李楠，楊春杰，鄧隨勝，王芮東，閻曉東

（1.運城學院生命科學系，山西運城044000；2.運城職業(yè)技術學院有機食品工程系，山西運城044000；3.運城學院理科實驗中心，山西運城044000）

富含黃酮的山楂果酒發(fā)酵條件優(yōu)化

李楠1，楊春杰2，鄧隨勝1，王芮東3，閻曉東1

（1.運城學院生命科學系，山西運城044000；2.運城職業(yè)技術學院有機食品工程系，山西運城044000；3.運城學院理科實驗中心，山西運城044000）

該試驗研究發(fā)酵條件對提高山楂果酒發(fā)酵過程中總黃酮含量的影響。首先通過單因素試驗初步研究發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖度及發(fā)酵液pH值4個發(fā)酵條件對發(fā)酵后果酒中總黃酮含量的影響，然后以發(fā)酵后山楂果酒中總黃酮含量為響應值通過響應面法確定最優(yōu)發(fā)酵條件。結果表明，優(yōu)化發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度26.6℃，酵母接種量0.40 g/L，初始糖度15.2%，pH 3.2，最終果酒總黃酮含量為10.75 mg/100 mL，總糖（以葡萄糖計）含量為10.6 g/L，酒精度（20℃）為7.5%vol，酒質(zhì)澄清透明，無明顯懸浮物，色澤呈桔紅色，具有較明顯的山楂果香，酸甜協(xié)調(diào)。

山楂；果酒；總黃酮；響應面法；發(fā)酵

山楂（Crataegus pinnatifido）又名紅果、山里紅，是薔薇科山楂屬植物山里紅或山楂的成熟果實[1-2]，是一味藥食兩用的核果類植物[3]。黃酮是山楂的活性成分之一，對高血壓、糖尿病、高血脂、冠心病等均具有輔助治療作用，是防治心血管疾病較好的天然植物資源[4-7]。

我國山楂資源豐富，但由于口感較酸，鮮食量不大，山楂加工多是傳統(tǒng)工藝，產(chǎn)品附加值低[8-10]。果酒是以野生或人工種植植物的果實為原料發(fā)酵而成的低酒精度飲料，其保留了水果原有的糖類、有機酸、黃酮和礦物質(zhì)等成分[11-12]。以山楂為原料生產(chǎn)果酒，不僅能夠提高山楂的加工價值，而且能夠利用山楂中已發(fā)現(xiàn)并被臨床證實的黃酮等具有特殊治療作用的活性物質(zhì)，發(fā)揮山楂獨特的保健、藥理作用。但是，生物發(fā)酵是一個復雜的過程，酵母菌的種類、發(fā)酵溫度、含糖量、發(fā)酵液初始pH值等因素都會對發(fā)酵結果產(chǎn)生影響，進而影響果酒中總黃酮的含量，不適宜的發(fā)酵條件會導致果酒中黃酮等活性物質(zhì)失去活性[13]。因此本研究旨在以保留山楂中活性因子總黃酮為目標，探討發(fā)酵溫度、酵母接種量、初始糖濃度和發(fā)酵液pH值對山楂果酒中總黃酮含量的影響，以期為新型山楂果酒的開發(fā)提供理論與實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：產(chǎn)地山西運城絳縣，品種為大金星，采摘后在冰箱中密閉冷藏保存。

果酒專用干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蘆丁標準品：上海潤捷化學試劑有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硫酸、檸檬酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、鹽酸、次甲基藍（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-5500PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SPX-250C恒溫恒濕箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TDL6M臺式冷凍離心機：湖南湘立科學儀器有限公司；JJ-2組織搗碎機：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；PHS-3E精密pH計：上海佑科儀器儀表有限公司；WZB便攜式糖度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山楂果酒發(fā)酵工藝流程

切片：將山楂去梗、去蒂、去核，切成片后立即放入4% D-異抗壞血酸鈉溶液中，防止褐變；打漿：將用D-異抗壞血酸鈉溶液浸泡的山楂瀝干水分，放入組織搗碎機中，再加入蒸餾水（料液比1∶3（g∶mL）），充分攪打至漿狀；軟化處理：在山楂漿中加入0.02%的果膠酶；酶解：45℃恒溫酶解2 h[14]；調(diào)整成分：用白砂糖調(diào)整山楂漿的糖度，檸檬酸或氫氧化鈉調(diào)整山楂漿的酸度，并加入1 mL/L H2SO3抑制雜菌生長和防止氧化；發(fā)酵：在試驗設置的溫度條件下發(fā)酵7 d左右，殘?zhí)呛炕痉€(wěn)定時發(fā)酵結束；分離、澄清：取上層酒液，4 000×g離心10 min，測定上清液中總黃酮含量。

1.3.2 單因素試驗

發(fā)酵溫度：取已酶解的山楂果漿，在酵母接種量0.3g/L，初始糖度10%，發(fā)酵液pH值3.0的條件下，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，離心，取上層清液測定總黃酮含量。

酵母接種量：在發(fā)酵溫度25℃，初始糖度10%，發(fā)酵液pH值3.0的條件下，分別調(diào)整酵母接種量為0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，離心，取上層清液測定總黃酮含量。

初始糖度：在發(fā)酵溫度25℃，酵母接種量0.3 g/L，發(fā)酵液pH值3.0的條件下，分別調(diào)整初始糖度為10%、15%、20%、25%、30%進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，離心，取上層清液測定總黃酮含量。

發(fā)酵液pH值：在發(fā)酵溫度25℃，酵母接種量0.3 g/L，初始糖度10%的條件下，分別調(diào)整發(fā)酵液pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0進行發(fā)酵。發(fā)酵結束后，離心，取上層清液測定總黃酮含量。

1.3.3 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，使用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken方法設計4因素3水平響應面試驗，因素與水平見表1。

表1 山楂果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of hawthorn fruit wine

1.3.4 測定方法

總黃酮含量測定采用紫外可見分光光度法。參照文獻[15-16]方法并稍作修改。以蘆丁作為標品繪制標準曲線：準確吸取0、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL的0.4 mg/mL蘆丁標準溶液，置于50 mL容量瓶中。分別加入5%NaNO2溶液0.8 mL并充分搖蕩，6 min后，加入10%Al（NO3）3溶液0.8 mL，混勻，靜置6 min，再加入1 mol/L NaOH溶液10 mL，充分搖蕩，25℃反應15 min后用體積分數(shù)30%的乙醇定容，于波長510 nm處測定吸光度值。測定酒中總黃酮的含量時，精確量取0.4 mL酒樣，測定方法與繪制標準曲線相同，利用回歸方程和測得的吸光度值計算酒液中總黃酮的含量（以蘆丁計）。

總糖含量測定[17]：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法。酒精含量測定[17]：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法。感官質(zhì)量分析[17-18]：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》、QB/T 1983—1994《山楂酒》中的感官分析方法。感官評價標準見表2。

表2 感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1可知，標準曲線的回歸方程為：y=17.556x-0.029，相關系數(shù)R2=0.999 7。結果表明在一定范圍內(nèi)，蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度值間的線性關系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 發(fā)酵溫度對總黃酮含量的影響

不同發(fā)酵溫度對總黃酮含量的影響如圖2所示。

圖2 發(fā)酵溫度對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the total flavonoids contents

由圖2可以看出，當發(fā)酵溫度在15～35℃時，山楂果酒中總黃酮含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。15℃時溫度較低，酵母的生長代謝緩慢，產(chǎn)生的酒精少，溶解在酒中的黃酮也少；35℃時溫度過高，發(fā)酵速率雖快，但發(fā)酵停止得也快，酵母沒有充足的糖代謝，過早的衰老，酒精度低，溶解的黃酮也少[19]。當溫度為25℃時，酵母的生長代謝條件適宜，酒精產(chǎn)量較高，黃酮物質(zhì)在酒中的溶解量能達到最高。因此，選擇發(fā)酵溫度25℃為宜。

2.2.2 酵母接種量對總黃酮含量的影響

不同酵母接種量對總黃酮含量的影響如圖3所示。

圖3 酵母接種量對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the total flavonoids contents

由圖3可以看出，當酵母菌接種量為0.1～0.5 g/L時，隨著接種量的不斷增大，總黃酮含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢。酵母接種量為0.1 g/L時，發(fā)酵啟動慢，產(chǎn)生的酒精量少，所以溶解在酒中的黃酮量也少；接種量為0.5 g/L時，可用于酵母菌代謝的糖分相對較少，酵母繁殖數(shù)目少，易衰老，酒精產(chǎn)量低，酒中的黃酮含量也較低[19]。當酵母接種量為0.4 g/L時，發(fā)酵較快，酒精產(chǎn)量也較高，黃酮含量也達到了最大值。因此，選擇酵母接種量0.4 g/L為宜。

2.2.3 初始糖度對總黃酮含量的影響

不同初始糖度對總黃酮含量的影響如圖4所示。

圖4 初始糖度對總黃酮含量的影響Fig.4Effectofinitialsugarconcentrationonthetotalflavonoidscontents

由圖4可以看出，隨著初始糖度的升高，總黃酮含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢。當初始糖度為10%時，糖度較低，代謝生成的酒精含量也低，不利于黃酮在酒中的溶出。當初始糖度上升至15%時，糖度比較適宜酵母菌的生長，產(chǎn)生的酒精量也能達到一個比較高的水平，進而使果酒中總黃酮含量達到最高。初始糖度＞15%后，隨著糖度的升高，果酒中的總黃酮含量反而越來越低，原因可能是酵母的生長和代謝受到抑制，糖度太高時甚至在一定程度上導致發(fā)酵停止。因此，選擇初始糖度15%為宜。

2.2.4 發(fā)酵液pH值對總黃酮含量的影響

不同pH值對總黃酮含量的影響如圖5所示。

圖5 發(fā)酵液pH值對總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of fermentation liquid pH on the total flavonoids contents

由圖5可以看出，當發(fā)酵液pH值為2～6時，總黃酮含量表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在pH值為2的強酸環(huán)境下，酵母菌的生長和代謝受到抑制，酒精產(chǎn)量較低，溶出的黃酮也較少。當pH值為3時，總黃酮含量最高。此外，過高的pH值會使山楂果酒受到雜菌污染[20]，黃酮類化合物也不能穩(wěn)定存在。因此，選擇發(fā)酵液pH值3為宜。

2.3響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

響應面試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表3 山楂果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of hawthorn fruit wine

響應面試驗設計及結果見表3，采用Design-Expert8.0.6軟件對表3中數(shù)據(jù)進行分析和推導，得到回歸方程如下：

Y=10.82+0.96A+0.10B+0.097C+0.66D－0.66AB－0.15AC+0.19AD+0.64BC+0.19BD+0.077CD－1.55A2－1.50B2－1.11C2－1.43D2。

由表4可以看出，決定系數(shù)R2=0.954 7，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9094，說明91.83%的響應值變化是由所選變量引起的，方程的擬合程度較優(yōu)；失擬項差異不顯著（P=0.823 2＞0.05），說明實驗誤差較?。豢傸S酮含量（Y）的變異系數(shù)為5.01%，說明試驗的精確度和可靠性都達到了一個較優(yōu)水平[21]，通過響應面法對山楂果酒中總黃酮含量進行優(yōu)化是可行的。

表4 響應面模型方差分析結果Table 4 ANOVA for response surface quadratic model analysis

使用F檢驗判定回歸方程中4個變量對總黃酮含量影響的顯著性，也就是說，P值越小，相應變量的顯著性越高[22]。從表4可以看出，該模型的P＜0.01%，這表明該模型是顯著的。發(fā)酵溫度、pH值以及4個變量的二次項（A2、B2、C2、D2）對總黃酮含量有極顯著影響（P＜0.01）。交互項AB與BC對總黃酮含量有顯著影響（P＜0.05）。從各變量P值的大小，得出4個變量對山楂果酒中總黃酮含量的影響大小依次是發(fā)酵溫度＞發(fā)酵液pH值＞酵母接種量＞初始糖度。

2.3.2 響應曲面分析

由圖6可以看出，隨著發(fā)酵溫度和酵母接種量不斷增大，總黃酮含量先上升后下降，說明這兩者過大或過小都不能使總黃酮含量達到最大值，只有當它們?nèi)∧硞€適中值時，總黃酮含量才可達到最大值。當初始糖濃度在14%～16%范圍變化時，總黃酮含量先升高后降低，且達到最大值。發(fā)酵溫度和酵母接種量的交互作用＞酵母接種量和糖濃度的交互作用，通過表3中P值的大?。≒AB＜PBC）進行驗證，結果與此相同[23-24]。

圖6 發(fā)酵溫度、初始糖度與酵母接種量交互作用對總黃酮含量影響的響應曲面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature, yeast inoculum,initial sugar concentration and yeast inoculum on the total flavonoids contents

2.3.3 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為優(yōu)化發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度26.57℃，酵母接種量0.40 g/L，初始糖度15.18%，發(fā)酵液pH值3.23，果酒總黃酮含量11.05 mg/100 mL。為方便實際操作修改條件為發(fā)酵溫度26.6℃、酵母接種量0.40 g/L、初始糖度15.2%、發(fā)酵液pH值3.2，在優(yōu)化得出的最優(yōu)條件下做3次平行試驗進行驗證，得到總黃酮含量平均值為10.75 mg/100 mL，與理論預測值接近，酒中總糖（以葡萄糖計）含量為10.6 g/L，酒精度（20℃）為7.5%vol。

3 結論

通過Design-Expert 8.0.6軟件得到4個因素對總黃酮含量影響的主次順序為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵液pH值＞酵母接種量＞初始糖度，發(fā)酵溫度與酵母接種量的交互作用＞酵母接種量與初始糖度的交互作用。

采用響應面法得出高黃酮含量山楂果酒的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度26.6℃、酵母接種量0.40g/L、初始糖度15.2%、pH3.2，該條件下山楂果酒中總黃酮含量為10.75mg/100mL，總糖（以葡萄糖計）含量為10.6g/L，酒精度（20℃）為7.5%vol，酒質(zhì)澄清透明，色澤呈桔紅色，無明顯懸浮物，具有較明顯的山楂果香，酸甜協(xié)調(diào)。

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Optimization of fermentation conditions for flavonoids-rich hawthorn fruit wine

LI Nan1,YANG Chunjie2,DENG Suisheng1,WANG Ruidong3,YAN Xiaodong1
(1.Department of Life Science,Yuncheng University,Yuncheng 044000,China; 2.Department of Organic Food Engineering,Yuncheng Polytechnic College,Yuncheng 044000,China; 3.Science Experiments Center,Yuncheng University,Yuncheng 044000,China)

The effects of fermentation conditions(including fermentation temperature,yeast inoculum,initial sugar concentration and fermentation liquid pH)on total flavonoids content during the hawthorn fruit wine fermentation process were researched.Using the total flavonoids content as response value,the optimal fermentation conditions were determined by the single factor experiments and response surface methodology.The results showed that the optimal fermentation conditions were fermentation temperature 26.57℃,yeast inoculum 0.40 g/L,initial sugar concentration 15.18%and pH 3.23.Under the conditions,the total flavonoids content,total sugar content(with glucose)and alcohol content(20℃)in fruit wine were 10.75 mg/100 ml,10.6 g/L and 7.5%vol,respectively.The wine was clear without obvious suspended solids,and the colour was orange.The wine had obvious hawthorn fruit flavor,harmonious sourness and sweetness.

hawthorn;fruit wine;total flavonoids;response surface methodology;fermentation

TS262.7

0254-5071（2016）11-0112-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.023

2016-07-13

運城學院院級科研項目（CY-2015003）

李楠（1986-），女，助教，碩士，研究方向為食品功能性成分提取與評價。