李紅林 鄧之奎 鄭云會 劉艷秋 劉小寧 楊士軍 陸衛(wèi)軍 高美華

(南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院，淮安223300)

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Graves病患者外周血中Th17細胞及相關細胞因子的表達

李紅林 鄧之奎 鄭云會 劉艷秋 劉小寧 楊士軍 陸衛(wèi)軍 高美華①

(南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院，淮安223300)

目的：研究Graves病患者外周血中Th17細胞及IL-17、IL-23的表達水平并探討其臨床意義。方法：用流式細胞儀檢測29例Graves病患者治療前后(GD組，GD緩解組)和29名健康對照者(NC組)外周血PBMC中CD4+IL-17+T細胞比例,用ELISA法檢測血清中IL-17和IL-23濃度，用電化學發(fā)光法檢測血清游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)水平，用放射受體分析法測定抗促甲狀腺激素受體抗體(TrAb)水平。結果：3組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義(F=0.007 5，P>0.05；χ2=0.4213，P>0.05)。GD組和GD緩解組Th17比例、IL-17、IL-23的水平顯著高于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。GD緩解組的Th17比例、IL-23濃度顯著低于GD組，但GD緩解組IL-17濃度與GD組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Th17比例、IL-17、IL-23與FT3、FT4、TrAb均呈正相關(r值依次為：0.588 2、0.337 2、0.371 0；0.549 6、0.287 5、0.342 7；0.361 0、0.420 8、0.330 8；P均<0.05)。Th17比例、IL-17、IL-23與TSH均呈負相關(r值依次為-0.319 7、-0.472 8、-0.428 2；P均<0.05)。結論：Th17細胞及其相關細胞因子IL-17、IL-23在GD患者外周血中均高表達；并與GD患者的甲功4項指標具有不同程度的相關性。Th17細胞及相關細胞因子IL-17、IL-23能夠作為GD的生物學標記物。

Graves病；Th17細胞；IL-17；IL-23/IL-17炎癥軸

格雷夫斯病(Graves disease,GD)是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，以甲狀腺彌漫性增大和功能亢進為主要特征，并可引起全身多系統(tǒng)高代謝表現(xiàn)[1]。近年來，隨著人們生活壓力的加大和全民食用加碘鹽的普及，GD的患病率具有增加趨勢[2]，且25%～50%的GD患者會發(fā)展成Graves眼病，嚴重威脅著人類的健康。GD的發(fā)病機制目前尚不完全明確。曾有研究表明GD的發(fā)生與Th1和Th2細胞的免疫平衡失調有關[3]，但最近研究表明，Th17細胞也參與了導致GD發(fā)病的免疫紊亂過程[3]。IL-23是誘導Th17細胞分化成熟的促進因子[4]，IL-17則是Th17細胞的特征性細胞因子和主要效應因子[5]，它們一起組成了以Th17細胞為核心的IL-23/IL-17免疫炎癥軸，通過募集巨噬細胞和中性粒細胞到達炎癥部位，促進炎癥反應。本文就GD患者治療前后外周血中Th17細胞和IL-17、IL-23的表達水平變化情況及其與甲狀腺功能指標間的關系進行了研究，以探討在GD發(fā)病期間IL-23/IL-17炎癥軸所起的作用，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選自2013年3月至2015年2月在淮安市第一人民醫(yī)院就診或體檢的人員。參照《中國甲狀腺疾病診治指南》[1]內容將其分成3組：(1)GD初診組(GD組)29例(男10例，女19例)，平均年齡(40.7±15.0)歲；均為未經治療且初次診斷為GD的患者；(2)GD治療緩解組(euthyroid GD group,eGD組)29例；為上述初診的GD組患者經甲巰咪唑正規(guī)治療3～9個月后，臨床癥狀明顯緩解，F(xiàn)T3、FT4水平恢復正常者。(3)健康對照組(NC組)29例(男8例，女21例)，平均年齡(41.1±7.2)歲；為同期的健康體檢者，無甲狀腺疾病史和家族史、無甲亢癥狀和體征、甲狀腺功能正常、自身抗體檢測結果均為陰性。所有研究對象均未使用激素、免疫抑制劑等藥物；并排除妊娠、感染、腫瘤、過敏性疾病、肝腎功能異常及其他自身免疫性疾病。

1.2 方法

1.2.1 儀器試劑 Th17細胞檢測采用美國BD公司FACSCanto II流式細胞儀及流式結果分析系統(tǒng)；RPMI1640培養(yǎng)液、Hank′s 液購自Gibco公司,CD45-PerCP-cy5.5單克隆抗體、抗人CD4-FITC單克隆抗體、抗人APC-IL-17A單克隆抗體、核內染色用固定破膜劑等均購自BD公司，佛波酯、離子霉素、莫能霉素均購自Sigma公司。檢測IL-17、IL-23濃度用ELISA法,試劑盒由美國RB(Rapidbio)公司提供，儀器采用北京普朗公司的DNM-9602型酶標儀；檢測FT3、FT4和TSH水平用電化學發(fā)光法，儀器采用Roche公司生產的 E170 模塊型電化學發(fā)光免疫分析儀，試劑為專用配套試劑；檢測TrAb水平用放射受體分析法，德國ME-DIPANDIACNOSTICA公司提供試劑盒,儀器用中國科大中佳公司GC-911型γ免疫計數(shù)儀。所有操作均嚴格按產品說明書進行。

1.2.2 標本采集及處理 收集研究對象的臨床數(shù)據(jù)，并用EDTA-K2真空采血管采集靜脈血2 ml，混勻，于常溫環(huán)境中2 h內提取外周血單個核細胞(PBMC)供流式細胞學檢測，另用促凝真空管抽取靜脈血5 ml，2 500 r/min 20 min，分離血清后立即檢測FT3、FT4、TSH和TrAb等指標，然后將血清標本分裝于EP管中，密封置-20℃冰箱保存，以備用ELISA法成批檢測各種細胞因子。

1.2.3 Th17細胞檢測 用RPMIl640培養(yǎng)液重懸PBMC并調整細胞密度為2.5×1010L-1；然后以每孔1 ml接種于24孔板，并分別加入佛波酯25 ng/ml、離子霉素1 μg/ml、莫能霉素300 μg/L；放37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱5小時；收集細胞并調整細胞濃度后分裝于測定管和對照管；分別加入CD45-PerCP-cy5.5單克隆抗體,CD4-FITC單克隆抗體和IgG1-FITC抗體對細胞染色；用抗人APC-IL-17A單克隆抗體對細胞內因子進行染色，采用流式細胞儀檢測分析CD4+IL-17+(Th17細胞)占CD4+細胞比例。

2 結果

2.1 性別、年齡和甲狀腺功能比較 研究組的性別和年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GD組的FT3、FT4和TrAb水平均顯著高于NC組和eGD組(P<0.05)，TSH濃度顯著低于NC組和eGD組(P<0.05)。eGD組的FT3、FT4濃度與NC組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但TSH濃度顯著低于NC組、TrAb濃度則顯著高于NC組(P<0.05)(見表1)。

2.2Th17細胞及IL-17、IL-23的比較GD組和eGD組的Th17比例、IL-17、IL-23濃度均顯著高于NC組(P<0.05)；eGD組的Th17比例、IL-23濃度顯著低于GD組，但eGD組IL-17濃度與GD組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2，圖1。

表1 各研究組的一般資料比較

Tab.1 Comparison with general information among three study groups

GroupsNCgroupGDgroupeGDgroupGenders(M/F)8/2110/19Age(year)41.1±7.240.7±15.0FT3(pmol/L)4.75±0.6919.46±8.901)5.28±1.992)FT4(pmol/L)12.30±2.6749.71±22.681)12.42±4.442)TSH(mU/L)1.79±0.380.02±0.021)1.08±1.401)2)TrAb(U/L)1.49±0.5021.16±13.221)9.11±5.831)2)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05；compared with GD group,2)P<0.05.

圖1 各研究組外周血中Th17細胞表達的代表性流式細胞圖Fig.1 Representative flow cytometric graphs of Th17 cells in each research group

圖2 外周血中甲功4項指標與IL-17/IL-23炎癥軸3項指標的相關性Fig.2 Correlation between 4 thyroid function items and 3 IL-17/IL-23 axis items

表2 外周血Th17細胞比例和IL-17、IL-23水平比較

Tab.2 Difference of proportion of peripheral Th17 cells and plasma concentrations of IL-17 and IL-23 among three study groups

GroupsNCgroupGDgroupeGDgroupCD4+IL-17+lymphocytes(%)0.65±0.221.34±0.511)1.04±0.211)2)IL-17(pg/ml)583.77±155.86841.35±124.671)798.52±116.451)IL-23(pg/ml)825.73±127.362054.15±759.161)1659.55±726.871)2)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05；compared with GD group,2)P<0.05.

2.3 相關性分析 采用Spearman分析各檢測指標間的雙變量相關性:外周血中的Th17比例、IL-17、IL-23水平與血清中TSH濃度均呈顯著負相關(P均<0.05)，與FT3、FT4、TrAb水平均呈顯著正相關(P均<0.05)。詳見圖2。

3 討論

GD是由于靶器官甲狀腺發(fā)生特異性自身免疫反應而發(fā)生一種疾病，其主要特征是患者甲狀腺組織中出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤和血清中出現(xiàn)TrAb等自身免疫性抗體。Th17細胞是在實驗建立自身免疫性腦脊髓炎和膠原誘導性關節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn)的一種全新的CD4+T淋巴細胞亞型[5]。它由細胞因子IL-6和TGF-β共同啟動分化發(fā)育[6]，然后由IL-23誘導分化成熟并產生效應因子IL-17；同時由IFN-γ、IL-4等負向調控分化過程[7]。研究報道Th17細胞分化成熟過程中的相關細胞因子IL-6、TGF-β1、IFN-γ和IL-17等在發(fā)病初期的GD患者血清中均高表達[8]。本文結果顯示Th17細胞在治療前的初發(fā)GD患者外周血中水平也顯著高于正常對照組，與王玫等研究結果相似[9]；患者經治療緩解后，Th17細胞表達水平顯著下降，但仍高于正常對照組。相關性分析顯示，Th17細胞與FT3、FT4、TrAb均呈正相關，與TSH均呈負相關。上述內容均提示Th17細胞可能參與GD的病變過程，并與病變程度有關。

IL-23由p19和IL-12的p40亞基以二硫鍵形式連接而成，是IL-12細胞因子家族的新成員。主要由活化的B細胞和單核巨噬細胞產生。IL-23通過結合靶細胞表面的IL-23R，剌激STAT4的磷酸化，促進CD4+T細胞增殖、維持Th17細胞活性、并誘導Th17細胞分泌IL-6、TNF-α、IL-17A、IL-17F等細胞因子，形成IL-23/IL-17炎癥軸。其中IL-17是Th17細胞的特征性細胞因子，也是一個較強的促炎性細胞因子，具有刺激人成纖維細胞表達細胞間黏附分子-1(ICAM-1)，募集巨噬細胞和中性粒細胞到達甲狀腺炎癥部位，并通過MAPKs激酶途徑、核轉錄因子C/EBPs和kB(Nuclear factor κB，NF-κB)等途徑促進T淋巴細胞和中性粒細胞的分化增殖、成熟、活化[10]，介導炎癥反應。

本文結果顯示IL-17、IL-23在治療前的初發(fā)GD患者外周血中水平均顯著高于正常對照組；患者經治療緩解后，IL-23的表達顯著下降，但仍高于正常對照組，而IL-17的表達水平在治療前后則沒有顯著性變化，與Zheng L等報道的結果相一致[11]。相關性分析顯示，IL-17、IL-23與FT3、FT4、TrAb均呈正相關，與TSH均呈負相關，與馬學芹等報道的結果相一致[12]。提示以Th17細胞為核心的IL-23/IL-17免疫炎癥軸可能也參與了GD的發(fā)病過程，并通過加重甲狀腺局部炎癥反應，誘導體液免疫過程中自身抗體的產生，促進GD病程的發(fā)展。經有效治療后，IL-23的表達減少，可能抑制了Th17細胞的分化和IL-17的致炎作用，機體的甲狀腺激素和自身抗體水平均得以緩解。

綜上所述，Th17細胞及其相關細胞因子IL-17、IL-23等在治療前后的GD患者外周血中均高表達；并與GD患者外周血中的甲功4項指標具有不同程度的相關性。據(jù)此推測Th17細胞及相關細胞因子IL-17、IL-23可能在GD病變過程發(fā)揮重要作用，并與病變程度密切相關；IL-23/IL-17炎癥軸有望成為GD免疫治療的新靶點。

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[收稿2015-06-30 修回2015-10-22]

(編輯 許四平)

Expression of Th17 cells and related cytokines in peripheral blood of patients with Graves′ disease

LI Hong-Lin,DENG Zhi-Kui,ZHENG Yun-Hui,LIU Yan-Qiu,LIU Xiao-Ning,YANG Shi-Jun，LU Wei-Ping，GAO Mei-Hua.Huai′an First Hospital，Nanjing Medical University，Huai′an 223300，China

Objective:To explore the proportions of Th17 cells in the peripheral blood and levels of IL-17,IL-23 in the serum of patients with Graves′ disease(GD)and their clinical significance.Methods: We studied 29 patients with GD(GD group),and reevaluated the GD group after therapy(euthyroid GD group).29 gender-and age-matched volunteers were selected as the normal control(NC group).The proportions of Th17 cells were investigated by flow cytometry.The levels of IL-23，IL-17 in the serums were measured by ELISA.The levels of FT3,FT4,TSH were determined by ECLIA and the levels of TrAb were tested by RRA.Results: There were no significant difference among 3 study groups in sex and age match(F=0.0075,P>0.05;χ2= 0.4213,P>0.05).The proportions of Th17 cells and the levels of IL-17,IL-23 were increased in the GD and euthyroid GD patients compared with the control group(respectively，P<0.05).The proportions of Th17 cells and the concentrations of IL-23 in euthyroid GD group were significantly lower than those of GD group(respectively，P<0.05),but there were no significance in the concentrations of IL-17 between euthyroid GD group and GD group(P>0.05).Correlation analysis revealed that the proportions of Th17 cells ,and the levels of IL-17,IL-23 were positively correlated with the levels of FT3,FT4,TrAb(r=0.588 2,0.337 2,0.371 0；0.549 6,0.287 5,0.342 7；0.361 0,0.420 8,0.330 8；P<0.05，for all parameters),and were negatively correlated with the levels of TSH(r=-0.319 7,-0.472 8,-0.428 2；P<0.05，for all parameters).Conclusion: Th17 cells and their related cytokines IL-17,IL-23 are highly expressed in the serum of patients with GD.Th17 cells and their relative cytokines have certain relevance with 4 thyroid function parameters of the patients with GD ,which can be used as biological markers for GD.

Graves′ disease;Th17 cell;Interleukin-17;IL-23/IL-17 axis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.025

李紅林(1980年-)，男，醫(yī)學碩士，主管檢驗師，主要從事自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)病機制研究，E-mail:hayylhl@163.com。

及指導教師：高美華(1953年-)，女，教授，博士生導師，教研室主任，主要從事分子免疫學研究，E-mail:meihuagao66@163.com。

R446.62

A

1000-484X(2016)04-0563-04

①青島大學醫(yī)學院免疫學教研室,青島266071。