劉丹丹，孫曉帥，王志洪，喬 琴，何飛飛*

(1.云南大學農學院，云南昆明 650091；2.云南三標農林科技有限公司，云南昆明 650302)

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云南小粒速溶咖啡中百菌清提取凈化方法研究

劉丹丹1，孫曉帥1，王志洪2，喬 琴1，何飛飛1*

(1.云南大學農學院，云南昆明 650091；2.云南三標農林科技有限公司，云南昆明 650302)

[目的]探討云南小粒速溶咖啡中百菌清的最佳提取凈化方法。[方法]分別采用石油醚-丙酮萃取法、固相吸附法及二氯甲烷-丙酮萃取法這3種不同的方法提取凈化云南小粒速溶咖啡中的百菌清，并利用高效液相色譜進行加標回收測定，根據回收率的大小和凈化方式的繁簡，確定最適宜的百菌清測定方法。[結果]3種不同方法提取凈化百菌清的加標回收率分別為85.3%、111.4%和118.7%。[結論]通過回收率及凈化方式的比較可知，可利用固相吸附法對云南小粒速溶咖啡中的百菌清進行提取純化。

速溶咖啡；百菌清；提取凈化；方法優(yōu)化

云南咖啡屬阿拉伯原種的變異種，經過長期的栽培馴化，現被稱為“云南小粒種咖啡”。由于云南光照時間長，晝夜溫差大，有利于咖啡養(yǎng)分的積累，因此，云南小粒咖啡的營養(yǎng)成分高于國內外其他咖啡品種，形成了自己的特色。隨著云南咖啡產業(yè)的快速發(fā)展，速溶咖啡占據了很大市場。在咖啡的生產栽培過程中會使用大量的殺菌劑及殺蟲劑，在咖啡豆的加工中也會出現污染。速溶咖啡屬于直接飲用的食品，農藥殘留等成了安全問題中的最大隱患。

農藥殘留主要是由直接施藥引起的，也可以是吸收環(huán)境中的農藥或通過食物鏈富集造成。農藥的理化性質、作物類型、施藥方法、環(huán)境因子都是影響殘留的因素。在同一區(qū)域內施用多種農藥，存在農藥的同系物、異構體、降解產物或代謝產物的影響[1]，農作物通過根莖吸收、傳導等途徑，使農藥進入其組織內部，從而加大了檢測的難度。因此，發(fā)展各種新的分析方法，特別是多種類農藥殘留量的同時分析方法具有重要的意義。目前，對于咖啡的農藥殘留檢測均局限于對咖啡豆的檢測[2]，鮮有關于對速溶咖啡檢測的報道。農業(yè)部NY/T 289—1995在標準中只是規(guī)定了六六六、滴滴涕2種農藥的殘留量及測定方法[3]。

百菌清是非內吸性廣譜殺菌劑，該農藥殘留的測定方法在黃瓜、茶葉及咖啡豆中均有報道[3-4]，檢測方法多為氣相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法、毛細管電泳法等[5-6]。其中，質譜聯用方法靈敏度高，但是價格昂貴，運行成本較高。因此，建立快速、高效、易推廣的檢測方法具有一定的現實意義。筆者通過加標回收使用3種不同的方法對速溶咖啡中的百菌清進行提純凈化，通過比較探討該農藥最適宜的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料 原料：云南產小粒速溶咖啡。主要儀器：高效液相色譜儀(Waters，e2695-2489)，超聲波振蕩儀器，旋轉蒸發(fā)儀。主要試劑：百菌清標準品(99.5%)，購自國家標準物質中心；甲醇、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、檸檬酸氫二鈉、乙腈、氯化鈉、無水硫酸鈉、N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑，均為色譜純，購自阿拉丁試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制。在50 mL容量瓶中，精密稱取百菌清標準品20 mg，加入40 mL二氯甲烷，放入超聲浴中溶解15 min，冷卻至室溫，用二氯甲烷稀釋至刻度，混勻，貯于冰箱中。

1.2.2 色譜條件。檢測器：紫外檢測器；檢測波長：240 nm；色譜柱：Gemini 5 μm，250 mm×4.6 mm；流動相：甲醇-水(75%∶25%)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量10 μL。

1.2.3 樣品前處理及測定。該試驗采用濃度為1.0 mg/L百菌清對云南小粒速溶咖啡進行處理，采用3種不同的方法提取凈化百菌清，并進行高效液相色譜法測定。

1.2.3.1 石油醚-丙酮萃取法(處理①)。稱取1 g速溶咖啡，用37 μm(相當于400目)篩選，置于100 mL 具塞三角瓶中。加入石油醚-丙酮(4∶1)混合溶劑30 mL，超聲提取15 min，過濾后取濾液凈化。吸取試樣提取液2 mL，注入已淋洗過的層析柱中，用石油醚-乙酸乙酯(95∶5)混合溶劑100 mL 洗脫。收集洗脫液于蒸餾瓶中，于旋轉蒸發(fā)儀上濃縮近干，用少量石油醚多次溶解殘渣于刻度離心管中，定容至1.0 mL，在色譜條件下進行分析。

1.2.3.2 固相吸附法(處理②)。稱取1 g速溶咖啡于50 mL具蓋離心管中，精確至0.1 mg，加入10 mL水，振蕩，直至樣品被水充分浸潤，靜止10 min。移取10 mL乙腈和1 mL混合內標工作液到離心管中，于旋渦混合振蕩儀上以2 000 r/min 速度振蕩1 min，分別加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉和5 mL甲苯，立即于旋渦混合振蕩儀上以2 000 r/min 速度振蕩2 min，以防止無水硫酸鎂遇水反應造成局部過熱并結塊，然后以4 000 r/min 離心10 min。移取5 mL樣品提取液上層清液于10 mL離心管中，加入500 mg無水硫酸鎂和150 mg N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑，于旋渦混合振蕩儀上以2 000 r/min 速度振蕩2 min，以6 000 r/min 離心2 min，上機測定。

1.2.3.3 二氯甲烷-丙酮萃取法(處理③)。稱取1 g速溶咖啡，用37 μm(相當于400目)篩選，置于100 mL 具塞三角瓶中。加入30 mL二氯甲烷與丙酮混合液(9∶1)，在超聲浴中提取15 min。提取液過裝有無水硫酸鈉的漏斗，用20 mL二氯甲烷洗滌比色管3次，用100 mL蒸餾瓶收集濾液。30 ℃水浴在旋轉蒸發(fā)器上蒸發(fā)至近5 mL，過弗羅里硅土預柱，用20 mL二氯甲烷分3次洗蒸餾瓶。再用60 mL二氯甲烷分4次洗滌預柱，收集全部預柱流出液于200 mL蒸發(fā)皿中。置于通風櫥內，水浴30 ℃揮發(fā)至近干，用二氯甲烷移于5 mL比色管內，定容，過0.45 μm有機相濾膜，儀器自動進樣檢測。

1.2.4 結果計算。試樣中百菌清的質量分數按下式計算：

W=(A1/A2)×m1/m2×V1/V2

式中，W為試樣中百菌清的質量分數(mg/kg)；A1為被測定試樣各組分的峰值(峰高或面積)；A2為百菌清標準的峰值；m1為百菌清標準溶液的質量(ng)；m2為被測定試樣的取樣量(g)；V1為被測定試樣的稀釋體積(mL)；V2為被測定試樣的進樣體積(μL)。

2 結果與分析

百菌清經3種不同的方法提取、凈化后用高效液相色譜法測定，通過對回收率的測定進行比較，選出百菌清高效液相色譜法測定最適宜的方法。

百菌清標準品的出峰時間為3.749 min，如圖1所示。用1.0 mg/L百菌清處理速溶咖啡后，經高效液相色譜測定其含量，如圖2所示，處理①所測誤差較大，處理②、③結果準確。根據回收率的計算，處理①、②、③的平均回收率分別為85.3%、111.4%、118.7%。

3種提取純化的方法操作復雜，均需經多次純化才能得到合格凈化液，耗時長。其中，處理①為普遍采用的測定方法，但是回收率較低；處理②與處理③的測定方法準確，精密度較高。因此，后2種均可作為測定百草清的方法，比傳統(tǒng)檢測法更能滿足目前的要求。但是，值得注意的是處理③比處理②更為繁瑣，操作過程中誤差較大，因此，建立使用固相吸附法對速溶咖啡中百菌清的提取純化進行萃取。

圖1 百菌清標準品的色譜Fig.1 Chromatography of chlorothalonil standards

圖2 不同處理方法測定速溶咖啡粉中百菌清的含量Fig.2 Chlorothalonil content in instant coffee powder determined by different processing methods

3 結論與討論

據有關數據統(tǒng)計，我國咖啡消費者的數量越來越大，安全問題逐漸成為關注的焦點。咖啡中的農業(yè)殘留主要是在種植過程中使用或從環(huán)境中攝入的，常用的殺蟲及殺菌劑有六六六、滴滴涕、樂果、百菌清、多菌靈、甲基托布津等[3]。這些農藥的種類繁多，性質各異，在食品中的殘留量極低，傳統(tǒng)的分析方法難以保證其檢測精度。目前，測定農藥殘留主要采用離子-氣象色譜-質譜聯用的方法[7]，但是測定費用較高并且針對性較差。隨著現代檢測技術的進步，開發(fā)高效準確的農藥殘留檢測方法，以及制定嚴格的農藥限量標準尤其重要。該研究采用3種不同的方法萃取凈化速溶咖啡中百菌清，并通過高效液相色譜檢測技術對其加標回收率進行了測定，研究了這幾種方法對樣品中農藥多殘留檢測的穩(wěn)定性和適用性，最終確定采用固相吸附法提取純化速溶咖啡中的百菌清效果最好。

[1] 裴志國.吡蟲啉在小麥大田中的殘留規(guī)律及底物固相分散法在農藥殘留分析中的應用[D].天津：南開大學，2003.

[2] 劉春華，樂淵，陽辛風，等.超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定生咖啡豆中多菌靈等農藥殘留[J].廣東農業(yè)科學，2012，39(24)：108-110.

[3] 李維銳，張洪波，李文偉.小粒種咖啡病蟲害防治技術規(guī)程：NY/T 1698—2009[S].北京：中國農業(yè)出版社，2009.

[4] 石鍵，沈在忠.黃瓜中百菌清殘留量的測定：GB/T 5009.105—2003[S].北京：中國標準出版社，2004.[5] 王濤，賀紅武，薛思佳.新穎除草劑研究進展[J].化學世界，2002，43(11)：608-611.

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[7] 邱建偉.茶葉和咖啡中農藥多殘留的檢測方法研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學，2007.

Stndy on Extraction and Purification Method of Chlorothalonil in Yunnan Small Grain Instant Coffee

LIU Dan-dan1, SUN Xiao-shuai1, WANG Zhi-hong2, HE Fei-fei1*et al

(1. School of Agriculture, Yunnan University, Kunming, Yunnan 650091; 2. Yunnan Three Standard of Agriculture and Forestry Science and Technology Co. Ltd., Kunming, Yunnan 650302)

[Objective] The aim was to explore the optimal extraction and purijication method for chlorothalonil in Yunnan small grain instant coffee. [Method] Three different extraction and purification methods (aether petrolei-acetone extraction, solid-phase adsorption and dichloromethane-acetone extraction) were performed to extract chlorothalonil in instant coffee. Then all of the extractions were tested using high performance liquid chromatography(HPLC). The most suitable method was determined according to the percentages of recovery measurement. [Result] The results obtained by three different extraction and purification methods showed that the recovery percentages were 85.3%, 111.4% and 118.7%, respectively. [Conclusions] By comparing recovery rate and purification methods, solid-phase adsorption method was the best one for testing chlorothalonil in Yunnan small grain instant coffee.

Instant coffee; Chlorothalonil; Extraction and purification; Method optimization

云南省建立農科教相結合新型農業(yè)社會化服務體系試點云咖啡產品單元子項目“咖啡產品質量標準研究和檢測平臺”(2014NG004)。

劉丹丹(1985- )，女，山東兗州人，講師，博士，從事園藝作物農藥殘留檢測研究。*通訊作者，副教授，博士，從事咖啡質量檢測研究。

2016-09-12

S 571.2

A

0517-6611(2016)32-0092-02