王帥帥，朱秋勁，2*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

組胺分子印跡聚合物中模板分子制備比例的紫外光譜學(xué)研究

王帥帥1，朱秋勁1，2*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

組胺廣泛存在于各類食物當(dāng)中，在利用組胺分子印跡聚合物傳感器對(duì)組胺進(jìn)行快速檢測(cè)的過(guò)程中，模板分子與功能單體的配比對(duì)于最終合成的印跡聚合物的特異吸附能力影響顯著。組胺和2-（三氟甲基）丙烯酸分別被選作模板分子和功能單體。為探究二者的配比，利用紫外光譜掃描的方法分別檢測(cè)了組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的最大吸收峰，并通過(guò)差式紫外掃描以及對(duì)功能單體不同加入比例的紫外掃描，發(fā)現(xiàn)組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的比例至少為1∶4時(shí)才能形成穩(wěn)定的預(yù)組裝復(fù)合體系，而比例為1∶6時(shí)，最大吸收峰顯著下降且最大吸收峰波長(zhǎng)紅移，整個(gè)體系達(dá)到最穩(wěn)定的狀態(tài)。所得的結(jié)果對(duì)于制備組胺分子印跡聚合物傳感器對(duì)組胺進(jìn)行快速檢測(cè)有著較好的指導(dǎo)性意義。

組胺；分子印跡聚合物；模板分子-功能單體比例；紫外掃描

組胺（histamine，HA）是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種十分常見(jiàn)的生物胺。其廣泛地存在于各類生物體和食物中，尤其是大量存在于腐敗或不新鮮的水產(chǎn)中[1]。實(shí)際上微量的組胺是人體必不可少的，有研究證明，微量的組胺能夠參與人體中的多項(xiàng)生理調(diào)控[2-4]。但如果人體攝入了過(guò)量的組胺就會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的組胺中毒反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生如眩暈、頭疼、呼吸窘迫等癥狀，搶救不及時(shí)甚至?xí)＜吧黐5]。傳統(tǒng)的組胺檢測(cè)手段主要采用的是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜法（gas chromatography，GC）和毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）等方法[6-9]。這些方法雖然經(jīng)過(guò)了大量科研工作者地探索已較為的成熟，但是這些方法不可避免的都存在著諸如需要專業(yè)的大型儀器設(shè)備、對(duì)樣品需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理或者需要有經(jīng)驗(yàn)豐富的科研實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行操作等弊端。而隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，一種名為分子印跡的技術(shù)（molecularly imprinted technique，MIT）被創(chuàng)立出來(lái)[10]，該技術(shù)所制備出的分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）由于擁有高度的特異吸附性、選擇性以及可重復(fù)利用性而受到了眾多科研工作者的關(guān)注。

分子印跡技術(shù)的原理是將某種特定的物質(zhì)當(dāng)作模板分子，也即是待檢測(cè)物質(zhì)，選取某種合適的材料作為功能單體。將模板分子與功能單體放入某種溶劑中并在一定的聚合條件下進(jìn)行聚合，此時(shí)功能單體和模板分子就會(huì)通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的形式形成預(yù)組裝復(fù)合物，再加上引發(fā)劑與交聯(lián)劑的作用就能夠固定住這種預(yù)組裝物的結(jié)構(gòu)而形成一種穩(wěn)定的聚合物。之后將聚合物中的模板分子洗脫出來(lái)，該聚合物就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)特異吸附該種模板分子的空腔，這種具有空腔的聚合物就被稱作是分子印跡聚合物[11]。將分子印跡聚合物與某種傳感器相連接就能夠制備出檢測(cè)該種物質(zhì)的傳感器，通過(guò)傳感器就能直觀、便捷、快速的對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。而分子印跡聚合物所擁有的這種高度特異吸附性主要取決于聚合物中共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的數(shù)目及位置，也體現(xiàn)了模板分子和功能單體比例的重要性。如果功能單體比例過(guò)低，所形成的印跡聚合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，對(duì)模板分子的吸附主要依賴于非特異性吸附，這就會(huì)導(dǎo)致印跡聚合物的特異吸附能力不高，制備出的傳感器則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。而如果功能單體的比例過(guò)高，由于空間位阻作用導(dǎo)致模板分子無(wú)法被洗脫，并且難以出現(xiàn)穩(wěn)定的聚合物構(gòu)象，同樣無(wú)法制備出有效的分子印跡聚合物。故而確定模板分子與功能單體的比例對(duì)于制備出有效的分子印跡聚合物至關(guān)重要。傳統(tǒng)的配比比例探究方法通常采用大量的重復(fù)試驗(yàn)來(lái)對(duì)各個(gè)比例逐一進(jìn)行制備和檢測(cè)，但這樣不僅耗時(shí)耗力，同時(shí)也有著巨大的實(shí)驗(yàn)消耗[12]。

這項(xiàng)研究就是在擬制備組胺分子印跡聚合物對(duì)組胺進(jìn)行快速檢測(cè)的過(guò)程中，為了確定模板分子與功能單體的比例而對(duì)模板分子-功能單體的預(yù)組裝復(fù)合物進(jìn)行紫外光譜學(xué)研究。在功能單體的選擇上，對(duì)于分子印跡聚合物報(bào)道應(yīng)用得最多的功能單體是甲基丙烯酸[13-14]（methacrylic acid，MAA），但制備出來(lái)的印跡聚合物特異選擇性并不都很好。而由于2-（三氟甲基）丙烯酸（2-（trifluoromethyl）acrylic acid，TFMAA）具有較強(qiáng)的吸電子效應(yīng)，能夠更好地形成穩(wěn)定的氫鍵結(jié)構(gòu)[15-16]，并且將2-（三氟甲基）丙烯酸應(yīng)用在組胺分子印跡聚合物的制備上尚未見(jiàn)報(bào)道，所以選取2-（三氟甲基）丙烯酸作為功能單體。

組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。在組胺分子的結(jié)構(gòu)中擁有一個(gè)五元雜環(huán)可產(chǎn)生吸收峰，并且其末端還含有一個(gè)氨基，在這個(gè)氨基上面的孤對(duì)電子可受到紫外的激發(fā)而發(fā)生n→δ*躍遷至反電子軌道上產(chǎn)生吸收峰。而在2-（三氟甲基）丙烯酸中也因?yàn)閾碛幸粋€(gè)碳氧雙鍵作為發(fā)色基團(tuán)可產(chǎn)生吸收峰。

圖1 組胺(A)與2-(三氟甲基)丙烯酸(B)的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of histamine(A)and 2-(trifluoromethyl) acrylic acid(B)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

組胺（純度≥97%）、2-（三氟甲基）丙烯酸（純度98%）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氯仿（分析純）：重慶川東化工有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限責(zé)任公司；SB-100D超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限責(zé)任公司；CP214型電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限責(zé)任公司；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

模板分子及功能單體紫外光譜測(cè)定：首先分別配制6 mmol/L的組胺-氯仿溶液和相同濃度的2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液，之后吸取600 μL的組胺-氯仿溶液至10 mL的容量瓶中，用氯仿溶液精準(zhǔn)定容至10 mL，超聲波混勻15 min后放置在5℃恒溫培養(yǎng)箱中12 h。之后以氯仿溶液作為參比溶液，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)190～400 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描間隔1 nm。2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液也采用相同方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

不同功能單體與模板分子比例形成的預(yù)組裝復(fù)合體系紫外光譜測(cè)定：分別配制6 mmol/L的組胺-氯仿溶液和相同濃度的2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液。于1～10號(hào)10 mL的容量瓶中分別加入600 μL的組胺-氯仿溶液，然后在1～10號(hào)容量瓶中分別加入不同量6 mmol/L的2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液配制出10種不同組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸比例的溶液，比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9和1∶10。用氯仿溶液精準(zhǔn)定容至10 mL，超聲波混勻15 min后放置在5℃恒溫培養(yǎng)箱中12 h。以6 mmol/L的組胺-氯仿溶液作為參比，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)190～400 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描間隔1 nm。

另取6個(gè)10 mL的容量瓶，分別加入600 μL的組胺-氯仿溶液，之后再加入不同量6 mmol/L的2-（三氟甲基）丙烯酸-氯仿溶液分別配制出組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的比例為1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8和1∶10的溶液。使用氯仿溶液準(zhǔn)確定容至10 mL，超聲波混勻15 min后放置在5℃恒溫培養(yǎng)箱中12 h。分別以相同濃度的2-（三氟甲基）丙烯酸溶液作為參比在波長(zhǎng)190～400nm的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描間隔1nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的最大吸收峰測(cè)定

組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的紫外光譜掃描結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的最大吸收峰分別出現(xiàn)在波長(zhǎng)244 nm和245 nm處。

圖2 組胺與2-(三氟甲基)丙烯酸的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of histamine and 2-(trifluoromethyl)acrylic acid

2.2 差式紫外掃描以及對(duì)功能單體不同加入比例的紫外掃描

對(duì)于模板分子與功能單體形成的預(yù)組裝復(fù)合物，首先可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)反應(yīng)前后吸光度值的變化程度來(lái)對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定程度進(jìn)行一個(gè)預(yù)估，稱為差式紫外掃描[17]。組胺與不同比例的2-（三氟甲基）丙烯酸的差式紫外掃描結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 組胺與不同比例的2-(三氟甲基)丙烯酸的差式紫外光譜圖Fig.3 Differential UV spectra of histamine with various 2-(trifluoromethyl)acrylic acid ratios

由圖3可知，發(fā)現(xiàn)組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的比例至少為1∶4時(shí)才能形成穩(wěn)定的預(yù)組裝復(fù)合體系。

對(duì)于組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸形成預(yù)組裝復(fù)合物這個(gè)反應(yīng)而言，可用公式（1）來(lái)表示。

式中：H為組胺，T為2-（三氟甲基）丙烯酸，n為反應(yīng)的比例，K為反應(yīng)的平衡常數(shù)。

如設(shè)組胺和2-（三氟甲基）丙烯酸的初始濃度分別為a、b，復(fù)合物的濃度為c，在2-（三氟甲基）丙烯酸的濃度大于組胺濃度的情況下，平衡常數(shù)K可表示為公式（2）。

基于光的加和性質(zhì)，根據(jù)Lambert-Beer定律，反應(yīng)前后吸光度值的變化程度可表示為公式（3）。

式中：ΔA為吸光度值的變化，εH、εT、εH-T為組胺、2-（三氟甲基）丙烯酸和二者復(fù)合物的摩爾吸光系數(shù)，l表示樣品光程。

將公式（3）帶入公式（2）中通過(guò)整理可得出公式（4）。

式中：Δε為預(yù)組裝復(fù)合體系與各部分之間摩爾吸光系數(shù)的差值。

對(duì)于分子印跡聚合物而言，聚合物中氫鍵的數(shù)目越多，聚合物的特異性吸附能力越好[19-20]，而組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的反應(yīng)就能產(chǎn)生不同數(shù)目的氫鍵?；诠獾募雍托?，如果兩種物質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)，那么其混合溶液的吸光值理論上就應(yīng)該等于兩種物質(zhì)各自的吸光度值的數(shù)學(xué)加和[21]，如果二者發(fā)生反應(yīng)，則吸光值就會(huì)產(chǎn)生不同程度的變化，反應(yīng)后吸光值的變化越明顯即代表所生成的復(fù)合物特異性吸附能力越好。組胺與不同比例的2-（三氟甲基）丙烯酸反應(yīng)所生成的預(yù)組裝復(fù)合物的紫外光譜圖見(jiàn)圖4。本部分實(shí)驗(yàn)中，基于差式紫外掃描的結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了合理的優(yōu)化，選擇性的挑選了1∶4、1∶5、1∶6、1∶8、1∶10這6種比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

從圖4可明顯的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的比例為1∶6時(shí)最大吸收峰下降的程度最大，并且最大吸收峰產(chǎn)生了紅移，其他比例下的圖像變化不明顯。說(shuō)明在此比例條件下時(shí)，組胺上的N原子與2-（三氟甲基）丙烯酸上的羧基形成了最多的氫鍵且所形成的預(yù)組裝復(fù)合體系擁有最大的穩(wěn)定性。

圖4 組胺與不同比例的2-(三氟甲基)丙烯酸反應(yīng)的復(fù)合物紫外光譜圖Fig.4 UV spectra of histamine with various 2-(trifluoromethyl) acrylic acid ratios

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)組胺以及2-（三氟甲基）丙烯酸進(jìn)行紫外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，組胺的分子結(jié)構(gòu)中由于含有一個(gè)五元雜環(huán)以及末端含有一個(gè)氨基，所以受紫外激發(fā)能夠產(chǎn)生最大吸收峰。2-（三氟甲基）丙烯酸也由于其分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)碳氧雙鍵作為發(fā)色基團(tuán)而能產(chǎn)生最大吸收峰。二者的最大吸收峰分別出現(xiàn)在波長(zhǎng)244 nm和245 nm處。

通過(guò)對(duì)組胺以及2-（三氟甲基）丙烯酸的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，加上差式紫外掃描發(fā)現(xiàn)，1 mol的組胺要與4 mol的2-（三氟甲基）丙烯酸才能形成穩(wěn)定的預(yù)組裝復(fù)合體系。而通過(guò)2-（三氟甲基）丙烯酸的不同加入量與組胺反應(yīng)進(jìn)行紫外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組胺與2-（三氟甲基）丙烯酸的比例為1∶6時(shí)，體系的最大吸收峰產(chǎn)生明顯的下降，最大吸收峰出現(xiàn)的波長(zhǎng)也產(chǎn)生紅移，所以在該比例下二者形成的預(yù)組裝復(fù)合體系呈最穩(wěn)定的狀態(tài)。

[1]王艷，張建友，劉書來(lái)，等.水產(chǎn)品生物胺檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2009，28（6）：17-19.

[2]WANG K,TANIMOTO A,YAMADA S,et al.Histamine regulation in glucose and lipid metabolism via histamine receptors[J].Am J Pathol, 2010,177(2):713-723.

[3]季吉，董榕.下丘腦室旁核組胺H-3受體對(duì)哮喘大鼠呼吸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005（3）：164-167.

[4]劉天雅，洪宗元，曲衛(wèi)敏，等.中樞組胺能神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)睡眠-覺(jué)醒機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011（3）：247-252.

[5]崔成祥，于夕娟，曹珊珊.食用變質(zhì)鮐魚引起急性組胺中毒87例報(bào)告[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2012（10）：781-782.

[6]秦宏偉，張林軍，周廣田.高效液相色譜在啤酒檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)釀造，2009，28（5）：155-157.

[7]RUAUX C G,WRIGHT J M,STEINER J M,et al.Gas chromatography-mass spectrometry assay for determination of Nτ-methylhistamine concentration in canine urine specimens and fecal extracts[J].Am J Vete Res,2009,70(2):167-171.

[8]趙凌國(guó)，李學(xué)云，申紅衛(wèi)，等.納米金復(fù)合材料涂層毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定魚肉中的組胺[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2014（6）：575-579.

[9]王穎，邱璠，韓北忠，等.食品中的生物胺及其檢測(cè)方法[J].中國(guó)釀造，2011，30（10）：1-5.

[10]VLATAKIS G,ANDERSSON L I,MULLER R,et al.Drug assay using antibody mimics made by molecular imprinting[J].Nature,1993,361 (6413):645-647.

[11]郭秀春，周文輝.分子印跡技術(shù)研究進(jìn)展[J].化學(xué)研究，2012（5）：103-110.

[12]尹小英，衷友泉，江一帆，等.分子印跡聚合反應(yīng)中功能單體與模板分子間作用力的光譜分析[J].光譜學(xué)與光譜分析，2010（8）：2211-2214.

[13]TRIKKA F A,YOSHIMATSU K,YE L,et al.Molecularly imprinted polymers for histamine recognition in aqueous environment[J].Amino Acids,2012,43(5):2113-2124.

[14]劉慧君，徐偉箭，劉耀馳，等.磺胺二甲嘧啶分子印跡聚合物制備與光譜特性[J].光譜學(xué)與光譜分析，2007（8）：1596-1599.

[15]TAKEUCHI T,FUKUMA D,MATSUI J.Combinatorial molecular imprinting:an approach to synthetic polymer receptors[J].Anal Chem, 1999,71(2):285-290.

[16]NAKAMURA M,ONO M,NAKAJIMA T,et al.Uniformly sized molecularly imprinted polymer for atropine and its application to the determination of atropine and scopolamine in pharmaceutical preparations containingScopolia extract[J].J Pharm Biomed Anal,2005,37 (2):231-237.

[17]YIN C,MENG F,MENG Y,et al.Differential ultraviolet-visible absorbance spectra for characterizing metal ions binding onto extracellular polymeric substances in different mixed microbial cultures[J].Chemosphere,2016,159:267-274.

[18]張孝剛，朱秋勁，胡萍.三聚氰胺分子印跡預(yù)組裝體系紫外光譜研究[J].食品科學(xué)，2011，32（21）：128-132.

[19]董襄朝，孫慧，呂憲禹，等.鄰羥基苯甲酸分子印跡聚合物對(duì)于異構(gòu)體的識(shí)別及色譜行為研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2002（11）：2035-2042.

[20]梁亮，楊鑫莉，史博.分子印跡微球的合成吸附性能研究[J].化工新型材料，2013（9）：148-150.

[21]黃亞光，黃永嫦，王煥章，等.雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定呈味核苷酸二鈉混合物含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（7）：108-111.

Ultraviolet spectrum research of the preparation ratio of template molecule in histamine molecularly imprinted polymers

WANG Shuaishuai1,ZHU Qiujin1,2*
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province,Guiyang 550025,China)

Histamine commonly exists in various foods.In the rapid detection process of histamine using histamine molecularly imprinted polymers sensor,the ratio of template molecule and functional monomers has distinct influence on the specificity adsorption capacity.Histamine and 2-(trifluoromethyl)acrylic acid were selected as template molecule and functional monomer respectively.For exploring the most appropriate ratio,the ultraviolet spectrum was used to detect the maximum absorption peaks of histamine and 2-(trifluoromethyl)acrylic acid respectively.Furthermore,differential ultraviolet spectra and ultraviolet spectra were used to various functional monomer with different ratios.Results showed that the pre-assembly system got stable at the ratio of 1∶4,and the most stable situation was aquired at the ratio of 1∶6 with the decrease of the maximum absorption peak and the red shift of wavelength.The results showed a definite guidance for manufacturing histamine molecularly imprinted polymers sensor to the histamine rapid detection.

histamine;molecularly imprinted polymers;template-monomers ratio;ultraviolet spectrum

O657.32

0254-5071（2016）11-0149-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.031

2016-08-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31160324）；貴州省研究生工作站項(xiàng)目（黔教研合JYSZ字[2015]009）；貴州省研究生卓越人才計(jì)劃（黔教研合ZYRC字[2014]003）

王帥帥（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。

*通訊作者：朱秋勁（1969-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工及貯藏。