取2 h，過濾提取液；重復(fù)上述流程2次，混勻濾液，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿中，內(nèi)浴蒸干后真空干燥箱烘干，干燥后打碎成粉，即蘇木乙醇提取干粉。將蘇木乙醇提取干粉置入雙蒸水內(nèi)混懸后，用乙酸乙酯反復(fù)萃取，再放入真空干燥箱干燥，粉碎機打碎，得到蘇木乙酸乙酯提取物。將蘇木乙酸乙酯提取物溶于5%羧甲基纖維素鈉溶液中，制備成濃度為1030 mg/kg(82.4 mg/ml)的蘇木乙酸乙酯溶液。

2 實驗方法

2.1 動物分組

將50只雄性Balb/c小鼠隨機分為3組：空白對照組(空白組)10只，蘇木乙酸乙酯提取物組(蘇木組)20只，模型對照組(模型組)20只。

2.2 模型建立及給藥方法

將Balb/C 小鼠50只，自由飲水進食，飼養(yǎng)于動物實驗室內(nèi)進行造模；將小鼠用手固定，腹部朝上，頭部略低于尾部，腹壁常規(guī)碘酒、酒精消毒后，右手持注射器將針頭在下腹部腹白線稍向左的位置，從下腹部朝頭方向幾乎平行地刺入皮膚，針頭到達皮下后，再向前進針3～5 cm，針尖能自由活動則說明刺到皮下。再把針豎起，使注射器與皮膚呈 45℃角斜刺入腹肌，進入腹腔內(nèi)。針尖穿過腹肌進入腹腔后抵抗感消失。固定針頭，回抽針?biāo)?，如無回血或尿液，以一定的速度慢慢注射藥液。模型組、蘇木組小鼠注射1×TCID50為10-7/ml CVB3Nancy 標(biāo)準(zhǔn)株病毒液 0.3 ml，空白組小鼠注射RM 1640稀釋液0.3 ml。注射后觀察小鼠有無腹部痙攣等異常癥狀。

小鼠接種病毒后半小時開始分別給藥：空白組和模型組灌服2%羧甲基纖維素鈉溶液0.2 ml，蘇木組灌服蘇木乙酸乙酯提取物0.2 ml，每日1次，連續(xù)給藥14天。

2.3 標(biāo)本采集

連續(xù)給藥14天后，小鼠處死，用高溫滅菌手術(shù)剪子打開小鼠胸腔取出心臟。沿左室長軸將心臟剪開于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色觀察心肌病理變化、TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡及免疫組化法檢測心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)

二甲苯脫蠟；梯度乙醇水化；水沖洗；水化后的切片浸入蘇木精染液中染色；1%鹽酸乙醇溶液分化；弱堿性水溶液顯藍；0.5%伊紅染色；梯度乙醇逐級脫水；中性樹膠封片。

2.4.2 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡

心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片、TUNEL法染色，檢測凋亡心肌細(xì)胞。參照TUNEL試劑盒說明書操作。

結(jié)果判定：切片中心肌細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)藍色顆粒者為陰性細(xì)胞。在400高倍視野下，每張切片計數(shù)5個高倍視野，分別計算每個視野細(xì)胞核數(shù)及凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)，取均值，計算凋亡指數(shù)(AI)。

AI(%)=凋亡陽性的細(xì)胞核數(shù)/總計數(shù)的細(xì)胞核×100%

2.4.3 免疫組化法檢測心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax的蛋白表達

二甲苯溶液中脫蠟；梯度酒精脫蠟；用新鮮配制3%過氧化氫孵育室溫；進行熱修復(fù)抗原；加入一抗(兔抗Bcl-2兔多克隆抗體)；加入二抗(兔抗Bax兔多克隆抗體)；DAB顯色；蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。置顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：切片心肌細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。采用Rekzalla半定量分析法計算Bcl-2、Bax蛋白表達。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。各項數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心肌組織的病理形態(tài)

光鏡下顯示：空白組小鼠心肌組織胞漿豐富而紅染,胞核卵圓形,位于細(xì)胞中央，橫紋清晰，間質(zhì)少量血管及結(jié)締組織。

模型組：心肌細(xì)胞局灶性水腫，胞漿疏松、淡染、橫紋不清。有小灶性心肌細(xì)胞變性、壞死、血管充血，局部有炎細(xì)胞浸潤。

與模型組比較，蘇木組心肌損傷程度減輕，具有顯著差異。表現(xiàn)為少數(shù)心肌細(xì)胞水腫、血管充血、極少或無心肌細(xì)胞變性、壞死，局部有少量炎細(xì)胞浸潤。如圖1所示。

圖1 各組小鼠心肌組織的病理形態(tài)

3.2 小鼠心肌細(xì)胞凋亡變化

結(jié)果顯示：空白組見少量凋亡的心肌細(xì)胞；與空白組比較，模型組、蘇木組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，有顯著差異(P<0.05)；與模型組相比較，蘇木組心肌組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少，具有顯著差異(P<0.05)(見表1)。凋亡的細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈淡藍色。凋亡的心肌細(xì)胞多出現(xiàn)在炎癥灶周圍，還見到浸潤的淋巴細(xì)胞凋亡。如圖2所示。

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡變化

組別n觀察視野數(shù)凋亡細(xì)胞指數(shù)空白組1051．13±2．65模型組20517．60±4．73▲蘇木組2057．54±2．16▲△

注：與空白組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3.3 小鼠心肌組織Bcl-2和Bax的蛋白表達

小鼠心肌組織中，Bcl-2蛋白陽性顆粒呈棕黃色，主要表達于胞漿、胞核及核膜上，陽性染色細(xì)胞多分布于炎癥周圍的心肌細(xì)胞、少數(shù)浸潤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈灶狀或散在分布，壞死的心肌細(xì)胞不表達。如圖3所示。

圖3 各組小鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達

Bax蛋白陽性顆粒呈棕黃色，主要表達于胞漿內(nèi)，陽性染色細(xì)胞多分布于炎癥周圍的心肌細(xì)胞、少數(shù)浸潤細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞。如圖4所示。

圖4 各組小鼠心肌組織Bax蛋白表達

結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白在空白組呈高表達(+++)，模型組中呈低表達(-～+)，蘇木組較模型組明顯增強，呈中表達(+～++)。Bax蛋白在空白組呈低表達(-～+)，模型組中呈高表達(+++)，蘇木組較模型組明顯減弱，呈中表達(+～++)。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)[7]，在VMC急性期，隨著病毒的大量復(fù)制，T細(xì)胞作為主要的炎性浸潤細(xì)胞被激活，變?yōu)榧?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL ) ，CTL被激活后胞漿顆粒被釋放，穿孔素可插入靶細(xì)胞的胞漿膜，聚合形成聚合物，在靶細(xì)胞膜上形成不同孔徑的跨膜通道，顆粒酶等其他效應(yīng)分子可通過跨膜孔道進入靶細(xì)胞，激活內(nèi)切酶系統(tǒng)，引起靶細(xì)胞凋亡。病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還可能通過病毒自身基因的表達激活宿主細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因，引起細(xì)胞凋亡。從本實驗得出的結(jié)果來看，空白組小鼠心肌細(xì)胞見少量凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)。與空白組小鼠比較，模型組、蘇木組小鼠心肌組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯升高(P<0.05)，尤其模型組感染CVB3小鼠發(fā)生細(xì)胞凋亡的心肌細(xì)胞增多最明顯，說明機體在感染CVB3病毒時，通過細(xì)胞發(fā)生凋亡對心肌組織造成了病理損害，提示在急性病毒性心肌炎發(fā)病過程中，發(fā)生明顯的心肌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。蘇木組與模型組比較，心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)，提示蘇木乙酸乙酯提取物能夠抑制感染CVB3小鼠心肌組織中細(xì)胞的凋亡，減輕心肌病理損傷。由此推斷其機制可能為：蘇木乙酸乙酯提取物可能通過抑制T細(xì)胞的活化和增殖來實現(xiàn)其免疫抑制作用，從而抑制病毒感染后細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡還受凋亡相關(guān)癌基因調(diào)控，其中Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因。Bcl-2家族包含抑制和促進細(xì)胞凋亡兩類功能相反的蛋白質(zhì),主要為Bcl-2蛋白和Bax蛋白[8]。Bcl-2和Bax占的優(yōu)勢比例決定了細(xì)胞在受到凋亡信號(如病毒)刺激后是否發(fā)生凋亡。 Bcl-2表達占優(yōu)勢時，形成同源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡； Bax表達占優(yōu)勢時，形成異源二聚體，不僅可以拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，還可以形成Bax同源二聚體，導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。若抑制Bax基因表達，上調(diào) Bcl-2/Bax的比值，能夠抑制細(xì)胞的凋亡，促進細(xì)胞的存活。若Bax的表達過量則可抑制Bcl-2的功能而促進細(xì)胞的凋亡。本實驗研究結(jié)果顯示：在空白組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白呈高表達，Bax蛋白呈低表達；與空白組相比較，模型組Bcl-2蛋白表達明顯減弱，呈低表達，Bax蛋白表達明顯增強，呈高表達，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高；與模型組相比較，蘇木組Bcl-2蛋白表達增強， Bax蛋白表達減弱，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高。實驗表明，感染CVB3小鼠的心肌細(xì)胞凋亡中Bcl-2、Bax表達的優(yōu)勢變化起著主要作用，而蘇木乙酸乙酯提取物可以改變心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達的主導(dǎo)優(yōu)勢，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，從而抑制感染CVB3導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。由此推斷蘇木乙酸乙酯提取物抑制感染CVB3小鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用機制可能為：上調(diào)Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，起到抗細(xì)胞凋亡的作用。至于蘇木乙酸乙酯提取物作用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體信號途徑有待于進一步深入的研究。

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國家自然科學(xué)基金項目(No.81102590)；黑龍江省高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計劃(No.1253G054)

翟文姬(1985-),女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2014級中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè)博士研究生。

陳會君*(1978-),女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療心血管疾病的臨床和機制研究。

2016-08-24

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0001-04

修回日期：2016-09-10

中 藥 研 究