翟文姬，代洪緒，陳會(huì)君

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

?

蘇木乙酸乙酯提取物對(duì)急性病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

翟文姬1，代洪緒2，陳會(huì)君3*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：觀(guān)察蘇木乙酸乙酯提取物對(duì)CVB3小鼠心肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)Bc1-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討蘇木乙酸乙酯提取物在急性病毒性心肌炎的作用機(jī)制。方法：50只雄性 Balb/c小鼠隨機(jī)分為3組：空白組10只，蘇木乙酸乙酯提取物組(蘇木組)20只，模型對(duì)照組(模型組)20只。模型組、蘇木組每只小鼠腹腔注射1×TCID50為10-7CVB3Nancy 標(biāo)準(zhǔn)株病毒液0.3 ml，建立VMC小鼠模型，連續(xù)給藥14天，第14天無(wú)菌摘取心臟，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。采用HE染色觀(guān)察心肌病理變化、TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡及免疫組化法檢測(cè)心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果：與空白組比較，模型組、蘇木組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，蘇木組心肌組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少，具有顯著性差異(P<0.05)。Bcl-2蛋白在空白組呈高表達(dá)，模型組呈低表達(dá)，蘇木組較模型組明顯增強(qiáng)，呈中表達(dá)。Bax蛋白在空白組呈低表達(dá)，模型組呈高表達(dá)，蘇木組較模型組明顯減弱，呈中表達(dá)。結(jié)論：蘇木乙酸乙酯提取物能夠上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，抑制心肌組織的細(xì)胞凋亡, 這可能是蘇木治療病毒性心肌炎的作用機(jī)制之一。

病毒性心肌炎；CVB3；蘇木乙酸乙酯提取物；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是指因嗜心肌性病毒感染引起的，以心肌非特異性間質(zhì)性炎癥為主要病變的心肌炎[1-3]。在病毒性心肌炎的發(fā)病過(guò)程中,病毒感染通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面分子、病毒自身基因的表達(dá)、病毒介導(dǎo)釋放的各種炎性因子、心肌細(xì)胞損傷后釋放的自身抗體、自身免疫后出現(xiàn)的免疫細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面分子,激活宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)基因啟動(dòng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，Bcl-2、Bax是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的一類(lèi)重要的調(diào)節(jié)蛋白，促凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)及促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，是其受到外因刺激后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。本研究通過(guò)觀(guān)察蘇木乙酸乙酯提取物對(duì)急性病毒性心肌炎小鼠的心肌病理變化、心肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)Bc1-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討蘇木乙酸乙酯提取物在急性病毒性心肌炎的作用機(jī)制，為研究蘇木對(duì)病毒性心肌炎的治療作用奠定理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

4周齡近交系純種健康雄性Balb/c小鼠50只，體質(zhì)量14～16 g，(長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)為SCXX吉2011-0004)飼養(yǎng)在恒溫(25±3)℃、恒濕(50±5)%的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

1.2 主要儀器

電子分析天平(瑞士Mettler公司)； 低溫高速離心機(jī)(日本日立公司)；烤片機(jī)(中國(guó)天津愛(ài)華公司)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；電子恒溫水浴鍋(上海森信儀器公司)。

1.3 主要試劑

多聚甲醛(北京化學(xué)試劑廠(chǎng))；羧甲基纖維素鈉(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色劑(北京中杉生物工程技術(shù)有限公司)；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche)。

1.4 藥物

1.4.1 柯薩奇病毒B3(CVB3)Nancy標(biāo)準(zhǔn)株

由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室提供。在 Hela 細(xì)胞上傳代，反復(fù)凍融 3次，并測(cè)得半數(shù)組織感染率(TCID50) 為10-7，-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 蘇木乙酸乙酯提取物

蘇木，產(chǎn)地云南，購(gòu)自黑龍江省藥材公司，經(jīng)生藥鑒定符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。將蘇木原材置于75%乙醇溶液浸泡4 h,加熱至85℃，回流提取2 h，過(guò)濾提取液；重復(fù)上述流程2次，混勻?yàn)V液，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿中，內(nèi)浴蒸干后真空干燥箱烘干，干燥后打碎成粉，即蘇木乙醇提取干粉。將蘇木乙醇提取干粉置入雙蒸水內(nèi)混懸后，用乙酸乙酯反復(fù)萃取，再放入真空干燥箱干燥，粉碎機(jī)打碎，得到蘇木乙酸乙酯提取物。將蘇木乙酸乙酯提取物溶于5%羧甲基纖維素鈉溶液中，制備成濃度為1030 mg/kg(82.4 mg/ml)的蘇木乙酸乙酯溶液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

將50只雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組(空白組)10只，蘇木乙酸乙酯提取物組(蘇木組)20只，模型對(duì)照組(模型組)20只。

2.2 模型建立及給藥方法

將Balb/C 小鼠50只，自由飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行造模；將小鼠用手固定，腹部朝上，頭部略低于尾部，腹壁常規(guī)碘酒、酒精消毒后，右手持注射器將針頭在下腹部腹白線(xiàn)稍向左的位置，從下腹部朝頭方向幾乎平行地刺入皮膚，針頭到達(dá)皮下后，再向前進(jìn)針3～5 cm，針尖能自由活動(dòng)則說(shuō)明刺到皮下。再把針豎起，使注射器與皮膚呈 45℃角斜刺入腹肌，進(jìn)入腹腔內(nèi)。針尖穿過(guò)腹肌進(jìn)入腹腔后抵抗感消失。固定針頭，回抽針?biāo)?，如無(wú)回血或尿液，以一定的速度慢慢注射藥液。模型組、蘇木組小鼠注射1×TCID50為10-7/ml CVB3Nancy 標(biāo)準(zhǔn)株病毒液 0.3 ml，空白組小鼠注射RM 1640稀釋液0.3 ml。注射后觀(guān)察小鼠有無(wú)腹部痙攣等異常癥狀。

小鼠接種病毒后半小時(shí)開(kāi)始分別給藥：空白組和模型組灌服2%羧甲基纖維素鈉溶液0.2 ml，蘇木組灌服蘇木乙酸乙酯提取物0.2 ml，每日1次，連續(xù)給藥14天。

2.3 標(biāo)本采集

連續(xù)給藥14天后，小鼠處死，用高溫滅菌手術(shù)剪子打開(kāi)小鼠胸腔取出心臟。沿左室長(zhǎng)軸將心臟剪開(kāi)于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色觀(guān)察心肌病理變化、TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡及免疫組化法檢測(cè)心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1 HE染色觀(guān)察心肌組織病理形態(tài)

二甲苯脫蠟；梯度乙醇水化；水沖洗；水化后的切片浸入蘇木精染液中染色；1%鹽酸乙醇溶液分化；弱堿性水溶液顯藍(lán)；0.5%伊紅染色；梯度乙醇逐級(jí)脫水；中性樹(shù)膠封片。

2.4.2 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片、TUNEL法染色，檢測(cè)凋亡心肌細(xì)胞。參照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

結(jié)果判定：切片中心肌細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色顆粒者為陰性細(xì)胞。在400高倍視野下，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，分別計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞核數(shù)及凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)，取均值，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。

AI(%)=凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞核數(shù)/總計(jì)數(shù)的細(xì)胞核×100%

2.4.3 免疫組化法檢測(cè)心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)

二甲苯溶液中脫蠟；梯度酒精脫蠟；用新鮮配制3%過(guò)氧化氫孵育室溫；進(jìn)行熱修復(fù)抗原；加入一抗(兔抗Bcl-2兔多克隆抗體)；加入二抗(兔抗Bax兔多克隆抗體)；DAB顯色；蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。置顯微鏡下觀(guān)察。結(jié)果判定：切片心肌細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。采用Rekzalla半定量分析法計(jì)算Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各項(xiàng)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心肌組織的病理形態(tài)

光鏡下顯示：空白組小鼠心肌組織胞漿豐富而紅染,胞核卵圓形,位于細(xì)胞中央，橫紋清晰，間質(zhì)少量血管及結(jié)締組織。

模型組：心肌細(xì)胞局灶性水腫，胞漿疏松、淡染、橫紋不清。有小灶性心肌細(xì)胞變性、壞死、血管充血，局部有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

與模型組比較，蘇木組心肌損傷程度減輕，具有顯著差異。表現(xiàn)為少數(shù)心肌細(xì)胞水腫、血管充血、極少或無(wú)心肌細(xì)胞變性、壞死，局部有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。如圖1所示。

圖1 各組小鼠心肌組織的病理形態(tài)

3.2 小鼠心肌細(xì)胞凋亡變化

結(jié)果顯示：空白組見(jiàn)少量凋亡的心肌細(xì)胞；與空白組比較，模型組、蘇木組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，有顯著差異(P<0.05)；與模型組相比較，蘇木組心肌組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少，具有顯著差異(P<0.05)(見(jiàn)表1)。凋亡的細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。凋亡的心肌細(xì)胞多出現(xiàn)在炎癥灶周?chē)?，還見(jiàn)到浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞凋亡。如圖2所示。

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡變化

組別n觀(guān)察視野數(shù)凋亡細(xì)胞指數(shù)空白組1051．13±2．65模型組20517．60±4．73▲蘇木組2057．54±2．16▲△

注：與空白組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3.3 小鼠心肌組織Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)

小鼠心肌組織中，Bcl-2蛋白陽(yáng)性顆粒呈棕黃色，主要表達(dá)于胞漿、胞核及核膜上，陽(yáng)性染色細(xì)胞多分布于炎癥周?chē)男募〖?xì)胞、少數(shù)浸潤(rùn)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈灶狀或散在分布，壞死的心肌細(xì)胞不表達(dá)。如圖3所示。

圖3 各組小鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)

Bax蛋白陽(yáng)性顆粒呈棕黃色，主要表達(dá)于胞漿內(nèi)，陽(yáng)性染色細(xì)胞多分布于炎癥周?chē)男募〖?xì)胞、少數(shù)浸潤(rùn)細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞。如圖4所示。

圖4 各組小鼠心肌組織Bax蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白在空白組呈高表達(dá)(+++)，模型組中呈低表達(dá)(-～+)，蘇木組較模型組明顯增強(qiáng)，呈中表達(dá)(+～++)。Bax蛋白在空白組呈低表達(dá)(-～+)，模型組中呈高表達(dá)(+++)，蘇木組較模型組明顯減弱，呈中表達(dá)(+～++)。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)[7]，在VMC急性期，隨著病毒的大量復(fù)制，T細(xì)胞作為主要的炎性浸潤(rùn)細(xì)胞被激活，變?yōu)榧?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL ) ，CTL被激活后胞漿顆粒被釋放，穿孔素可插入靶細(xì)胞的胞漿膜，聚合形成聚合物，在靶細(xì)胞膜上形成不同孔徑的跨膜通道，顆粒酶等其他效應(yīng)分子可通過(guò)跨膜孔道進(jìn)入靶細(xì)胞，激活內(nèi)切酶系統(tǒng)，引起靶細(xì)胞凋亡。病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還可能通過(guò)病毒自身基因的表達(dá)激活宿主細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因，引起細(xì)胞凋亡。從本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果來(lái)看，空白組小鼠心肌細(xì)胞見(jiàn)少量凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)。與空白組小鼠比較，模型組、蘇木組小鼠心肌組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯升高(P<0.05)，尤其模型組感染CVB3小鼠發(fā)生細(xì)胞凋亡的心肌細(xì)胞增多最明顯，說(shuō)明機(jī)體在感染CVB3病毒時(shí)，通過(guò)細(xì)胞發(fā)生凋亡對(duì)心肌組織造成了病理?yè)p害，提示在急性病毒性心肌炎發(fā)病過(guò)程中，發(fā)生明顯的心肌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。蘇木組與模型組比較，心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)，提示蘇木乙酸乙酯提取物能夠抑制感染CVB3小鼠心肌組織中細(xì)胞的凋亡，減輕心肌病理?yè)p傷。由此推斷其機(jī)制可能為：蘇木乙酸乙酯提取物可能通過(guò)抑制T細(xì)胞的活化和增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)其免疫抑制作用，從而抑制病毒感染后細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡還受凋亡相關(guān)癌基因調(diào)控，其中Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因。Bcl-2家族包含抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩類(lèi)功能相反的蛋白質(zhì),主要為Bcl-2蛋白和Bax蛋白[8]。Bcl-2和Bax占的優(yōu)勢(shì)比例決定了細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)(如病毒)刺激后是否發(fā)生凋亡。 Bcl-2表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)，形成同源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡； Bax表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)，形成異源二聚體，不僅可以拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，還可以形成Bax同源二聚體，導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。若抑制Bax基因表達(dá)，上調(diào) Bcl-2/Bax的比值，能夠抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活。若Bax的表達(dá)過(guò)量則可抑制Bcl-2的功能而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：在空白組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白呈高表達(dá)，Bax蛋白呈低表達(dá)；與空白組相比較，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱，呈低表達(dá)，Bax蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，呈高表達(dá)，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高；與模型組相比較，蘇木組Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)， Bax蛋白表達(dá)減弱，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高。實(shí)驗(yàn)表明，感染CVB3小鼠的心肌細(xì)胞凋亡中Bcl-2、Bax表達(dá)的優(yōu)勢(shì)變化起著主要作用，而蘇木乙酸乙酯提取物可以改變心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，從而抑制感染CVB3導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。由此推斷蘇木乙酸乙酯提取物抑制感染CVB3小鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能為：上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，起到抗細(xì)胞凋亡的作用。至于蘇木乙酸乙酯提取物作用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體信號(hào)途徑有待于進(jìn)一步深入的研究。

[1] 王侖,宋曉東.病毒性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[J].中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志，2001,3(5):264-268.

[2] 劉志平，張晶，陳會(huì)君.蘇木乙酸乙酯提取物對(duì)慢性病毒性心肌炎模型小鼠T細(xì)胞亞群的影響[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(2):22-24.

[3] 郭春風(fēng),周亞濱,陳會(huì)君.病毒性心肌炎的中醫(yī)辨證施治[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(6):109-101.

[4] 楊建飛，張婧懿.蘇木乙酸乙酯提取物對(duì)大鼠慢性排斥移植心臟心肌生長(zhǎng)因子含量的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016,44(4):14-17.

[5] 楊穎，姚鳳禎，于亞娟，等.病毒性心肌炎的中醫(yī)藥治療研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2014,42(4):126-127.

[6] 王彤,劉存志,劉玉珍,等.Bcl-2/Bax基因調(diào)控機(jī)體細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2008,28(8):1658-1660.

[7] 宋曉東,劉哲,辛穎,等.針對(duì)病毒性心肌炎的細(xì)胞凋亡研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006,16(23):2549-2552.

[8] 韓波,馬沛然,韓秀珍,等.Bc1-2和Bax基因產(chǎn)物在小鼠柯薩奇病毒性心肌炎心肌組織中的表達(dá)[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2003,18(7):513-515.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81102590)；黑龍江省高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃(No.1253G054)

翟文姬(1985-),女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專(zhuān)業(yè)博士研究生。

陳會(huì)君*(1978-),女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療心血管疾病的臨床和機(jī)制研究。

2016-08-24

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0001-04

修回日期：2016-09-10

中 藥 研 究