王媛媛　馬飛祥　李鳳英　王怡諾　薛培鳳（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院　呼和浩特　010110）

在線色譜聯(lián)用技術(shù)檢測天然產(chǎn)物抗氧化活性的研究進(jìn)展△

王媛媛馬飛祥李鳳英王怡諾薛培鳳*（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院呼和浩特010110）

大量研究表明自由基損傷與腫瘤、糖尿病、心血管系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，因此快速發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物中抗氧化活性成分對于闡明藥物的作用原理、疾病的發(fā)病機(jī)制和新藥創(chuàng)制具有重要意義。本文主要介紹了HPLC-DPPH法、HPLC-CL法、HPLC-ABTS+法等一系列在線色譜法的原理及其在測定抗氧化能力中的應(yīng)用，闡述了近年來在線色譜在檢測天然產(chǎn)物抗氧化活性方面的研究。

在線色譜 檢測 抗氧化活性

抗氧化劑包括人造抗氧化劑和天然抗氧化劑。20世紀(jì)80年代，鑒于人造抗氧化劑的安全性飽受爭議，人們越來越傾向于開發(fā)使用天然抗氧化劑。草藥、水果和蔬菜中具有抗氧化的天然成分用作食品、化妝品和藥品已成為近年來的研究熱點(diǎn)［1］。因此，尋求一種行之有效的檢測抗氧化活性的方法，對食品、化妝品和藥品抗氧化活性的快速測定等都具有重要的意義。就目前的研究進(jìn)展而言，抗氧化方法主要包括兩大類，即傳統(tǒng)抗氧化檢測方法和在線抗氧化檢測方法。

1　抗氧化活性的傳統(tǒng)檢測方法

傳統(tǒng)的植物天然抗氧化活性成分通常采用先提取、分離、鑒定各種成分后再分別對各成分進(jìn)行抗氧化活性測定［2］。已經(jīng)使用的檢測抗氧化活性的方法，例如DPPH、ABTS、CL等，只能對物質(zhì)總體的抗氧化能力進(jìn)行檢測，不能確定物質(zhì)中何種化合物具有抗氧化能力以及進(jìn)行定量分析，只有在對某種化合物進(jìn)行分離純化后才能測定。傳統(tǒng)的對單一組分的抗氧化劑進(jìn)行提取分離時(shí)易導(dǎo)致化合物抗氧化能力的改變，且操作工藝煩瑣。多年來，以這樣的方法也檢測出了一些抗氧化成分，但這些方法往往難以在分離過程中選定篩選目標(biāo)，顯然效率較低。如下對一些檢測抗氧化活性的傳統(tǒng)方法進(jìn)行簡要概述。

1.1DPPH法：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一種人工合成的、以氮為中心的、穩(wěn)定的自由基。由于DPPH溶液在最適波長517nm處有最大吸收峰，當(dāng)有抗氧化活性成分存在時(shí)，可以與DPPH的孤對電子配對，而使其吸光度降低，其降低的程度與待測物質(zhì)的抗氧化能力成正比，故該法不僅能夠通過吸收度的降低程度評價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力，還能夠進(jìn)行定量分析。但在評價(jià)成分復(fù)雜提取物的抗氧化能力時(shí)，該法最大的不足在于只能檢測出提取物總體的抗氧化能力，無法獲知其中某一單體化合物的抗氧化活性，只有再經(jīng)分離純化才可確定。然而，一些化合物會由于在分離純化過程中的分解作用而導(dǎo)致活性發(fā)生變化，不能很準(zhǔn)確地評價(jià)待測物質(zhì)的抗氧化能力。

1.2ABTS＋·法：ABTS化學(xué)名為2，2'-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），是近年來應(yīng)用頻率較高的一種用于檢測抗氧化活性的還原型無色物質(zhì)。其通過與K2S208、Mn02、ABAP、H202、過硫酸銨作用，導(dǎo)致被氧化成藍(lán)綠色的自由基陽離子ABTS＋·。該法最早由Miller于1993年提出［3］，由于ABTS＋·在734nm處有特征吸收峰，當(dāng)具有供氫能力的抗氧化劑與之反應(yīng)時(shí)，會使其在734nm處的吸光值發(fā)生急劇變化，根據(jù)其變化程度的大小評價(jià)待測物質(zhì)的抗氧化能力。有時(shí)，為了比較多種抗氧化劑的活性，通常會將活性抗氧化物質(zhì)與含trolox（6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸）的標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑分別與ABTS＋·作用，測定結(jié)果以TEAC值作為指標(biāo)，即TEAC為被測抗氧化劑與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑清除ABTS＋·能力的比值，所以ABTS＋·法也被稱為TEAC法。相對于抗氧化能力的體內(nèi)檢測方法，該法具有設(shè)備簡單、經(jīng)費(fèi)消耗少、簡便、迅速等優(yōu)點(diǎn)。但由于ABTS＋·也可能會與任何羥基化的芳香族化合物發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致其專一性差，高估被測物質(zhì)的抗氧化能力。

1.3化學(xué)發(fā)光法：化學(xué)發(fā)光（CL）法的基本原理是發(fā)光試劑能被活性自由基氧化，生成的激發(fā)態(tài)氧化產(chǎn)物會伴隨著能量衰減以發(fā)出光子的形式回到基態(tài)。當(dāng)待測物質(zhì)中含有抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑會清除活性自由基，使原本的發(fā)光強(qiáng)度降低［4］。利用儀器對清除前后吸光值予以檢測，評價(jià)待測物的抗氧化能力。除此之外，該技術(shù)亦可適用于生物體液的抗氧化活性分析［5］，具有靈敏度高、線性范圍寬、分析能力強(qiáng)等特點(diǎn)。

2　抗氧化活性的在線色譜聯(lián)用檢測技術(shù)

近些年來，隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，研究者們建立了各種在線檢測抗氧化活性的色譜聯(lián)用技術(shù)，主要是將各種具有分離功能的色譜技術(shù)與抗氧化篩選技術(shù)相結(jié)合，旨在分離的同時(shí)實(shí)現(xiàn)化合物的在線鑒定與定量分析，消除了傳統(tǒng)方法先分離、再測活的煩瑣過程。此法與離線檢測方法相比具有自動化、穩(wěn)定化、快速化、規(guī)范化等優(yōu)點(diǎn)［6］。以下對近年來各種在線色譜檢測抗氧化活性的原理及應(yīng)用簡單介紹。

2.1結(jié)合DPPH檢測抗氧化活性的方法

2.1.1HPLC-UV-DPPH法：HPLC-DPPH法利用色譜柱對復(fù)雜成分進(jìn)行分離后與DPPH直接相連，選定516nm作為檢測波長，由于具有抗氧化能力的活性物質(zhì)能夠捕獲DPPH的孤對電子而使得原有的峰面積下降甚至表現(xiàn)為倒峰，其倒峰面積與待測物質(zhì)清除DPPH的能力有一定的關(guān)系，該技術(shù)快速、高效、操作簡單，實(shí)現(xiàn)了見“圖”識“效”的作用，不失為一種快速檢測天然產(chǎn)物中抗氧化成分的重要手段。目前，國內(nèi)已有諸多學(xué)者利用該技術(shù)手段對某些天然藥物進(jìn)行抗氧化活性的在線篩選。如王小淞等［7］通過結(jié)合紫外檢測器建立起的HPLC-UV-DPPH法對黃芩根、莖、葉提取物的抗氧化活性進(jìn)行在線檢測；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃芩根、莖、葉部位的提取物均可作為一種很好的抗氧化劑，但所含的抗氧化活性成分及含量有較大差異，故可以此評價(jià)黃芩各有效部位抗氧化能力。柳艷等［8］也利用該技術(shù)對植物中多酚類成分進(jìn)行了抗氧化活性的研究，結(jié)果顯示：HPLC-UVDPPH流動注射在線色譜聯(lián)用技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對多組分植物化學(xué)物抗氧化能力的高通量篩選。邢航等［9］通過此技術(shù)證實(shí)了葡萄酒中也含有多種抗氧化活性物質(zhì)。Shanshan Tong等［10～11］利用該方法以水飛薊素為研究對象進(jìn)行抗氧化活性的在線檢測。Zong-Quan 0u［12］也運(yùn)用該法提取出了苦菜葉中的抗氧化活性物質(zhì)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明該法能夠?qū)崿F(xiàn)對抗氧化活性成分的在線檢測分析，尤其是在比較中藥各有效部位的提取物的抗氧化能力大小方面有很好的應(yīng)用前景。

2.1.2HPLC-DAD-DPPH法：HPLC-DAD-DPPH法是目前檢測天然植物中抗氧化活性成分應(yīng)用較多的聯(lián)用技術(shù)之一。如張作法等［13］采用活性自由基與HPLC-DAD聯(lián)用，首次對桑枝中的主要抗氧化活性成分進(jìn)行測定，并比較其在不同桑枝品種中的含量，為深度開發(fā)桑枝的藥效打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

其他學(xué)者也使用此方法進(jìn)行了相關(guān)性地研究，如王春鵬等［14］，建立HPLC-DAD-DPPH甲醇枸櫞酸在線抗氧化活性指紋圖譜體系，篩選出金銀花抗氧化作用的有效組分及檢測其抗氧化能力的強(qiáng)弱，并基于此對不同產(chǎn)地金銀花進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)論指出此方法簡便可行，基于活性整合指紋圖譜篩選出藥材中的抗氧化活性成分，在全面有效地評價(jià)中藥質(zhì)量的道路上邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。

2.1.3HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH法：王虹等［1］的研究在HPLCDPPH法的基礎(chǔ)上，結(jié)合ESI-T0F/MS進(jìn)行分析，以茶葉提取物為研究對象，建立一種適用于天然產(chǎn)物提取物中抗氧化活性成分快速篩選與鑒定的方法，填補(bǔ)了傳統(tǒng)方法中無法實(shí)現(xiàn)某一單體化合物快速檢測其抗氧化活性的空白。同時(shí)，耿丹丹等［15］在HPLC-DAD-DPPH法的基礎(chǔ)上通過結(jié)合質(zhì)譜檢測器對丹參和康定鼠尾草中的天然抗氧化活性成分進(jìn)行快速篩選，鑒定出其活性化合物的具體結(jié)構(gòu)。

這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明該技術(shù)操作簡便，重復(fù)性好，與傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物中復(fù)雜成分的分離與鑒別模式相比，該聯(lián)用技術(shù)能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜化合物中抗氧化活性成分的鑒定與定量分析，提高了工作效率。

2.2結(jié)合ABTS+·檢測抗氧化活性的方法

2.2.1HPLC-UV-ABTS+·法：在線HPLC-UV-ABTS+·檢測抗氧化活性成分的方法是將高效液相色譜、紫外檢測器與檢測清除自由基的ABTS+·試劑檢測器連接，在高效液相色譜儀分離組分的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對抗氧化活性成分的篩選，提高了檢測效率。高翔等［3］利用HPLC在線檢測消癌平注射液對ABTS+·的清除能力，探究其抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明該中藥制劑中的酚酸類物質(zhì)對ABTS+·有較強(qiáng)的清除作用，能夠?qū)崿F(xiàn)對傳統(tǒng)中藥制劑抗氧化活性組分的快速檢測。耿雪飛［16］和裴世春等［17］也利用該在線色譜法實(shí)現(xiàn)了對細(xì)葉杜香葉中抗氧化活性成分的測定?；诖?，我們認(rèn)為，該在線色譜聯(lián)用技術(shù)能夠一改傳統(tǒng)的篩選方法，有效地提高天然藥物中抗氧化活性物質(zhì)的篩選效率。

2.2.2HPLC-DAD-ABTS+·法：HPLC--DAD-ABTS+·在線檢測法是一種簡便快捷、不需要對復(fù)雜樣品進(jìn)行分離純化的檢測抗氧化活性成分的方法，能夠?qū)?fù)雜混合物中清除自由基的活性成分進(jìn)行分離以及在線測定。王宇卿等［18］學(xué)者就是采用該法完成了對生脈散和益氣復(fù)脈粉針清除ABTS+的活性成分的在線檢測，并比較了兩者體外抗氧化活性成分的含量。

2.3結(jié)合CL檢測抗氧化活性的方法

2.3.1HPLC-UV-CL法：CL與具有高效分離特性的HPLC相連，采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，使之成為一種有效的痕量分析技術(shù)。近年來，HPLC-CL聯(lián)用法發(fā)展迅速，已成功地運(yùn)用于黃酮、多酚、兒茶酚胺、芳香族化合物等的檢測。朱卉等［19］采用該技術(shù)已成功檢測出消癌平注射液中活性組分酚酸類物質(zhì)對H202和0·2-自由基的清除能力，并結(jié)合質(zhì)譜對其活性成分進(jìn)行鑒別。通過以上介紹得出：HPLC-UV-CL在線聯(lián)用技術(shù)使用簡單、高效，可實(shí)現(xiàn)對中藥注射液中抗氧化活性成分的在線篩選。

2.3.2HPLC-DAD-CL法：LI Yi等［20］利用HPLC-DAD-CL在線檢測冠心寧（GXN）注射液的主成分丹參和川芎的抗氧化活性。通過優(yōu)化分析條件，對來自14個(gè)生產(chǎn)批次的冠心寧注射液的15種酚酸的H202抑制速率進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：15種酚酸均具有抗氧化活性且丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸是冠心寧注射液（25.82%～51.19%）抗氧化的最主要活性成分，同時(shí)闡明了該中藥制劑的抗氧化作用機(jī)制及進(jìn)行質(zhì)控分析。與傳統(tǒng)方法相比，此項(xiàng)研究表明HPLC-DAD-CL在線聯(lián)用技術(shù)具有使用簡便、快捷和低成本等優(yōu)點(diǎn)，可用于天然產(chǎn)物中抗氧化活性成分的快速篩選。

2.3.3HPLC-UV-CL法：陳乃東［21］與陳存武［22］等擬從霍山石斛抗氧化活性入手，采用HPLC-UV-CL聯(lián)用法對霍山石斛中總生物堿提取物的抗氧化能力進(jìn)行在線測定以便快速發(fā)現(xiàn)存在于霍山石斛中的抗氧化活性物質(zhì)，為后續(xù)的抗氧化活性物質(zhì)的定向分離、霍山石斛的譜效關(guān)系及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為探討新的中藥質(zhì)量評價(jià)模式提供參考。最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出采用HPLCUV-CL在線測定方法，以校正清除率為評價(jià)指標(biāo)，可從含有結(jié)構(gòu)類似物的中藥中快速發(fā)現(xiàn)抗氧化活性物質(zhì)；然而，對于化學(xué)結(jié)構(gòu)及消光系數(shù)相差較大的組分，峰面積相同的兩個(gè)組分，其代表的物質(zhì)含量相差較大，以峰面積大小代表不同物質(zhì)含量，誤差較大，導(dǎo)致校正抑制率評價(jià)抗氧化活性誤差較大。因此，在測定結(jié)構(gòu)、消光系數(shù)相差較大的化合物抗氧化活性時(shí)具有一定的局限性［21～22］。

2.4CE-MS在線預(yù)濃縮檢測抗氧化活性方法：近幾年，因酚酸類化合物對氧化應(yīng)激能產(chǎn)生防御作用，對其的研究引起了廣泛的關(guān)注。而毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜檢測器聯(lián)用（CE-MS）作為一種有效的可用于分離中性和帶電荷的化合物的分離工具，具有定性分析化合物結(jié)構(gòu)信息的獨(dú)特優(yōu)勢。如學(xué)者王文明［23］等的實(shí)驗(yàn)采用CE-MS在線預(yù)濃縮方法率先對丹參酚酸類化合物中4種親水活性成分進(jìn)行定性定量測定，成功地評價(jià)了其抗氧化能力。

盡管CE-MS在分析領(lǐng)域已獲得廣泛的應(yīng)用，但與HPLCMS相比，CE-MS仍然存在檢測靈敏度偏低的缺陷。因此，建立CE-MS在線預(yù)濃縮技術(shù)，降低檢測限的方法已成為研究重點(diǎn)。目前，已有少數(shù)幾種改進(jìn)CE-MS靈敏度的方法，其中樣品堆積技術(shù)是應(yīng)用最廣泛的一種。近年來的研究證明了在線聯(lián)用HPLC能夠有效地清除自由基活性，但國內(nèi)未見CE-MS測定酚酸類抗氧化活性的方法［23］。

2.5光纖傳感微量樣品羥自由基檢測抗氧化活性方法：羥自由基（·0H）是一種氧化能力很強(qiáng)的活性自由基，可以氧化糖類、脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子，導(dǎo)致它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞。因此，加強(qiáng)對自由基清除的研究勢在必行。古海妮薩·麥合木提［24］等采用Mn2+-H202-EBT方法，通過前期對反應(yīng)體系吸光度的檢測，選定560nm作為最適檢測波長，對新疆葡萄樹傷流液、金銀花茶、羅布麻茶、茉莉茶和竹葉茶進(jìn)行研究。其原理基于類似芬頓（Fenton）反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)，主要方程式為：Mn2++H202→Mn3++·0H+ 0H-，當(dāng)向反應(yīng)體系（Mn2+-EBT）加入H202時(shí)，生成的·0H能夠迅速氧化分解EBT與Mn2+反應(yīng)生成的螯合物，使其560nm處的吸光度迅速下降，從而可間接地檢測出羥自由基（·0H）的產(chǎn)生量。而當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，它會抑制或者延緩螯合物的分解，從而對其待測物質(zhì)的抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)。此法利用光纖作為傳輸通道，具有光信息傳輸損耗低、傳輸量大、不易受外界干擾等特點(diǎn)，并彌補(bǔ)了現(xiàn)在儀器以及傳統(tǒng)方法在測定物質(zhì)抗氧化活性方面的不足且所需樣品量少、可連續(xù)觀察吸光度變化。

3　總結(jié)與展望

近年來建立的快速、高效、多系統(tǒng)聯(lián)用的在線色譜檢測抗氧化活性的方法同以往的方法相比，在技術(shù)上有了很大的創(chuàng)新，能夠在分離的同時(shí)進(jìn)行活性測定，并在不同的藥物、植物或復(fù)方制劑的抗氧化活性檢測中得到驗(yàn)證。但也有不足之處，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究在檢測抗氧化活性方面的試劑僅僅局限于 ABTS、DPPH。未來，我們需要探索出更多的檢測試劑，以便能夠更快、更好地對天然藥物及復(fù)方制劑進(jìn)行檢測。

今后，我們應(yīng)該努力開發(fā)及改進(jìn)現(xiàn)有的在線色譜抗氧化活性檢測方法，建立更快速、直觀的在線抗氧化活性檢測及評價(jià)方法。以便發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物中有效的抗氧化成分，推動中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展。

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1672-8351（2016）09-0123-03

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（2015MS0823）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放基金（2016ZN01）。