鄧清仙，侯潞丹，賀志斌，張杰，3*

（1.山西師范大學(xué)后勤管理處房產(chǎn)科，山西臨汾041000；2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041000；3.國家微生物肥料技術(shù)研究推廣中心第24號技術(shù)推廣站，山西臨汾041000）

杏鮑菇液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

鄧清仙1，侯潞丹2，賀志斌2，張杰2，3*

（1.山西師范大學(xué)后勤管理處房產(chǎn)科，山西臨汾041000；2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041000；3.國家微生物肥料技術(shù)研究推廣中心第24號技術(shù)推廣站，山西臨汾041000）

該研究通過響應(yīng)面試驗設(shè)計方法對杏鮑菇液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分進(jìn)行了優(yōu)化，探討4個不同單因素對杏鮑菇菌絲干質(zhì)量的影響。結(jié)果表明，最佳的培養(yǎng)基配方為馬鈴薯100 g/L，麥麩30 g/L，蔗糖27 g/L，蛋白胨1.40 g/L，KH2PO40.85 g/L，MgSO41 g/L。在此配方下，杏鮑菇菌絲干質(zhì)量高達(dá)1.885 1 g/100 mL。這不僅為杏鮑菇液體種子發(fā)酵提供依據(jù)，同時也為其栽培提供依據(jù)。

杏鮑菇；液體種子；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面分析

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，屬真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是一種珍稀食用菌，也被稱平菇王。因為其營養(yǎng)價值高且口感好、低脂肪、低熱量，因此受到全球人們的喜愛[1-3]。

當(dāng)前的研究主要集中于杏鮑菇栽培技術(shù)[4-6]，在杏鮑菇規(guī)?；a(chǎn)過程中，多數(shù)選用固體菌種培養(yǎng)，其具栽培周期長、污染率高、菌體內(nèi)菌齡相差懸殊、出菇不齊，不利于規(guī)?；蜋C械化生產(chǎn)等缺點。液體制種周期短、發(fā)菌速度快、污染率低，有利于杏鮑菇生產(chǎn)的工廠化以及現(xiàn)代化[7]。為了縮短杏鮑菇制種及生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，大批學(xué)者對液體制種做了詳細(xì)研究，而在液體發(fā)酵過程中，碳源不僅維持其正常生長，而且提供杏鮑菇合成碳水化合物和氨基酸的骨架，而氮源則是杏鮑菇合成蛋白質(zhì)和核酸的必要元素[8]，因此篩選出一種適用于杏鮑菇生長的培養(yǎng)基非常重要[9]。而響應(yīng)面方法（response surface method，RSM）是一種有效的方法，其廣泛應(yīng)用于優(yōu)化[10-11]。本研究采用響應(yīng)面法對杏鮑菇液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基的組分進(jìn)行了篩選及優(yōu)化，得出了杏鮑菇液體種子發(fā)酵所需的最適培養(yǎng)基配方，這不僅可以縮短液體種子發(fā)酵周期，也可為杏鮑菇高質(zhì)量的栽培提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）：四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究中心；馬鈴薯葡萄糖瓊脂、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、MgSO4、KH2PO4：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA22O4B型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；PH-3CX酸度計：上海雷磁有限公司；YXO-LS-50-SII型全自動高壓滅菌器、SPX-250B-D型數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱、SW-CJ-2FD雙人垂直超凈工作臺、DEF-6050MBE真空干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；Z36HK臺式高速冷凍離心機：德國赫默公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將杏鮑菇菌種接種到試管斜面上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d備用；將斜面菌種接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板上28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d可得平板菌種，供碳氮源優(yōu)選試驗使用。

通過無菌操作技術(shù)，使用打孔器將平板菌種進(jìn)行打孔，并接至裝有PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，且錐形瓶裝液量為100 mL/250 mL，每瓶接種3塊菌柄，置于120 r/min、28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，可得一級種子液。

1.3.2 最佳碳源篩選試驗

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為馬鈴薯100 g/L，麩皮30 g/L，蛋白胨1.5 g/L，MgSO40.9 g/L，KH2PO41.5 g/L，pH值自然[12]，分別添加葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉5種碳源，其含量為30 g/L。將菌柄接種到平板中央，每24 h采用十字交叉法測量菌落直徑并記錄，計算菌絲生長速度，待培養(yǎng)結(jié)束后拍照比較菌絲長勢，綜合比較來確定杏鮑菇菌種培養(yǎng)最適碳源。

1.3.3 最佳氮源篩選試驗

以葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、瓊脂20 g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，以玉米粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、KNO36種氮源為單一變量分別配制培養(yǎng)基，滅菌后倒制平板備用。每24 h采用十字交叉法測量菌落直徑并記錄，計算菌絲生長速度，待培養(yǎng)結(jié)束后拍照比較菌絲長勢，綜合比較來確定杏鮑菇菌種培養(yǎng)最適氮源。

1.3.4 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別調(diào)整添加碳源含量（15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L），氮源含量（1.0 g/L、1.5 g/L、3.0 g/L、4.5 g/L、6.0 g/L）[13]，根據(jù)試驗結(jié)果來確定最適碳源、氮源的添加量。

1.3.5 響應(yīng)面法對杏鮑菇液體菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design g/L

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，以發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖（X1）、蛋白胨（X2）、MgSO4（X3）、KH2PO4（X4）添加量4個因素為自變量，以菌絲產(chǎn)量即菌絲干質(zhì)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計了優(yōu)化杏鮑菇液體菌種培養(yǎng)基的4因素3水平試驗。試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)處理和模型建立皆采用Design Expert（Version 8.0.6）來進(jìn)行統(tǒng)計分析。響應(yīng)面設(shè)計因素及水平編碼見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對杏鮑菇菌絲生長速度的影響作用

由圖1可知，杏鮑菇菌絲長勢隨著培養(yǎng)基的碳源不同存在明顯差異。以葡萄糖為碳源菌絲潔白、濃密，但菌落形態(tài)不完整；以麥芽糖和淀粉為碳源比以葡萄糖為碳源菌落形態(tài)完整，但菌絲稀疏，且不健壯，這主要是因為真菌利用單糖的能力要高于雙糖和多糖；以乳糖為碳源比以葡萄糖為碳源菌落形態(tài)稍完整，且菌絲潔白、濃密、健壯；以蔗糖為碳源比以前4種物質(zhì)為碳源菌落形態(tài)完整，菌絲潔白、濃密、健壯。因此杏鮑菇菌絲在以上5種不同碳源中長勢有好到差依次為：蔗糖（3.402mm/d）＞麥芽糖（2.526mm/d）＞淀粉（1.734mm/d）＞乳糖（1.601mm/d）＞葡萄糖（0.932mm/d）。因此，選擇蔗糖為最適碳源。

圖1 不同碳源培養(yǎng)基對杏鮑菇菌絲長勢的影響Fig.1 Effect of different carbon sources of medium on the growth ofP.eryngiimycelia

圖2 不同蔗糖含量對杏鮑菇菌絲干質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of different sucrose contents on dry mass of P.eryngiimycelia

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加分別不同量的蔗糖（15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L）對杏鮑菇菌絲干質(zhì)量的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)蔗糖含量在15～25 g/L時，菌絲干質(zhì)量隨著蔗糖含量增加而顯著性增加；且在蔗糖添加量為25 g/L時，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值；隨后，菌絲干質(zhì)量隨著蔗糖添加量的增加而下降。因此，杏鮑菇液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖最適添加量為25 g/L。

2.2 不同氮源對杏鮑菇菌絲生長速度的影響作用

由圖3可知，杏鮑菇菌絲長勢隨著培養(yǎng)基中氮源種類的不同存在明顯差異。以蛋白胨為氮源菌絲潔白、濃密，且菌落形態(tài)完整；以玉米粉和KNO3為氮源菌落形態(tài)完整，但菌絲稀疏，且不健壯；以酵母膏為氮源菌絲潔白、濃密、健壯，但菌落形態(tài)不完整；以牛肉膏為氮源菌絲潔白、濃密、健壯，但菌落形態(tài)不完整。因此，菌絲在以上不同氮源中長勢由好到差次序為：蛋白胨（3.123 mm/d）＞玉米粉（3.567 mm/d）＞KNO3（3.054 mm/d）＞牛肉膏（2.590 mm/d）＞酵母膏（2.147 mm/d）＞尿素（0 mm/d）。因此，選擇蛋白胨為最適氮源。

圖3 不同氮源培養(yǎng)基對杏鮑菇菌絲長勢的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources of medium on the growth ofP.eryngiimycelia

不同的蛋白胨含量對杏鮑菇菌絲干質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著蛋白胨含量的增加，杏鮑菇菌絲干質(zhì)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在蛋白胨含量為1.5 g/L時，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值（1.22 g/100 mL）。因此，杏鮑菇液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中最適蛋白胨含量為1.5 g/L。

圖4 不同蛋白胨含量對杏鮑菇菌絲干質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of different peptone contents on dry mass of P.eryngiimycelia

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化杏鮑菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分

響應(yīng)面法常被應(yīng)用在多個因素存在的優(yōu)化研究工作中，其具有節(jié)約時間、空間以及原材料等優(yōu)點[14]。本實驗設(shè)計的29組試驗組，其中1～24組為析因試驗，25～29組為中心試驗。響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果見表2，響應(yīng)面回歸模型方差分析，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

通過Design-Expert 8.0.6對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到二次多項回歸擬合方程：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回歸模P＜0.001，表現(xiàn)為顯著，同時失擬項P=0.275 4，表現(xiàn)為不顯著。二次回歸模型中決定系數(shù)R2=0.857 0，調(diào)整決定系數(shù)Radj2=0.719 3，說明有85.70%的差異可以用這個回歸模型來解釋。由此可知，該回歸模型擬合度良好。由表3可知，一次項X1，交互項X1X3對菌絲干質(zhì)量表現(xiàn)為顯著影響（P＜0.05），而二次項X22、X22、X32、X42對菌絲干質(zhì)量表現(xiàn)為極顯著影響（P＜0.01）。4個因素對菌絲干質(zhì)量影響作用從大到小依次為X1＞X3＞X4＞X2。

2.4 響應(yīng)面分析[15-16]

將上述回歸方程的圖形化表示，響應(yīng)曲面及等高線結(jié)果見圖5。由圖5（a）可知，蛋白胨與蔗糖兩因素的交互作用雖對菌絲干質(zhì)量得率有一定的影響作用，但該作用并不顯著。由圖5（b）可知，蔗糖與KH2PO4交互作用顯著的影響了杏鮑菇菌絲干質(zhì)量（P＜0.05）。由圖5（c）、5（d）、5（e）、5（f）可知，蔗糖與MgSO4、蛋白胨和KH2PO4、蛋白胨與MgSO4及KH2PO4和MgSO4之間的交互作用均對菌絲干質(zhì)量得率的影響不顯著（P＞0.05）。

圖5 蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4交互作用對杏鮑菇菌絲干質(zhì)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose,peptone, KH2PO4and MgSO4on the dry mass ofP.eryngiimycelia

2.5 杏鮑菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化與驗證結(jié)果分析

運用Design-Expert 8.0.6軟件所獲得杏鮑菇液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方為：馬鈴薯100 g/L，麥麩30 g/L，蔗糖26.87 g/L，蛋白胨1.42 g/L，KH2PO40.85 g/L，MgSO41.05 g/L。此配方計算出來杏鮑菇菌絲干質(zhì)量為1.917 0 g/100 mL?？紤]到實際的生產(chǎn)操作，培養(yǎng)基成分的優(yōu)化參數(shù)修改為馬鈴薯100 g/L，麥麩30 g/L，蔗糖27 g/L，蛋白胨1.40 g/L，KH2PO40.85g/L，MgSO41g/L，在此條件下菌絲體干質(zhì)量為1.885 1 g/100 mL。結(jié)果表明真實值與預(yù)測值間無顯著性差異。

3 結(jié)論

本實驗通過使用響應(yīng)面法試驗設(shè)計對杏鮑菇液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明最佳的液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯100 g/L，麥麩30 g/L，蔗糖27 g/L，蛋白胨1.40g/L，KH2PO40.85g/L，MgSO41g/L。在此最佳培養(yǎng)基配方條件下下，杏鮑菇菌絲干質(zhì)量為1.8851g/100mL。這不僅為杏鮑菇液體種子發(fā)酵提供依據(jù)，同時也為其栽培提供依據(jù)。

本研究在此基礎(chǔ)上得出了最適碳源、氮源，進(jìn)一步探究了發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比。但是有關(guān)杏鮑菇液體菌種的培養(yǎng)條件的探究以及新型廢棄料的栽培還需要進(jìn)一步深入研究。

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Optimization of medium compositions for liquid seed fermentation ofPleurotus eryngii

DENG Qingxian1,HOU Ludan2,HE Zhibin2,ZHANG Jie2,3*
(1.Housing Administrative Office,Logistics Management Department,Shanxi Normal University,Linfen 041000,China; 2.School of Life Science,Shanxi Normal University,Linfen 041000,China;3.The No.24 Technology Extending Station, the National Technology Research and Extension Center of Microbial Fertilizer,Linfen 041000,China)

The medium compositions for liquid seed fermentation ofPleurotus eryngiiwere optimized by response surface methodology.The effects of four factors on dry mass ofP.eryngiimycelia were investigated.The results showed that the optimal medium compositions were potato 100 g/L, wheat bran 30 g/L,sucrose 27 g/L,peptone 1.40 g/L,KH2PO40.85 g/L and MgSO41 g/L.Under the conditions,the dry mass ofP.eryngiimycelia was up to 1.885 1 g/100 ml,which not only provided the basis for liquid seed fermentation ofP.eryngii,and also provided the basis for their cultivation.

Pleurotus eryngii;liquid seed;medium optimization;response surface methodology

Q939.96

0254-5071（2016）11-0128-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.026

2016-08-12

山西師范大學(xué)科技開發(fā)基金項目（YK1201）

鄧清仙（1963-），女，高級實驗師，本科，主要從事園林、園藝、農(nóng)學(xué)等方面的應(yīng)用工作。

*通訊作者：張杰（1978-），男，副教授，博士，主要從事微生物肥料的研發(fā)、生產(chǎn)工作。