崔辰，黃立綱，李晶，鄒興啟，朱元源，謝磊，趙啟祖，楊利敏，劉文軍

1 中國科學院微生物研究所 病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101 2 中國科學院大學，北京 100049 3 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081 4 清華大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，北京 100016 5 北京市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，北京 100044

Chen Cui1,2*, Ligang Huang4*, Jing Li1, Xingqi Zou3, Yuanyuan Zhu3, Lei Xie5, Qizu Zhao3, Limin Yang1, and Wenjun Liu1

1 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China 4 Department of Clinical Laboratory, First Hospital of Tsinghua University, Beijing 100016, China 5 Beijing Animal Health Inspection Institute, Beijing 100044, China

動物及獸醫(yī)生物技術

豬O型口蹄疫病毒抗體化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

崔辰1,2*，黃立綱4*，李晶1，鄒興啟3，朱元源3，謝磊5，趙啟祖3，楊利敏1，劉文軍1

1 中國科學院微生物研究所 病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101 2 中國科學院大學，北京 100049 3 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081 4 清華大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，北京 100016 5 北京市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，北京 100044

崔辰, 黃立綱, 李晶, 等. 豬O型口蹄疫病毒抗體化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法的建立. 生物工程學報, 2016, 32(11): 1519-1530.

Cui C, Huang LG, Li J, et al. Establishment of chemiluminescent enzyme immunoassay for detecting antibodies against foot-and-mouth disease virus serotype O in swine. Chin J Biotech, 2016, 32(11): 1519-1530.

表達并純化豬O型口蹄疫病毒 (FMDV) VP1重組蛋白作為檢測抗原，建立了一種快速檢測豬O型口蹄疫病毒抗體的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫 (CLEIA) 檢測方法。建立的VP1-CLEIA方法特異性為100%，板內(nèi)變異系數(shù)在1.10%-6.70%之間，板間變異系數(shù)在0.66%-4.80%之間，具有較好的特異性和重復性，且靈敏度高于ELISA方法。通過對山東、遼寧、河北地區(qū)采集的250份臨床血清的檢測表明，該方法與間接ELISA試劑盒的符合率為93.50%，與液相阻斷ELISA試劑盒的符合率為94.00%，表明本次建立的VP1-CLEIA檢測方法可以用于豬O型FMDV感染或疫苗免疫后抗體水平檢測。

O型口蹄疫病毒，VP1蛋白，化學發(fā)光酶聯(lián)免疫

Chen Cui1,2*, Ligang Huang4*, Jing Li1, Xingqi Zou3, Yuanyuan Zhu3, Lei Xie5, Qizu Zhao3, Limin Yang1, and Wenjun Liu1

1 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China 4 Department of Clinical Laboratory, First Hospital of Tsinghua University, Beijing 100016, China 5 Beijing Animal Health Inspection Institute, Beijing 100044, China

口蹄疫 (Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD) 是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV) 引起的偶蹄動物急性、熱性、高度接觸性傳染病，傳播迅速、感染率高[1]。FMDV主要通過呼吸道和消化道傳播，僅數(shù)個感染性病毒粒子便可引起易感動物發(fā)病，甚至造成世界性的大流行，給畜牧業(yè)帶來極其嚴重的經(jīng)濟損失，因此FMDV是世界各國檢疫和防疫的重點對象[2]。FMDV有7個血清型，分別為O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型，其中O型、A型和Asia1型在中國交替流行，且涉及面廣、疫情復雜、破壞性強[3]。目前我國預防和控制口蹄疫主要以疫苗免疫為主，但FMDV的血清型眾多，不同亞型的疫苗之間無交叉保護作用，且國內(nèi)外口蹄疫疫苗質(zhì)量參差不齊，因此建立一種簡便、快速、靈敏度高的FMDV感染和/或免疫后抗體檢測方法對預防和控制口蹄疫的發(fā)生和流行具有十分重要的意義。

目前FMDV的檢測方法主要分為3類，包括血清學診斷技術、生物學試驗和分子生物學診斷技術。在血清學診斷技術中，世界動物衛(wèi)生組織 (World animal health organization，OIE)推薦的檢測FMDV抗體的標準方法為中和試驗以及液相阻斷ELISA (LPBE)，其中血清中和試驗需要使用活病毒，在普通實驗室難以完成[4]。液相阻斷ELISA可以用于替代中和試驗檢測血清中產(chǎn)生的相應的保護性抗體[5]，但同樣操作費時。以滅活病毒作為抗原建立的間接ELISA方法與上述兩種方法相比，具有靈敏、快速、操作簡便等優(yōu)點[6]，但此方法存在病毒滅活不全的風險以及病毒純化較為困難的問題[7]。為降低病毒傳播風險且不影響病毒的抗原性，使用原核表達系統(tǒng)或桿狀病毒系統(tǒng)表達病毒的重組結(jié)構(gòu)蛋白，并將其作為檢測抗原是目前的主要研究方向[8]。宋妮等[9]采用原核表達的重組結(jié)構(gòu)蛋白作為包被抗原建立的豬O型FMDV間接ELISA檢測方法，通過對200份田間血清樣品的檢測表明，此方法與液相阻斷ELISA的符合率為97%，具有較好的特異性和敏感性。

化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測 (Chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA) 是將化學發(fā)光體系與ELISA技術相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術，其基本原理是化學發(fā)光底物分子在酶的催化下，吸收氧化反應中的能量躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回基態(tài)時會產(chǎn)生光，稱為化學發(fā)光[10]?；瘜W發(fā)光的強度與反應物或產(chǎn)物的濃度成正比，因此可以通過測量發(fā)光強度，繪制標準曲線來測量待測物的濃度，實現(xiàn)定量分析[11]。與普通間接ELISA檢測方法相比，CLEIA同樣具有操作簡便、特異性高的優(yōu)勢，且其靈敏度和精確度均優(yōu)于普通ELISA，并且由于CLEIA最后測定的是光子的量，對檢測者無害、檢測范圍廣，還能夠定量檢測，是理想的標記免疫測定方法[12-13]。CLEIA已被歐盟列為牛海綿樣腦病的快速檢測方法之一。Buschmann等[14]于2004年使用間接ELISA、夾心ELISA、Eastern blotting及CLEIA四種方法檢測312份綿羊海綿樣腦病標準陽性血清樣本，其中CLEIA的檢出率幾乎可達100%，而其他3種方法的檢出率只有80%左右。CLEIA由于較ELISA方法靈敏度和精確度更高，因此已被廣泛應用于腫瘤標記物檢測、糖尿病、心臟病、高血壓、艾滋病以及食品安全檢測，但是在動物疫病檢測領域，國內(nèi)尚未見報道。

FMDV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約8.5 kb，編碼組成病毒衣殼的蛋白為4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4以及10種成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白 (L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D及3AB和3ABC復合體)[15]。在FMDV的4種結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1攜帶引發(fā)宿主細胞對FMDV免疫反應的關鍵性抗原表位，暴露于病毒粒子表面，單獨的VP1蛋白即可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，是ELISA中有效的目標抗原[16]。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定，O型FMDV的VP1結(jié)構(gòu)蛋白ELISA檢測方法不僅可以用來檢測病毒感染后動物體內(nèi)抗體水平，還可以用于疫苗免疫后抗體水平的監(jiān)測。我國現(xiàn)有的口蹄疫疫苗大部分為滅活疫苗，其經(jīng)過一系列的制備過程后，最終的純化濃縮抗原中只包含病毒部分結(jié)構(gòu)蛋白，而除3D之外的大部分非結(jié)構(gòu)蛋白已被去除[17]。動物經(jīng)口蹄疫疫苗免疫后，體內(nèi)會產(chǎn)生大量針對結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。因此為建立一種快速、安全的豬O型FMDV抗體檢測方法，本試驗以原核表達的VP1重組蛋白作為抗原，初步建立了豬O型FMDV抗體CLEIA檢測方法，其靈敏度優(yōu)于目前的ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 重組質(zhì)粒、菌株

包含豬O型FMDV VP1基因的重組質(zhì)粒pET-28a-VP1由本實驗室構(gòu)建并保存；大腸桿菌Rosetta (DE3) 由本實驗室保存。

1.1.2 主要儀器和試劑

化學發(fā)光免疫分析儀購自北京泰格科信有限公司；HRP-羊抗豬IgG酶標二抗購自Earthox公司；SuperSignal ELISA Femto Luminol/Enhancer Solution購自Thermo Scientific公司；O型口蹄疫間接血凝抗體檢測試劑盒、O型口蹄疫病毒抗體液相阻斷ELISA試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所；豬O型口蹄疫ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 血清

豬O型FMDV標準陽性血清由中國蘭州獸醫(yī)研究所惠贈；豬A型FMDV陽性血清、豬Asia 1型FMDV陽性血清、豬O型FMDV陰性血清、豬偽狂犬病毒陽性血清、豬瘟病毒陽性血清、豬細小病毒陽性血清和豬圓環(huán)病毒陽性血清由本實驗室保存；250份臨床豬血清采集自山東、遼寧和河北等地。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a-VP1重組蛋白的純化、表達和復性

將pET-28a-VP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至含終濃度為30 μg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600在0.6?0.8之間，取出少量誘導前全菌作為對照，在剩余培養(yǎng)物中加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，37 ℃誘導過夜。超聲破碎菌體后分別收集上清及沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，鑒定目的蛋白的表達。收集超聲后沉淀，使用Ni-NTA樹脂親和層析純化重組蛋白。SDS-PAGE電泳檢測純化效果。純化后蛋白透析復性，復性產(chǎn)物使用Bradford法[18]測定蛋白含量，500 μL/管分裝，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白最佳包被濃度的確定

純化后蛋白用碳酸鹽包被緩沖液 (pH 9.6)從1∶10開始倍比稀釋至1∶160，100 μL/孔加入化學發(fā)光板，4 ℃包被20 h。PBST洗滌，200 μL/孔，洗4次，每次3 min，拍干。加入3%酪蛋白(Casein)+1%蔗糖-PBST混合封閉液300 μL/孔，37 ℃封閉1 h。PBST洗滌，300 μL/孔，洗4次，每次3 min，拍干。豬O型FMDV標準陽性、陰性血清用封閉液1∶32稀釋后加入酶標板，100 μL/孔，37 ℃反應30 min。PBST洗滌，300 μL/孔，洗5次，每次3 min，拍干。HRP-羊抗豬IgG酶標二抗用封閉液1∶50 000稀釋后加入酶標板，100 μL/孔，37 ℃反應30 min。PBST洗滌，300 μL/孔，洗5次，每次3 min，拍干。加化學發(fā)光底物 (魯米諾)，100 μL/孔，避光顯色5 min。用化學發(fā)光免疫分析儀進行檢測，將P/N值最大時的抗原濃度作為最佳蛋白包被濃度。

1.2.3 最佳封閉條件的確定

以抗原最佳包被濃度包被酶標板，分別以3% BSA-PBST，1%明膠-PBST，10%新生牛血清-PBST，3%酪蛋白+1%蔗糖-PBST混合液封閉，并選用37 ℃封閉60、90和120 min三個時間梯度進行比較，使用化學發(fā)光底物顯色后，比較陽性血清和陰性血清的發(fā)光值，根據(jù)P/N比值確定最適合的封閉條件。操作過程同前。

1.2.4 酶標二抗工作濃度的確定

按已確定的最佳抗原包被濃度包被化學發(fā)光板，使用最佳封閉條件進行封閉，將HRP-羊抗豬IgG酶標二抗用封閉液稀釋為1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000和1∶40 000四個梯度，使用化學發(fā)光底物顯色，觀察顯色結(jié)果，確定最佳酶標二抗工作濃度。

1.2.5 判定標準的確定

取10份豬O型FMDV陰性血清進行CLEIA檢測，每份血清重復兩孔取平均值，操作過程同前，計算10份標準陰性血清化學發(fā)光值的平均值 (x1) 和標準差 (s1)。由于武漢科前生物生產(chǎn)的ELISA檢測試劑盒只制定了免疫合格的判定標準，未界定感染與否的陰陽血清判定標準，因此本實驗同時對該商品試劑盒的陰陽血清判定標準進行了界定。取10份豬O型FMDV陰性血清進行ELISA檢測，每份血清重復兩孔取平均值，按照試劑盒說明書進行操作，計算10份標準陰性血清的OD630平均值 (x2) 和標準差(s2)。根據(jù)統(tǒng)計學原則，待檢血清的化學發(fā)光值≥x1+2s1或OD630值≥x2+2s2時，則可以在99.9%的水平上判為陽性。因此將x1+2s1所得的值定為VP1-CLEIA方法陰陽性血清的界限，將x2+2s2的值確定為ELISA商品試劑盒的陰陽血清判定標準。

根據(jù)《2016年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃》的規(guī)定，豬只在接受O型FMDV滅活疫苗免疫后28 d，使用正向間接血凝試驗檢測血清中的抗體效價≥32，即可判定為免疫合格。本次建立的CLEIA檢測方法中，同時確定了是否免疫合格的判定標準。取10份經(jīng)正向間接血凝試驗判定抗體效價為1∶32的豬O型FMDV陽性血清進行CLEIA檢測，每份血清重復兩孔取其平均值，操作過程同前。計算10份標準血清化學發(fā)光值的平均值 (x3) 和標準差(s3)，將x3+2s3所得的值確定為是否免疫合格的界限。

1.2.6 特異性試驗

用建立好的CLEIA方法分別檢測豬偽狂犬病毒陽性血清、豬瘟病毒陽性血清、豬細小病毒陽性血清、豬圓環(huán)病毒陽性血清、豬A型FMDV陽性血清以及豬Asia 1型FMDV陽性血清，同時設豬O型FMDV陽性、陰性血清對照，觀察CLEIA方法的特異性以及交叉反應性。

1.2.7 靈敏度試驗

將已經(jīng)用正向間接血凝試驗標定好抗體效價的標準陽性血清 (1∶512) 用封閉液按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096的稀釋度進行稀釋，其余按最適反應條件進行檢測，判定標準采用1.2.5確定的陰陽性血清界定標準，觀察建立的CLEIA方法的敏感性。同時，用武漢科前生物生產(chǎn)的豬O型口蹄疫ELISA抗體檢測試劑盒進行平行檢測，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.2.8 重復性試驗

將重組蛋白以最佳濃度包被化學發(fā)光板，選取4份血清，每份血清重復4孔，按已建立的最適反應條件檢測，進行板內(nèi)重復性試驗，對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，計算變異系數(shù)。將重組蛋白以最佳濃度包被4塊化學發(fā)光板，使用相同的4份血清進行板間重復性試驗，對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，計算變異系數(shù)。

1.2.9 對比試驗

用建立好的VP1-CLEIA方法檢測采集自山東多個豬場的血清樣本200份，用1.2.5確定的是否免疫合格的標準判定結(jié)果，檢測結(jié)果與武漢科前生物生產(chǎn)的豬O型口蹄疫ELISA抗體檢測試劑盒進行對比。

對近3年采集自山東、遼寧、河北等地接種過豬O型FMDV滅活疫苗豬場的50份血清樣本用建立好的VP1-CLEIA方法進行檢測，用1.2.5確定的陰陽性血清的標準判定結(jié)果，并同國標試劑盒O型口蹄疫病毒液相阻斷ELISA試劑盒的檢測結(jié)果進行對比。

圖1 誘導表達Rosettta-pET-28a-VP1重組菌株的SDS-PAGE分析Fig. 1 Expression of VP1 as identified by SDS-PAGE. M: protein molecular weight marker 1: un-induced Rosettta-pET-28a-VP1; 2: the pellet of the post-induced bacterial lysates from ultrasonic disruption; 3: the supernatant of the bacterial lysates from ultrasonic disruption.

圖2 表達產(chǎn)物純化后SDS-PAGE分析Fig. 2 Purification of VP1 analyzed by SDS-PAGE. M: protein molecular weight marker; 1: flow through; 2-8: purification sample of VP1.

表1 VP1-CLEIA抗原最佳包被濃度的選擇Table 1 Determination of coating concentration for VP1-CLEIA

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-28a-VP1重組蛋白的表達和純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-VP1轉(zhuǎn)化Rosetta (DE3)宿主菌后進行培養(yǎng)誘導表達，分別取誘導前菌液，誘導后菌液超聲破碎的菌體沉淀和上清進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖1所示。誘導后產(chǎn)物有重組蛋白表達，分子量約為27 kDa，與預期大小一致，以包涵體的形式存在，上清未觀察到重組蛋白條帶。誘導表達產(chǎn)物的包涵體經(jīng)Ni-NTA樹脂親和層析純化后進行SDS-PAGE電泳分析，得到分子量在27 kDa左右的高純度重組蛋白，結(jié)果如圖2所示。

2.2 蛋白最佳包被濃度的確定

隨著VP1蛋白包被量的減少，測得FMDV陰性血清及陽性血清的化學發(fā)光值均不斷降低，當包被抗原為1∶40 (20 μg/mL) 稀釋時，P/N值較大，且陰性血清的化學發(fā)光值較小，結(jié)果見表1。因此可以確定在VP1-CLEIA方法中VP1蛋白的最佳包被濃度為20 μg/mL。

2.3 最佳封閉條件的確定

以抗原最佳包被濃度包被酶標板，選用3% BSA-PBST，1%明膠-PBST，10%新生牛血清-PBST，3% Casein+1%蔗糖-PBST混合液4種封閉液進行比較，分別在37 ℃條件下封閉60、90、120 min，比較P/N值。結(jié)果顯示，3% Casein+1%蔗糖-PBST混合液的封閉效果最好。37 ℃條件下封閉60 min陰性本底較高，封閉90和120 min的結(jié)果差異不大。因此選用3%酪蛋白+1%蔗糖-PBST混合液作為封閉液，最佳封閉時間為37 ℃封閉90 min，結(jié)果見表2。

2.4 酶標二抗工作濃度的確定

當HRP-羊抗豬IgG酶標二抗稀釋度為1∶40 000時，P/N值最大，因此將該稀釋度作為最佳酶標二抗稀釋度，結(jié)果見表3。

2.5 判定標準的確定

對10份豬O型FMDV陰性血清按以上確定的最適條件進行VP1-CLEIA檢測以及ELISA檢測 (武漢科前)，每份血清重復兩孔。10份血清化學發(fā)光值的平均值 (x1) 和標準差 (s1) 分別為28 033.25和1 553.87。因此初步確定VP1-CLEIA陰陽血清臨界值為x1+2s1，即31 141。10份血清經(jīng)ELISA檢測后 OD630的平均值 (x2) 和標準差 (s2) 分別為0.12和0.03。因此初步確定ELISA試劑盒陰陽血清臨界值為x1+2s1，即0.18。

表2 VP1-CLEIA最佳封閉條件的確定Table 2 Determination of blocking condition for VP1-CLEIA

表3 VP1-CLEIA HRP-羊抗豬IgG酶標二抗最佳稀釋度的確定Table 3 Determination of HRP conjugated IgG dilution for VP1-CLEIA

對10份經(jīng)正向間接血凝試驗判定抗體效價為1∶32的豬O型FMDV標準血清按以上確定的最適條件進行VP1-CLEIA檢測，每份血清重復兩孔。10份血清化學發(fā)光值的平均值 (x3) 和標準差(s3)分別為108 322.80和9 532.36。因此初步確定是否免疫合格的臨界值為x3+2s3，即127 388。

2.6 VP1-CLEIA的特異性

使用VP1-CLEIA檢測了其他4種常見的豬傳染病免疫后陽性血清以及2種其他亞型豬FMDV免疫后陽性血清，結(jié)果均為陰性，同時豬O型FMDV陽性對照及陰性對照分別檢出為陽性和陰性，證明建立的VP1-CLEIA方法具有良好的特異性 (表4)。

2.7 VP1-CLEIA的靈敏度

將已標定抗體效價為1∶512的豬O型FMDV陽性標準血清用封閉液從1∶32開始做倍比稀釋，分別用建立的VP1-CLEIA方法和武漢科前生物的ELSIA試劑盒進行檢測。結(jié)果顯示VP1-CLEIA方法檢測血清樣本在1∶2 048稀釋時仍可判為陽性，ELSIA試劑盒在1∶1 024稀釋時可判為陽性。提示建立的VP1-CLEIA方法靈敏度優(yōu)于ELSIA方法 (表5)。

2.8 VP1-CLEIA的重復性

結(jié)果顯示，板內(nèi)重復性試驗的變異系數(shù)在1.10%-6.70%之間，板間重復性試驗的變異系數(shù)在0.66%-4.80%之間，均小于7%。表明同一份血清樣本在同一批次制備抗原包被的化學發(fā)光板內(nèi)變異系數(shù)較小，具有良好的重復性。結(jié)果見表6、表7。

2.9 VP1-CLEIA與ELISA方法的符合率

用本次建立的VP1-CLEIA方法檢測采集自山東豬場的血清樣本200份，用2.5確定的免疫合格標準判定結(jié)果，檢測結(jié)果與武漢科前生物生產(chǎn)的豬O型口蹄疫ELISA抗體檢測試劑盒進行對比，兩者符合率為93.50%。用本次建立的VP1-CLEIA方法檢測采集自山東、遼寧、河北等地接種過滅活疫苗豬場的血清樣本50份，用2.5確定的陰陽性血清標準判定結(jié)果，檢測結(jié)果與國標試劑盒O型口蹄疫病毒液相阻斷ELISA試劑盒的檢測結(jié)果進行對比，兩者符合率為94.00% (表8)。

表4 VP1-CLEIA的特異性Table 4 Specificity of VP1-CLEIA

表5 VP1-CLEIA的靈敏度Table 5 Sensitivity of VP1-CLEIA and ELISA

表6 VP1-CLEIA的板內(nèi)重復性Table 6 Intro-batch reproducibility for VP1-CLEIA

表7 VP1-CLEIA的板間重復性Table 7 Inter-batch reproducibility for VP1-CLEIA

表8 VP1-CLEIA與間接ELISA以及液相阻斷ELISA的符合率Table 8 Agreement between VP1-CLEIA and indirect ELISA or liquid phase block ELISA

3 討論

本試驗選擇大腸桿菌系統(tǒng)表達的VP1重組結(jié)構(gòu)蛋白代替病毒顆粒作為包被抗原，初步建立了豬O型FMDV感染后和疫苗免疫后血清中針對VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體的CLEIA檢測方法。VP1結(jié)構(gòu)蛋白是O型FMDV產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，檢測針對VP1蛋白的抗體水平可用于評價FMDV疫苗的免疫效果，而且VP1蛋白也是檢測FMDV抗體應用最廣的檢測抗原[19]。傳統(tǒng)的ELISA方法主要是使用BHK細胞培養(yǎng)的FMDV作為抗原包被，雖然特異性和靈敏度均較高，但在生產(chǎn)的過程中存在病毒擴散的風險，且成本較高[20]，因此為降低安全隱患和生產(chǎn)成本，并使操作更為簡便，本試驗選用大腸桿菌系統(tǒng)表達的VP1重組蛋白作為包被抗原。

動物感染FMDV或經(jīng)口蹄疫滅活疫苗免疫后，體內(nèi)均會出現(xiàn)針對VP1結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，因此O型FMDV的VP1結(jié)構(gòu)蛋白CLEIA檢測方法既可以用于檢測病毒感染后動物體內(nèi)抗體水平，還可以用于疫苗免疫后動物體內(nèi)抗體水平的監(jiān)測。因此本試驗在確定判定標準時，考慮到檢測者的不同需求，制定了是否存在病毒感染及是否免疫合格兩個判定標準。鑒別診斷FMDV疫苗免疫動物和自然感染動物的關鍵在于動物體內(nèi)是否產(chǎn)生針對非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，因此在實際應用過程中，可以配合使用FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白檢測試劑盒。

ELISA檢測方法敏感性高、操作簡便，微量的樣品即能引起高效的抗原抗體反應，但目前只能實現(xiàn)定性檢測或半定量檢測，且重復性有待提高[21]。CLEIA檢測方法將免疫反應的特異性與化學發(fā)光分析的高靈敏性相結(jié)合，敏感性比普通ELISA高出一個數(shù)量級，靈敏度可與放射免疫分析法相媲美，且不存在放射污染等問題[22]，另外CLEIA檢測方法的重復性好，批間及批內(nèi)變異系數(shù)均明顯低于ELISA方法，能夠精確地進行定性及定量檢測[23]。今后可以通過建立標準曲線，實現(xiàn)抗體水平的定量檢測。盡管CLEIA檢測方法已被越來越多地應用于食品中藥物殘留以及人類疾病的檢測[24-26]，但對于動物疫病的檢測及疫苗免疫評價鮮有報道，本研究首次將該技術用于豬O型FMDV抗體的檢測，通過對臨床血清樣本的檢測可以看出，本次建立的CLEIA方法較ELISA方法具有更好的敏感性和精密度，與市售的間接ELISA試劑盒符合率達到93.50%以上，與液相阻斷ELISA的檢測符合率為94.00%，為更靈敏、精確的檢測豬O型FMDV抗體水平的研究奠定了基礎。

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(本文責編 陳宏宇)

March 10, 2016; Accepted: May 13, 2016

Limin Yang. Tel/Fax: +86-10-64807503; E-mail: lmyang@im.ac.cn

Establishment of chemiluminescent enzyme immunoassay for detecting antibodies against foot-and-mouth disease virus serotype O in swine

Recombinant structural protein VP1 of foot-and-mouth disease virus serotype O was expressed in Escherichia coli and then purified using Nickel affinity chromatography. A chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) method was established using the purified recombinant protein as coating antigen to detect antibody of foot-and-mouth disease virus serotype O in swine. The specificity of VP1-CLEIA method is 100%. The coefficients of variation in the plate and between plates are 1.10%-6.70% and 0.66%-4.80%, respectively. Comparing with the commercial indirect ELISA kit or liquid phase block ELISA kit, the calculated coincidence rate is 93.50% or 94.00%. The high specificity and stability suggested this detection method can be used to monitor the antibody level of foot-and-mouth disease virus serotype O in swine.

foot-and-mouth disease virus serotype O, VP1 protein, chemiluminescent enzyme immunoassay

Supported by: Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSZD-EW-Z-005-001).*These authors contributed equally to this study.

中國科學院重點部署項目 (No. KSZD-EW-Z-005-001) 資助。