李 瑩 周 燏 孫蕾清 周忠海 呂小婷 徐 明 李 昳 劉軍權(quán)
(解放軍第九七醫(yī)院生物治療中心,徐州221004)
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金絲桃苷增強(qiáng)人γδT細(xì)胞增殖及殺傷功能研究①
李 瑩 周 燏②孫蕾清 周忠海 呂小婷 徐 明③李 昳④劉軍權(quán)
(解放軍第九七醫(yī)院生物治療中心,徐州221004)
目的:研究金絲桃苷對(duì)人γδT細(xì)胞增殖及功能的影響。方法:以異戊烯焦磷酸法體外擴(kuò)增人外周血γδT細(xì)胞。用不同濃度的金絲桃苷處理,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。LDH法檢測(cè)金絲桃苷對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU-145的殺傷活性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理前后γδT 細(xì)胞上穿孔素、顆粒酶、CD107a、IFN-γ的表達(dá)情況。結(jié)果:異戊烯焦磷法能在體外成功培養(yǎng)出高純度的 γδT細(xì)胞。金絲桃苷在μg/ml范圍內(nèi)可顯著促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖。金絲桃苷作用于γδT 細(xì)胞后殺傷DU-145的能力明顯增強(qiáng),且在3.13~12.5μg/ml濃度時(shí) γδT 細(xì)胞上顆粒酶、穿孔素、IFN-γ的表達(dá)顯著升高,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞上CD107a的表達(dá)無(wú)明顯影響。結(jié)論: 金絲桃苷通過(guò)增強(qiáng)γδT細(xì)胞上顆粒酶、穿孔素、IFN-γ的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)其殺傷DU-145的作用。
金絲桃苷;γδT細(xì)胞;DU-145;殺傷功能
金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷,是一種從天然植物中提取的黃酮醇苷類化合物,廣泛存在于各種植物體內(nèi),如金絲桃科、薔薇科、桔梗科等果實(shí)與全草中。以往的研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷具有多種藥理活性,如抗炎[1]、抗肝損傷[2]、抗血栓[3]、體外抗腫瘤[4-6]并增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能,而且?guī)缀鯚o(wú)毒副作用[7]等。γδT主要分布于小腸、皮膚等黏膜組織,是臨床常用的重要免疫效應(yīng)細(xì)胞之一。目前關(guān)于金絲桃苷對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞的作用鮮有報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)旨在研究金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞增殖及殺傷功能的影響,以期為金絲桃苷的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 金絲桃苷(Hyperoside,上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%);FITC標(biāo)記的anti-TCR-gamma-delta、PE標(biāo)記的穿孔素(Perforin)和顆粒酶(GranB)、APC標(biāo)記的CD-107a、Fix&Perm破膜劑、PE-IgG1、APC- IgG1均購(gòu)自eBioscience公司;APC標(biāo)記的IFN-γ購(gòu)自美國(guó)BD公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;重組人白細(xì)胞介素2(rhIL-2)購(gòu)自廈門特寶生物工程股份有限公司;異戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate,IPP),RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自Gibco公司;人AB型血漿購(gòu)自徐州市血站。人前列腺癌細(xì)胞株DU-145購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。
1.2 γδT細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 取健康志愿者外周抗凝血20 ml,常規(guī)分離得到單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),將PBMC置于含100 ml/L小牛血清、50 ml/L AB血清、異戊烯焦磷酸(2 μg/L)和rhIL- 2(100 U /ml)的RPMI1640培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,用anti-TCR-gamma-delta-FITC標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞比例。
1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取培養(yǎng)10 d的γδT細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1 × 109L-1,以180 μl接種于96孔板中,并加入金絲桃苷20 μl(終濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.6、0.8、0.4、0.2 μg/ml),同時(shí)設(shè)0.5%DMSO溶媒對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)68 h后每孔加入CCK-8 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后于450nm處測(cè)定光密度值(OD )。
1.4 LDH法檢測(cè)殺傷活性 以乳酸脫氫酶法檢測(cè)γδT細(xì)胞的殺傷活性[8]。將金絲桃苷 50、12.5、3.13、0.8、0.2 μg/ml濃度處理72 h的γδT細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU-145細(xì)胞做為靶細(xì)胞,按效靶比10∶1的比例將兩者混合,同時(shí)設(shè)單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞孔、單獨(dú)靶細(xì)胞孔,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,離心收集上清在全自動(dòng)生化分析儀340nm處測(cè)定吸光值(A),按下式計(jì)算殺傷活性。殺傷活性(%)=[(實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔A值)/(靶細(xì)胞最大釋放孔A值-靶細(xì)胞自然釋放孔A值)]×100%。
1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞上顆粒酶、穿孔素、CD107a和IFN-γ的表達(dá) 將γδT細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度,以每孔1× 106個(gè)/3 ml接種至6孔板內(nèi),加入金絲桃苷(終濃度為50、12.5、3.13、0.8、0.2 μg/ml),同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照組,每組3個(gè)復(fù)孔,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞洗滌,檢測(cè)CD107a和IFN-γ的試管內(nèi)分別加入FITC-anti-TCR-gamma-delta、APC-CD107a和FITC-anti-TCR-gamma-delta、APC-IFN-γ,避光孵育15 min,PBS洗滌2次,棄上清,0.5 ml PBS重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)。測(cè)顆粒酶或穿孔素的管內(nèi),加入FITC-anti-TCR-gamma-delta避光孵育10 min,再加入固定液孵育15 min,PBS洗滌,棄上清,加入破膜劑、PE-GranB或PE -Perforin,避光孵育15 min,PBS洗滌2次,棄上清,0.5 ml PBS重懸,上機(jī)檢測(cè)。
2.1 人γδT細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 取培養(yǎng)10d的γδT細(xì)胞顯微鏡下觀察,可見(jiàn)大的細(xì)胞集落,單個(gè)細(xì)胞呈條梭狀。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),γδT細(xì)胞的比例可達(dá)91.3%,提示γδT細(xì)胞培養(yǎng)成功。見(jiàn)圖1。
2.2 金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞增殖的影響 由圖2可看出,金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞增殖有一定的影響,在較低濃度(0.2~1.6μg/ml)時(shí),金絲桃苷對(duì)細(xì)胞增殖影響不明顯。在3.13~12.5μg/ml濃度范圍內(nèi)可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著濃度的不斷升高,金絲桃苷對(duì)細(xì)胞增殖出現(xiàn)抑制,在100μg/ml濃度時(shí)與對(duì)照組相比有顯著性差異,因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,選擇了0.2~50μg/ml的濃度范圍。
圖1 培養(yǎng)前后γδT細(xì)胞比例Fig.1 Proportion of γδT cells before and after culture
圖2 金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞增殖影響Fig.2 Effect of Hyperoside on γδT cells proliferationNote: *.P<0.05,VS 0 group.
圖3 金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞殺傷功能的影響Fig.3 Cytotoxicity of γδT cells treated by Hyperoside Note: *.P<0.05,**.P<0.01 VS 0 group.
圖4 金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞上顆粒酶表達(dá)的影響Fig.4 Expression of GranB on γδT cells after treated by HyperosideNote: A.The expression of GranB on γδT cells after treated by Hyperoside;B1.Isotype control;B2.0 group;B3.Hyperoside 12.5 μg/ml;*.P<0.05 VS 0 group.
圖5 金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞上穿孔素表達(dá)的影響Fig.5 Expression of Perforin on γδT cells after treated by HyperosideNote: A.The expression of Perforin on γδT cells after treated by Hyperoside;B1.Isotype control;B2.0 group;B3.Hyperoside 12.5 μg/ml;*.P<0.05 VS 0 group.
圖6 金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞上CD107a表達(dá)的影響Fig.6 Expression of CD107a on γδT cells after treated by HyperosideNote: A.The expression of CD107a on γδT cells after treated by Hyperoside;B1.Isotype control;B2.0 group;B3.Hyperoside 12.5 μg/ml.
圖7 金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞上IFN-γ表達(dá)的影響Fig.7 Expression of IFN-γ on γδT cells after treated by HyperosideNote: A.The expression of IFN-γ on γδT cells after treated by Hyperoside;B1.Isotype control;B2.0 group;B3.Hyperoside 12.5 μg/ml;*.P<0.05 VS 0 group.
2.3 殺傷活性檢測(cè)結(jié)果 金絲桃苷作用于γδT細(xì)胞72h后,對(duì)DU-145的殺傷活性有一定程度的提高,在12.5μg/ml濃度時(shí)殺傷活性最強(qiáng),與對(duì)照組相比有顯著性差異。見(jiàn)圖3。
2.4γδT細(xì)胞上顆粒酶、穿孔素、CD107a、IFN-γ的表達(dá)結(jié)果 經(jīng)金絲桃苷處理72h后,γδT細(xì)胞上顆粒酶、穿孔素、IFN-γ的表達(dá)都有一定改變,在12.5μg/ml濃度下,三者的表達(dá)都顯著高于對(duì)照組。金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞上CD107a的表達(dá)影響不明顯。見(jiàn)圖4~7。
目前有關(guān)金絲桃苷的抗腫瘤作用成為研究的熱點(diǎn)。金絲桃苷不僅能在體外抑制多種腫瘤細(xì)胞株增殖,還能在體內(nèi)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。黃凱等[9]研究初步發(fā)現(xiàn)給予正常小鼠12.5mg/kg金絲桃苷即可增強(qiáng)其非特異性和特異性免疫。王麗敏[10]的研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷在小劑量(1.5mg/kg)時(shí)就對(duì)荷瘤小鼠有抑瘤作用,隨著劑量增加抑瘤效果逐漸提高,最高可達(dá)約65%。
然而金絲桃苷對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞的作用還少有報(bào)道,我們之前報(bào)道過(guò)金絲桃苷增強(qiáng)共刺激細(xì)胞殺傷胃癌的研究[11],本課題主要研究金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞增殖及功能的影響。γδT細(xì)胞主要分布于皮膚、小腸、食道等黏膜上皮內(nèi),在免疫調(diào)節(jié)、免疫監(jiān)視中起關(guān)鍵作用,因此也是腫瘤生物治療中常用的免疫效應(yīng)細(xì)胞。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在3.13~12.5μg/ml濃度范圍內(nèi)金絲桃苷可顯著促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖,隨著濃度增加則抑制細(xì)胞增殖,因此選擇0.2~50.0μg/ml濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在殺傷實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)金絲桃苷預(yù)處理過(guò)的γδT細(xì)胞對(duì)前列腺癌DU-145的殺傷能力較未處理組明顯增強(qiáng),在12.5μg/ml時(shí)達(dá)峰值。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證γδT細(xì)胞的殺傷功能的改變,我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了處理前后γδT細(xì)胞上與其特異性殺傷活性密切相關(guān)的成分穿孔素、顆粒酶、CD107a及INF-γ的表達(dá)情況。穿孔素是存在于CTL、NK和γδT細(xì)胞胞質(zhì)中的細(xì)胞毒顆粒。當(dāng)這些細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸后可釋放穿孔素, 在靶細(xì)胞膜上形成多聚穿孔素管狀通道,導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解[12]。顆粒酶B是CTL和NK細(xì)胞顆粒中最重要的絲氨酸蛋白酶,可以進(jìn)入靶細(xì)胞,激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而迅速引起靶細(xì)胞DNA的斷裂,導(dǎo)致快速的細(xì)胞凋亡[13]??乖禺愋訲細(xì)胞表面的CD107a分子,與抗原特異性細(xì)胞活化以后的脫顆粒過(guò)程密切相關(guān),可能是CTL脫顆粒以后,細(xì)胞溶解性顆粒的胞膜與T細(xì)胞膜融合所致[14]。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生,具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用[15]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)金絲桃苷能明顯提高γδT細(xì)胞上顆粒酶、穿孔素和IFN-γ表達(dá),分別從73.39%、60.15%、73.6%提高至83.84%、76.81%、83.8%,而對(duì)CD107a的表達(dá)無(wú)明顯影響。
綜上所述,本課題初步研究了金絲桃苷對(duì)γδT細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)金絲桃苷在一定濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖,并增強(qiáng)其殺傷能力,以期為金絲桃苷的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。
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[收稿2015-06-25 修回2015-07-29]
(編輯 倪 鵬)
Enhancement of γδT cells proliferation and cytotoxicity by Hyperoside
LI Ying,ZHOU Yu,SUN Lei-Qing,ZHOU Zhong-Hai,Lü Xiao-Ting,Xu Ming, LI Yi,LIU Jun-Quan.Biological Therapy Center,the 97 Hospital of Chinese PLA,Xuzhou 221004,China
Objective:To investigate the anti-tumor effect of Hyperoside.Methods: Human γδT cells were amplified by isopentenyl pyrophosphate from peripheral blood cells.The proliferation capacity of γδT cells was measured with CCK-8 assay after treated with different concentrations of Hyperoside.Cytotoxicity of γδT cells was detected with LDH assay,and the expression of granzyme,perforin CD107a and IFN-γ on γδT cells were measured by flow cytometry before and after treatment.Results: Hyperoside could significantly stimulate the proliferation of γδT cells at the concentration of 3.13-12.5 μg/ml.Cytotoxicity and expression of granzyme,perforin and IFN-γ of γδT cells were increased after treatment.Conclusion: Hyperoside could enhance cytotoxicity of human γδT cells through up-regulation of granzyme,perforin CD107a and IFN-γ expression.
Hyperoside;γδT cells;DU-145 cell;Cytotoxicity
10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.016
①本文為南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題(11MA040)資助項(xiàng)目。
李 瑩(1986年-),女,護(hù)師,主要從事護(hù)理工作,E-mail:115530179@qq.com。
及指導(dǎo)教師:劉軍權(quán)(1960年-),男,副主任技師,主要從事腫瘤生物治療研究,E-mail:595716758@qq.com。
R979.5
A
1000-484X(2016)04-0524-04
②并列第一作者。
③解放軍第九七醫(yī)院干部病房,徐州221004。
④解放軍第九七醫(yī)院檢驗(yàn)科,徐州221004。