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        肺寧顆粒對(duì)AECOPD大鼠肺組織肺保護(hù)作用和血清TLR4 、NF-κB、SOD水平的影響

        2016-12-15 01:06:17祁海燕封繼宏李美鳳鄭兆曄蘇景深李云輝
        陜西中醫(yī) 2016年11期
        關(guān)鍵詞:造模肺泡阻塞性

        祁海燕 封繼宏 李美鳳 鄭兆曄 劉 偉 蘇景深 關(guān) 鵬 李云輝

        天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300073)

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        肺寧顆粒對(duì)AECOPD大鼠肺組織肺保護(hù)作用和血清TLR4 、NF-κB、SOD水平的影響

        祁海燕△封繼宏▲李美鳳▲鄭兆曄▲劉 偉▲蘇景深▲關(guān) 鵬▲李云輝

        天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300073)

        目的:觀察肺寧顆粒對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性期模型大鼠肺組織病理及血清TLR4、NF-κB、SOD水平的影響,初步探索肺寧顆粒在COPD急性期的肺保護(hù)作用機(jī)制。方法:將60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組,組別設(shè)立為空白組、AECOPD模型組、肺寧顆粒低、中、高劑量組、抗生素干預(yù)組,成功建立AECOPD大鼠模型后,各干預(yù)組對(duì)應(yīng)給予藥物治療,共計(jì)1周。治療結(jié)束后觀察肺組織病理,治療第4天和第8天采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清TLR4 、NF-κB、SOD含量。結(jié)果:肺組織病理結(jié)果顯示符合COPD病理性改變;肺寧顆粒各劑量組及抗生素干預(yù)組肺組織病變較前減輕,結(jié)果發(fā)現(xiàn),第4天和第8天,AECOPD模型組大鼠血清中TLR4 、NF-κB水平較空白組升高,SOD水平較空白組降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);AECOPD大鼠各用藥組血清中TLR4 、NF-κB水平較模型組降低,血清中SOD水平較模型組升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。NF-kB表達(dá)水平測定中,肺寧顆粒三個(gè)劑量組第4天和第8天前后比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。TLR4表達(dá)水平測定中,第8天的肺寧顆粒高劑量組與低劑量組之間比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論:肺寧顆粒一定程度上抑制AECOPD中TLR4和NF-κB因子的表達(dá),且肺寧顆粒干預(yù)組SOD活性明顯升高,肺寧顆粒對(duì)感染所致慢性阻塞性肺疾病急性加重模型大鼠肺損傷具有一定的保護(hù)作用。

        慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)是COPD作為常見病和多發(fā)病而引起患者死亡的主要因素,作為一種急性起病的過程,對(duì)患者的生活質(zhì)量、疾病進(jìn)程造成了較為嚴(yán)重的影響。在急性期控制病情進(jìn)展和減少發(fā)病次數(shù)成為了COPD研究中的重點(diǎn)。具有清熱祛痰,鎮(zhèn)咳平喘之效的肺寧顆粒(國藥準(zhǔn)字號(hào)Z22020825,主要成分:返魂草提取物)廣泛應(yīng)用于急、慢性肺內(nèi)感染,本研究探討肺寧顆粒應(yīng)用于AECOPD大鼠模型的肺保護(hù)機(jī)制。

        1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 來源:華阜康生物科技股份有限公司(北京),許可證號(hào):SCXK(京)2009-0004。提供同批次SPF級(jí)Wistar雄性大鼠60只,體重(150±20)g,組別設(shè)立為:空白組、AECOPD模型組、返魂草低、中、高劑量組、抗生素干預(yù)組,每組10只。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫控在18~22℃,濕度50%~60%。實(shí)驗(yàn)于適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始。

        1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 藥品來源:肺寧顆粒(國藥準(zhǔn)字號(hào)Z22020825),規(guī)格:10g/袋。鹽酸莫西沙星片(國藥準(zhǔn)字號(hào)J20100158),規(guī)格:400mg/片。

        1.3 實(shí)驗(yàn)菌種 標(biāo)準(zhǔn)菌株:肺炎鏈球菌(菌株號(hào):ATC49719),來源:天津臨床檢驗(yàn)中心。

        1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 彈性蛋白酶,美國Sigma公司(批號(hào):Lot#SLBD0685v);乙醚,天津市化學(xué)試劑廠(批號(hào):Q/12HG5531-2007);水合氯醛(使用時(shí)配制成10%濃度溶液),天津化學(xué)試劑有限責(zé)任公司(批號(hào):Q/12HB4319-2009)。多聚甲醛,天津化學(xué)試劑廠(批號(hào):Q/12HG4108-2009)。

        1.5AECOPD大鼠模型建立 將王東等人[3]有關(guān)COPD動(dòng)物模型的造模方法予以改進(jìn),通過肺氣腫模型和COPD急性期模型設(shè)計(jì),建立本研究AECOPD大鼠模型如下。

        1.5.1 肺氣腫大鼠模型的建立過程和方法[4]: 首先將大鼠放入密封性能良好的上、下雙層干燥玻璃瓶(直徑為26~30cm)內(nèi)的上層,乙醚溶液置于密封干燥玻璃瓶的下層,隨即開始觀察大鼠活動(dòng)狀態(tài)的變化以及程度。大鼠進(jìn)入麻醉期可由以下具體表現(xiàn)判斷:呼吸變慢,反應(yīng)遲鈍,四肢緊張度降低。等待并判斷大鼠已確定進(jìn)入麻醉期,快速將大鼠自密封玻璃瓶中取出,仰臥固定于操作臺(tái)上(操作臺(tái)預(yù)先設(shè)定好頭高尾低30°位),帶固定過程完成后,使用本課題組自制圈套固定于大鼠上齒,采取適度下壓的手法,等待大鼠口腔基本暴露于視野中,此時(shí)迅速將課題組自制喉鏡片插入,同時(shí)適度上抬會(huì)厭部分,呼吸間待聲門裂完全暴露在觀察視野中,配合等待大鼠呼吸時(shí)聲門開放的一瞬間,迅速將本課題組自制圓鈍頭彎鋼針對(duì)準(zhǔn)聲門部,準(zhǔn)確插入聲門下約 1~1.5cm處,造模組大鼠均勻緩慢注入彈性蛋白酶溶液0.15ml(單位:7.7μ/mg)。空白組按照上述造模方法注入等量生理鹽水0.15ml。待滴注完畢迅速拔出鋼針,隨后將大鼠適度直立搖動(dòng)約15秒,使注入溶液盡可能均勻分布于造模大鼠的兩肺。本造模過程每7天進(jìn)行1次,共計(jì)3次。肺氣腫大鼠模型建立完成之后,第2天起,使用上述操作方法于肺氣腫大鼠氣管內(nèi)滴注肺炎鏈球菌瓊脂懸液,構(gòu)建AECOPD大鼠模型。操作滴入:0.15ml,細(xì)菌濃度:1×1012CFU/mL。肺炎鏈球菌瓊脂懸液攻擊造模1次。

        1.6 給藥方法 自從AECOPD模型建立成功后第2天起,參照等效劑量的方法,計(jì)算各給藥組大鼠的每日灌胃量。設(shè)立如下:空白組:生理鹽水2ml,每日1次,連續(xù)灌胃1周。AECOPD模型組:生理鹽水2ml,每日1次,連續(xù)灌胃1周。肺寧顆粒低劑量組:由肺寧顆粒配制成0.12g/(kg·d)水溶液,每日1次,連續(xù)灌胃1周。肺寧顆粒中劑量組:由肺寧顆粒配制成0.36g/(kg·d)水溶液,1d1次,連續(xù)灌胃1周。肺寧顆粒高劑量組:由肺寧顆粒配制成1.08g/(kg·d)水溶液,1d1次,連續(xù)灌胃1周??股亟M:由鹽酸莫西沙星片配制成40mg/(kg·d)水溶液,1d1次。共計(jì)灌胃1周。

        1.7 觀察方法及觀察指標(biāo) 1.7.1 一般情況:觀察并記錄在整個(gè)模型建立和給藥過程內(nèi),各組大鼠如行動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)光澤度和稀少程度、呼吸節(jié)律的改變、進(jìn)食和飲水量等方面的變化,定期稱重并完整記錄體重信息,并在造模過程結(jié)束后完整記錄各組大鼠死亡情況。

        1.7.2 肺組織肉眼觀察與光鏡下觀察:取材部位選取大鼠右肺組織,首先觀察肺組織外觀,后進(jìn)行常規(guī)的固定、脫水、包埋、切片、HE染色等步驟,待上述步驟完成后于光鏡下觀察取材肺組織病理改變(圖1)。

        1.7.3 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清中NF-κB、TLR4 、SOD的表達(dá)水平。

        2 結(jié) 果

        2.1 一般情況 空白組大鼠呼吸節(jié)律無明顯變化,反應(yīng)靈敏,活潑好動(dòng),飲食水基本正常。造模各組較空白組體型偏瘦,精神差,反應(yīng)遲緩,活動(dòng)量明顯減少,部分大鼠拱背豎毛明顯,呼吸較空白組明顯急促。模型動(dòng)物接種肺炎鏈球菌后死亡1只,其余組至取材未見死亡。

        2.2 肺組織肉眼觀察與光鏡下觀察 見圖1。肉眼觀察:模型組大鼠肺體積較空白組顯示增大趨勢,外觀色澤蒼白,可見肺泡融合形成肺大泡后的凹凸不平表面,肺部彈性明顯減弱,剖胸后肺臟萎縮不明顯,仍保持膨脹狀態(tài),空白對(duì)照組大鼠改變不明顯。

        空白組:肺泡結(jié)構(gòu)完整并排列整齊,肺泡壁增厚不明顯,未見明顯炎細(xì)胞浸潤,黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整。AECOPD模型組:肺泡結(jié)構(gòu)明顯被破壞,肺泡壁變薄和不同程度的斷裂后,融合形成大小不等肺大泡,肺泡周圍可見部分炎性細(xì)胞的浸潤,支氣管上皮細(xì)胞壞死、脫落,少量炎性細(xì)胞浸潤改變侵及肺小血管管壁周圍。肺寧顆粒三個(gè)劑量組:肺泡結(jié)構(gòu)明顯被破壞,肺泡腔部分增大,肺泡壁變薄破壞融合,部分形成肺大泡,程度較模型組為輕。肺泡周圍仍可見少量炎性細(xì)胞浸潤改變,支氣管上皮細(xì)胞脫落程度較模型組減輕,肺寧顆粒三個(gè)劑量組肺泡結(jié)構(gòu)與支氣管破壞程度較模型組均有所減輕??股馗深A(yù)組:可見肺泡結(jié)構(gòu)被破壞程度較模型組為輕,同時(shí)可伴有不同程度肺泡壁變薄、肺泡腔增大,并融合形成少量肺大泡,與模型組相比,肺泡周圍炎性細(xì)胞浸潤較減輕,支氣管上皮細(xì)胞部分脫落、壞死。

        圖1 AECOPD大鼠肺組織病理圖

        2.3 AECOPD大鼠血清ELISA測定TLR4、NF-κB、SOD水平 見表1、表2、表3。

        表1 肺寧顆粒對(duì)AECOPD大鼠血清TLR4表達(dá)水平的影響(ng/ml)

        表2 肺寧顆粒對(duì)AECOPD大鼠血清NF-kB表達(dá)水平的影響(ng/L)

        表3 肺寧顆粒對(duì)AECOPD大鼠血清SOD表達(dá)水平的影響(U/ml)

        結(jié)果發(fā)現(xiàn),第4天和第8天,AECOPD模型組大鼠血清中NF-κB、TLR4 水平較空白組升高,SOD水平較空白組降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);AECOPD大鼠各用藥組血清中TLR4 、NF-κB水平較模型組降低,血清中SOD水平較模型組升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。NF-kB表達(dá)水平測定中,肺寧顆粒三個(gè)劑量組第4天和第8天前后比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。TLR4表達(dá)水平測定中,第8天的肺寧顆粒高劑量組與低劑量組之間比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

        3 討 論 COPD急性加重(AECOPD)是指一種急性起病的過程,常伴有喘息、胸悶,咳嗽加劇、痰量增加、痰液顏色和(或)黏度改變以及發(fā)熱等癥狀,并需要進(jìn)行或調(diào)整藥物治療方案[2]。本研究著重于炎癥學(xué)說與氧化/抗氧化失衡學(xué)說,探討AECOPD大鼠模型應(yīng)用肺寧顆粒后相關(guān)因子的表達(dá)水平變化。

        TLR4介導(dǎo)多種免疫防御反應(yīng),抑制免疫炎癥的發(fā)生發(fā)展,增強(qiáng)氣道組織細(xì)胞的固有免疫功能,并減輕各種內(nèi)外源性病原體對(duì)機(jī)體本身的損害以保護(hù)機(jī)體[5]。在 AECOPD病程中,TLR4 參與炎癥反應(yīng)過程,且它的表達(dá)水平與病情進(jìn)展且與病情嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。NF-κB 作為多功能核轉(zhuǎn)錄因子,是處于機(jī)體抗炎的核心地位的重要一員。當(dāng) COPD患病機(jī)體受到內(nèi)源性和外源性病原體刺激,NF-κB可被迅速激活,并參與氣道炎癥加劇、氣道重構(gòu)等過程,其中氣管和支氣管壁多種炎性細(xì)胞浸潤的亦可參與NF-κB的活化過程。

        肺組織用以保護(hù)自身的途徑,主要靠不同的抗氧化機(jī)制體現(xiàn),故SOD常作為判定機(jī)體氧化應(yīng)激的指標(biāo),氧化/抗氧化失衡學(xué)說常見表現(xiàn)之一為超氧化物歧化酶(SOD)活性下降。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,肺寧顆粒一定程度上抑制AECOPD中TLR4和NF-κB因子的表達(dá),減少COPD中肺組織炎癥細(xì)胞聚集的程度,減輕氣道上皮炎癥反應(yīng)和肺組織炎癥損傷,進(jìn)而保護(hù)肺功能。我們推測肺寧顆粒可能通過抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫的作用使細(xì)菌導(dǎo)致感染造成的的氧化負(fù)荷減輕,減輕自由基對(duì)細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷,同時(shí)通過抗氧化作用抑制TLR4 /NF-κB的激活,導(dǎo)致炎癥因子水平的下調(diào)。

        [1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2013,36(4):255-264.

        [2] 慢性阻塞性肺疾病急性加重( AECOPD) 診治專家組.慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國專家共識(shí)( 草案) [J].中華哮喘雜志(電子版),2013,7(1):1-12.

        [3] 王 東,王 瑛,劉又寧.流感嗜血桿菌致慢性阻塞性肺疾病急性發(fā)作動(dòng)物模型的建立[J].中華老年多器官疾病雜志,2011,10(2):156-160.

        [4] 封繼宏,祁海燕,鄭兆曄,等. 經(jīng)硬式鼻腔鏡氣管內(nèi)滴注化學(xué)制劑建立AECOPD動(dòng)物模型[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,17(11): 68-70.

        [5] Takeda K,Akira S. Toll-like receptors in innate immunity [J]. IntImmunol,2005,17(1):1-14.

        (收稿2016-07-05;修回2016-07-29)

        肺疾病,慢性阻塞性/中醫(yī)藥療法 @肺寧顆粒 大鼠 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

        R

        Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.054

        △陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

        ▲天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(天津 300150)

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