張蕓

文件編號： 1003 - 7586（2016）11 - 0052 - 02

在普通高中生物課程標準中對植物組織培養(yǎng)的具體要求是“嘗試植物的組織培養(yǎng)”，建議用組織培養(yǎng)法培養(yǎng)花卉等幼苗，并進行露地栽培。植物組織培養(yǎng)是一項操作復雜而精細、難度較大的實踐活動。從操作的持續(xù)時間來看，該實驗無法在一節(jié)課內完成，因此筆者利用課余時間組織興趣小組的學生利用植物組織培養(yǎng)的方法培養(yǎng)油菜，讓學生切身感受植物組織培養(yǎng)的全過程，培養(yǎng)了動手操作的能力，這不僅符合新課程倡導探究性學習的基本理念，同時為今后班級化大規(guī)模實驗的開展奠定了基礎。

1 實驗材料

油菜種子、滅菌的培養(yǎng)基、體積分數為70%的酒精、體積分數為0.1%的升汞、無菌水、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)罐、酒精燈、光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、解剖刀、鑷子等。

2 實驗方法

2.1 配制MS固體培養(yǎng)基

2.1.1 配制母液

（1） MS大量元素Ⅰ：41.25 g NH4NO3溶化后加8.31 g無水CaCl2，用蒸餾水定容至500 mL；

（2） MS大量元素Ⅱ：47.5 g KNO3與4.25 g KH2PO4分別溶解后混合，用蒸餾水定容至500 mL；

（3） MS大量元素Ⅲ：18.5 g MgSO4·7H2O，用蒸餾水定容至500 mL；

（4） Fe鹽：3.73 g EDTA-Na與2.78 g FeSO4·7H2O，分別溶解后混合，蒸餾水定容至500 mL；

（5） MS微量元素：依次加入下列各藥品，溶解后再加入后一種，最后用蒸餾水定容至500 mL

83 mg KI、620 mg H3BO3、1 690 mg MnSO4·H2O、860 mg ZnSO4·7H2O、25 mg NaMoO4·2H2O、 2.5 mg CuSO4·5H2O、2.5 mg CoCl2·6H2O。

（6） MS維生素：依次加入2 g 肌醇、10 mg 煙酸、10 mg 鹽酸吡哆醛、2 mg 鹽酸硫胺素、40 mg 甘氨酸等藥品后用蒸餾水定容至200 mL。

（7） 6-BA母液：20 mg 6-BA加入0.2 M HCl溶化，用蒸餾水定容至100 mL；

（8） NAA母液：20 mg NAA加入0.2 M NaOH溶化，用蒸餾水定容至100 mL；

（9） 2，4-D母液：20 mg 2，4-D加入0.2 M NaOH溶化，用蒸餾水定容至100 mL；

（10） AgNO3儲液：1.2 g AgNO3加蒸餾水定容至100 mL，過濾滅菌。

（11） 頭孢霉素（Cef）溶液：滅菌蒸餾水配置成250 mg/mL母液；

2.1.2 配制相關培養(yǎng)基

（1） 種子萌發(fā)培養(yǎng)基：MS。

（2） 誘導培養(yǎng)基：MS、2 mg/L 6-BA、0.1 mg/L 2，4-D。

（3） 分化培養(yǎng)基：MS。

（4） 壯苗培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、6 mg/L AgNO3、50 mg/L Cef。

（5） 生根培養(yǎng)基：1/2 MS。

若配制MS培養(yǎng)基1 L，則MS大量元素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、微量元素、維生素各1 mL，Fe鹽2 mL。以上培養(yǎng)基均加蔗糖30 g/L及瓊脂8 g/L，pH調至6.2。

2.1.3 滅菌及分裝培養(yǎng)基

將配制好的培養(yǎng)基連同其他用具，如培養(yǎng)罐、燒杯、培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子、無菌水、濾紙等相關物品一起放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C滅菌15～20 min。同時打開超凈工作臺的紫外燈，20 min后關閉紫外燈并開啟鼓風機。待滅菌鍋氣壓降為0后，將所有物品取出放入超凈工作臺。關閉超凈工作臺的鼓風機用酒精棉球仔細擦拭超凈工作臺的臺面及雙手，點燃酒精燈，待培養(yǎng)基冷卻至不燙手時，在酒精燈火焰旁將培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)罐中。

2.2 實驗步驟

培養(yǎng)無菌苗：選取子粒飽滿的油菜種子若干，在超凈工作臺中的酒精燈火焰旁，用酒精消毒30 s后，立即用無菌水沖洗3次，再用升汞處理5 min后，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸去種子表面水分后，將種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱，光照12 h/d。

獲取外植體，并誘導形成愈傷組織：待無菌苗長至7 d，分別切取下胚軸和子葉為外植體，接種于誘導培養(yǎng)基中，黑暗中培養(yǎng)，每10 d更換一次培養(yǎng)基。20 d后可見愈傷組織。

誘導生根：將分化約1～2 cm的綠芽切下轉入壯苗培養(yǎng)基中待分化，芽苗長至3～5 cm時轉入生根培養(yǎng)基中。

煉苗及移栽：待試管苗根系發(fā)達時，打開蓋子煉苗3 d后移至花盆中進行露地栽培。

3 討論

3.1 植物組織培養(yǎng)基中添加蔗糖的原因

作為碳源和能源物質，蔗糖比葡萄糖能更好地維持培養(yǎng)基內的低滲環(huán)境。如配制相同質量分數的培養(yǎng)基，蔗糖形成的滲透壓明顯低于葡萄糖，若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細胞脫水而生長不良。并且植物細胞吸收蔗糖的速率比吸收葡萄糖的速率慢很多，所以蔗糖形成的滲透壓可較長時間地保持相對穩(wěn)定。其次從能量供應來說，相同物質的量濃度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。此外，在組培過程中，要特別注意防止培養(yǎng)基受微生物的污染。已知微生物生長所需的碳源最適合的是葡萄糖，而較少利用蔗糖，因此采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可在一定程度上減少微生物的污染。

3.2 選擇子葉和下胚軸作為外植體的原因

研究表明，油菜子葉和下胚軸因獲取方便，再生率高、易轉化等特點，常被用作誘導愈傷組織及再生芽的理想材料。并且直接用種子培養(yǎng)無菌苗，再以無菌苗的子葉和下胚軸作為外植體，可避免消毒難、培養(yǎng)效果受接種時間等因素的限制。

3.3 脫分化時要避光及再分化時要光照的原因

外植體脫分化形成愈傷組織時需要避光，其目的是為了愈傷組織的形成，如果給予光照，則會不同程度地形成維管組織。愈傷組織是未分化的狀態(tài)，維管組織是已分化的狀態(tài)，若外植體分化成維管組織，則無法繼續(xù)分化成胚狀體，更無法長成植株。而愈傷組織再分化時需要光照，主要是為了葉綠素的形成。因為只有在光照條件下，植物細胞中原葉綠素酸脂還原酶才可以將原葉綠素酸脂還原為葉綠素酸脂，后者再進一步形成葉綠素。

3.4 培養(yǎng)過程中多次更換培養(yǎng)基的原因

首先，組織培養(yǎng)不同階段所使用的培養(yǎng)基成分是不一樣的，特別是植物激素的組成及比例。其次，培養(yǎng)過程中外植體會產生一些有毒的代謝物，因此需要定期更換培養(yǎng)基，以免影響培養(yǎng)物的生長狀態(tài)。再者，培養(yǎng)過程中可能會受雜菌污染，若染細菌且菌斑不大，可及時將其他未接觸到菌的外植體換至新的培養(yǎng)基中。

3.5 組培苗移栽前煉苗的原因

組培苗雖具有一定的光合能力，但處于高濕、弱光、低CO2、恒溫、異養(yǎng)條件下生長，其組織分化不完善，光合自養(yǎng)能力弱，氣孔多且不易關閉、葉綠素少、根毛少。移栽前煉苗則是為了逐步改變其生長條件使其組織發(fā)育完全，以適應外界環(huán)境。