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        呼吸道銅綠假單胞菌感染病灶藻酸鹽合成相關(guān)基因的表達(dá)*

        2016-12-12 00:42:20陜西省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科西安710005陳張琴許映龍費春麗劉小荔
        陜西醫(yī)學(xué)雜志 2016年12期
        關(guān)鍵詞:酸鹽銅綠生物膜

        陜西省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 (西安 710005) 陳張琴 王 靜 許映龍 費春麗 李 瑛 劉小荔 楊 淼

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        呼吸道銅綠假單胞菌感染病灶藻酸鹽合成相關(guān)基因的表達(dá)*

        陜西省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 (西安 710005) 陳張琴 王 靜 許映龍?費春麗 李 瑛 劉小荔 楊 淼

        目的:獲得一種呼吸道銅綠假單胞菌生物膜檢測方法,探討藻酸鹽合成相關(guān)基因的表達(dá)對臨床治療的影響。方法:提取60例呼吸道銅綠假單胞菌感染患者氣管內(nèi)病變組織,實時熒光定量PCR檢測藻酸鹽合成相關(guān)基因algD、algB、algU、mucA的表達(dá),60例患者根據(jù)是否耐藥分組,分為耐藥組(R組)40例,非耐藥組(NR組)20例,根據(jù)治療的難易程度,將60例患者分為治療困難組(D組)38例,治療容易組(E組)22例。并進(jìn)行基因algD、algB、algU、mucA的表達(dá)與臨床抗生素耐藥及治療難易之間的相關(guān)性分析。結(jié)果:經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)證實的銅綠假單胞菌感染病例60例,呼吸道病變組織均有algD、algB、algU、mucA基因的表達(dá);耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組)對比,algD、algU表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異,algB、mucA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異;容易組(E組)和困難組(D組)對比,algD、algU、algB、mucA差異無統(tǒng)計學(xué)意義;細(xì)菌耐藥和治療難易的相關(guān)性分析顯示,細(xì)菌耐藥和臨床治療難易相關(guān)。結(jié)論:algD與銅綠假單胞菌藻酸鹽的合成有著直接的正相關(guān)性,可以作為判斷是否有黏液型銅綠假單胞菌生長及生物膜形成的依據(jù),而algU與algD的表達(dá)有正相關(guān)性。

        本實驗選取細(xì)菌培養(yǎng)證實的呼吸道銅綠假單胞菌感染病例,內(nèi)鏡下氣管或支氣管內(nèi)取材,行生物膜形成相關(guān)基因及調(diào)節(jié)基因的檢測。藻酸鹽是銅綠假單胞菌生物膜胞外多聚基質(zhì)的主要成分之一,algD基因?qū)υ逅猁}合成起關(guān)鍵作用,而mucA基因的突變可造成algD的去阻遏表達(dá),使藻酸鹽大量生成。algB、algU促進(jìn)algD表達(dá)。報道如下。

        材料與方法

        1 標(biāo) 本 選擇2013年1月至2015年12月我院部分臨床痰液細(xì)菌培養(yǎng)證實為銅綠假單胞菌感染病例,男42例,女18例,年齡37~83歲,平均年齡68歲。氣管內(nèi)鏡下收集標(biāo)本,可為肉芽、病變壞死組織或氣管內(nèi)痂皮等,保存液保存。

        2 主要實驗器材和試劑 7300 Real Time PCR System(美國Applied Biosystems公司);臺式高速冷凍離心機(jī)Neofuge 15R(Heal Force);Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies 15596-026)。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo #K1622)。FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche 04 913 914 001);引物(Invitrogen Biotechnology Co.LTD);三氯甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 10006818);異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 80109218);無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 10009218)。

        3 引物序列 見表1。

        表1 引物序列

        4 實驗步驟 按試劑盒說明書進(jìn)行操作,步驟如下:①Trizol Reagent 抽提總RNA;②以oligo(dT)15反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;③ 定量PCR:預(yù)變性95℃,10min;循環(huán)(40次)95℃,15s→60℃,60s;末段延伸60℃,5min;溶解曲線 75℃→95℃,每20s升溫1℃;④ 結(jié)果處理:?CT =CT(目的基因,待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因,待測樣本)

        結(jié) 果

        1 60例患者細(xì)菌培養(yǎng) 60例均證實為銅綠假單胞菌感染病例,氣管內(nèi)肉芽或病變組織取材后PCR實驗結(jié)果,均有algD、algB、algU、mucA基因的表達(dá)。

        2 藥物敏感實驗結(jié)果 將60例病例分為耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組),algD、algU在兩組間表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),algB、mucA差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),見表2。

        3D組和E組△CT=CT目的基因-CTβ-actin比較 以臨床治療后癥狀體征是否容易改善,將60例病例分為容易組(E組)和困難組(D組),兩組間△CT均值對比的t檢驗提示,algD、algU、algB、mucA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)

        4 耐藥和治療難易相關(guān)性分析 對耐藥和治療難易的相關(guān)性分析顯示(P<0.05),說明耐藥和臨床難易有關(guān)。

        表2 R組和NR組△CT=CT目的基因-CTβ-actin比較

        討 論

        能形成生物膜的細(xì)菌主要有銅綠假單胞菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、沙雷氏菌屬、肺炎鏈球菌、葡萄球菌等, 相關(guān)感染尤以銅綠假單胞菌、金葡球菌多見。

        在肺部銅綠假單胞菌感染的抗生素治療方面,抗生素的選擇多是根據(jù)藥物敏感實驗的結(jié)果,該方法不一定奏效,因為臨床細(xì)菌培養(yǎng)多采用浮游模式,而事實上呼吸道銅綠假單胞菌生長多是以細(xì)菌生物膜的方式形成黏液層。即使浮游狀態(tài)細(xì)菌對抗生素敏感,生物膜狀態(tài)的細(xì)菌則仍然能抵抗高濃度的“敏感”抗生素[1]。盡管目前尚無可靠證據(jù),但理論上基于考慮生物膜形式而選擇的抗生素,應(yīng)該優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗而選擇抗生素[2]。

        細(xì)菌生物膜感染的概念提出有數(shù)十年,目前尚未開發(fā)出能提供臨床應(yīng)用的生物膜常規(guī)檢查和指導(dǎo)治療的方法[3]??茖W(xué)家們試圖找到銅綠假單胞菌生長方式和控制機(jī)制,并提出避免生物膜形成或促進(jìn)生物膜瓦解的方法[4]。

        藻酸鹽是銅綠假單胞菌生物膜胞外多聚基質(zhì)的主要成分之一,algD基因?qū)υ逅猁}合成起關(guān)鍵作用,而mucA基因的突變可造成algD的去阻遏表達(dá),使藻酸鹽大量生成。銅綠假單胞菌藻酸鹽形成的調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄水平對algD基因啟動子的調(diào)控,algB屬于NTRC家族,可直接綁定到algD啟動子而促進(jìn)藻酸鈉生產(chǎn)[5]。

        mucA-algU是銅綠假單胞菌生物膜合成的主要調(diào)控徑路。mucA突變型菌株,algU不再受到抑制,從而促進(jìn)下游啟動子的活化。algU的過表達(dá)促進(jìn)algD的啟動,在銅綠假單胞菌黏液型菌株mucoidisolates和非黏液型菌株non-mucoidisolates表達(dá)有顯著差異。

        本實驗患者均為選取細(xì)菌培養(yǎng)證實為銅綠假單胞菌感染病例,氣管內(nèi)肉芽或病變組織取材后PCR實驗結(jié)果,均有上述相關(guān)基因的表達(dá),而程度有差異。以藥物敏感實驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),將病例分為耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組),algD、algU表達(dá)在兩組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異,algB、mucA差異無統(tǒng)計學(xué)意義;說明algD表達(dá)與生物膜合成最為相關(guān),而直接影響培養(yǎng)細(xì)菌的耐藥性,algU與algD表達(dá)有比較明確的正相關(guān)性。mucA表達(dá)下降可以解除對algU的抑制,從而促進(jìn)algD表達(dá),algB通過綁定algD啟動子而促進(jìn)藻酸鹽的合成。本實驗兩組mucA、algB表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,說明mucA、algB與algD之間可能缺少直接的因果關(guān)系。

        至于分為容易組(E組)和困難組(D組),各種基因表達(dá)的比較均沒有統(tǒng)計學(xué)差異,以及耐藥和臨床難治有關(guān)的結(jié)論,由于分類標(biāo)準(zhǔn)的量化不能精確,并且臨床治療效果影響因素很多,除了性別、年齡、既往病史,甚至呼吸機(jī)的模式和護(hù)理水平均可能為混雜因素,所以不能得出非常可靠的結(jié)論??傊琣lgD與銅綠假單胞菌生物膜的合成有著直接的正相關(guān)性,可以作為判斷是否有黏液型銅綠假單胞菌生長及生物膜形成的依據(jù),而algU與algD有正相關(guān)性。

        針對生物膜的治療Yamasaki 等發(fā)現(xiàn)羅紅霉素和亞胺硫霉素合用能有效殺滅金黃色葡萄球菌生物膜。羅紅霉素和氟羅沙星對銅綠假單胞菌生物膜有明顯抑制作用,兩者合用可治療由銅綠假單胞菌生物膜引起的難治性感染,其中羅紅霉素通過抑制細(xì)菌多糖蛋白復(fù)合物合成來增強氟羅沙星對生物膜的滲透,對氟羅沙星殺滅生物膜中細(xì)菌起增效作用。體外實驗證明乳鐵蛋白協(xié)同木糖醇對銅綠假單胞菌生物膜有協(xié)同治療作用。麥盧卡蜂蜜和肉桂油等均有此類治療方面的研究。是否能以algU與algD的表達(dá)作為上述治療效果的判斷指標(biāo)有待進(jìn)一步的研究。

        [1 ] Lebeaux D, Ghigo JM, Beloin C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2014,78(3):510-543.

        [2] Waters V, Ratjen F. Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis[J].Cochrane Database Syst Rev,2015, 5(3):CD009528.

        [3] Hφiby N.A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections[J]. Pathog Dis,2014,70(3):205-211.

        [4] Rasamiravaka T, Labtani Q, Duez P,etal.The formation of biofilms by Pseudomonas aeruginosa: a review of the natural and synthetic compounds interfering with control mechanisms[J]. Biomed Res Int,2015,759348.

        [5] Leech AJ, Sprinkle A, Wood L,etal. The NtrC family regulator AlgB, which controls alginate biosynthesis in mucoid Pseudomonas aeruginosa, binds directly to the algD promoter[J]. J Bacteriol,2008,190(2):581-589.

        (收稿:2016-08-09)

        Expression of alginate biosynthesis-related genes in respiratory Pseudomonas aeruginosa infection lesions Shaanxi Provincial People's Hospital Respiratory Medicine

        (Xi’an 710005)

        Chen Zhangqin Wang Jing Xu Yinglong et al

        Objective:To obtain a respiratory Pseudomonas aeruginosa biofilm detection methods, explore the affect of the expression of the related alginate synthesis genes to the clinical treatment. Methods:Specimens were taken from the tracheal lesions of Pseudomonas aeruginosa infection cases, real-time quantitative PCR was performed to detect the expression of alginate biosynthesis-related gene algD, algB, algU, mucA. And correlation between gene algD, algB, algU, mucA. Expression and clinical treatment effect and antibiotic resistance was statistically analysed. Results:For all of the bacterial culture confirmed Pseudomonas aeruginosa infection cases, the alginate biosynthesis-related gene Expression was detected; comparison of resistant group (R group) and non-resistant group (NR group), algD, algU expression significantly difference, algB, mucA difference was not significant. Conclusion:Expression of algD and Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis has a direct positive correlation. Detect of algD can be used to determine whether there is Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. and the expression of algU have a positive correlation with algD.

        Pseudomonas aeruginosa @algD @mucA+

        *陜西省科學(xué)技術(shù)廳基金(2012k17-03-04)

        銅綠假單胞菌 @algD@mucA+

        R

        Adoi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.004

        ?西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科病院

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