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        自身免疫性肝炎患者肝組織程序性細(xì)胞死亡因子1及其配體1的表達(dá)及其與臨床的相關(guān)性

        2016-12-12 05:52:01柯坤宇魏大海陳麗芳孔金峰孫芳熊克宮
        肝臟 2016年11期
        關(guān)鍵詞:管區(qū)活動期免疫性

        柯坤宇 魏大海 陳麗芳 孔金峰 孫芳 熊克宮

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        ·論 著·

        自身免疫性肝炎患者肝組織程序性細(xì)胞死亡因子1及其配體1的表達(dá)及其與臨床的相關(guān)性

        柯坤宇 魏大海 陳麗芳 孔金峰 孫芳 熊克宮

        目的 通過檢測程序性細(xì)胞死亡因子1(PD-1)及其配體1(PD-L1)在自身免疫性肝炎(AIH))患者不同分期肝組織中的表達(dá)情況,探討其在AIH發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 收集43例AIH患者(包括活動期31例和緩解期12例)肝組織,并選擇9例健康者為對照組。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合圖像定量分析系統(tǒng)檢測肝組織內(nèi)PD-1及PD-L1的表達(dá)情況,并比較不同病情分期PD-1及PD-L1表達(dá)的差異。結(jié)果 AIH患者肝組織PD-1為(10.12±5.31)%,高于對照組(1.74±0.37)%,(P<0.05),AIH活動期肝組織PD-1為(15.68±6.31)%,高于緩解期(6.24±3.25)%,(P<0.05)。AIH患者肝組織PD-L1為(7.45±4.29)%,高于對照組(1.48±0.32)%,(P<0.05);AIH活動期肝組織PD-L1為(9.47±4.67)%,高于緩解期(4.78±2.43)%(均P<0.05)。結(jié)論 PD-1及其配體PD-L1在AIH患者肝組織中高表達(dá),提示其可能參與了AIH的發(fā)病機(jī)制。

        AIH;PD-1;PD-L1;肝組織;免疫組織化學(xué)

        自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確的慢性進(jìn)行性肝臟炎性疾病。多項證據(jù)表明,遺傳易感性、分子模型學(xué)說、自身反應(yīng)性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞缺陷參與了自身免疫性肝損傷[1]。程序性細(xì)胞死亡因子1 (programmed cell death-l,PD-1)是CD28家族中新發(fā)現(xiàn)的傳導(dǎo)抑制信號的共刺激分子,與其配體(主要是PD-L1)具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用,主要功能是調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化及分化[2]。PD-1/PD-L1通路可以誘導(dǎo)和維持外周組織的免疫耐受,對防止組織的過度炎性反應(yīng)以及自身免疫性疾病的發(fā)生具有積極作用,但其在AIH中的研究少有報道,且多局限于外周血PD-1及PD-L1,而肝臟是AIH免疫反應(yīng)的靶器官,因此,本研究通過檢測AIH患者肝組織中PD-1及PD-L1表達(dá)情況,探討其在AIH發(fā)生、發(fā)展中的作用,為AIH的免疫損傷及發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。

        資料和方法

        一、一般資料

        選取2013年1月至2015年8月在福州市傳染病醫(yī)院就診的AIH患者43例,男4例,女39例,其中12例在免疫抑制劑治療后達(dá)到緩解,其余31例處于發(fā)病期未行免疫抑制劑治療。入選病例均經(jīng)肝臟活組織檢查并經(jīng)臨床確診。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2008年國際免疫性肝炎小組(IAIHG)提出的AIH 簡化診斷積分系統(tǒng)及2010年美國肝病學(xué)會(AASLD)更新的有關(guān)AIH的診斷和治療指南[3-4]。排除肝炎病毒感染、藥物性、酒精性和遺傳代謝性肝病等。激素治療前評分≥15分明確診斷AIH。緩解是指癥狀消失,血清轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、IgG正常,肝組織正?;驘o活動性肝硬化[5]。對照組取材來自手術(shù)切除肝血管瘤病灶附帶的正常周圍肝組織,均取得患者同意并簽署知情同意書。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        二、標(biāo)本收集及實驗方法

        (一)肝組織標(biāo)本采集和處理 患者均于入院病情穩(wěn)定后在超聲引導(dǎo)下,采用巴德BARD一次性全自動活檢槍(購自美國巴德公司,型號MN1620)。肝組織標(biāo)本長度2.0 cm左右,匯管區(qū)數(shù)≥8個,4%甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片,HE染色。光學(xué)顯微鏡多視野觀察。肝組織均由兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生獨立閱片。PD-1及表達(dá)水平檢測采用免疫組織化學(xué)卵白素-生物素-酶復(fù)合物染色法(ABC),PD-l抗體(購自美國R&D公司),為山羊抗人多克隆抗體;PD-L1抗體(購自美國life spanbiosciences公司),為兔抗人多克隆抗體,按試劑盒說明書進(jìn)行。免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

        (二)肝組織PD-1/PD-L1表達(dá)的檢測和判定 采用ABC法檢測PD-1及PD-L1,表達(dá)的工作濃度為1∶200,切片厚度4 μm,3%H2O2作用5 min去除內(nèi)源性過氧化物酶,分別加入兔抗人PD-1多克隆抗體,4 ℃過夜,次晨分別加二抗,DAB顯色,蘇木精復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定:陽性結(jié)果呈棕黃色顆粒,位于肝細(xì)胞胞膜(或)及胞質(zhì),胞核呈淺藍(lán)色。

        (三)圖像分析及定量方法 每張切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野(×400),應(yīng)用HPIAS 1000圖像分析儀,檢測肝組織PD-1/PD-L1蛋白表達(dá)的平均吸光度值(MOD)與積分吸光度值(IOD),以每例5個視野的平均值作為測量值。

        三、統(tǒng)計學(xué)處理

        計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,正態(tài)分布的兩組組間比較采用t檢驗;非正態(tài)分布的兩組組間比較采用秩和檢驗;方差齊則對多樣本資料采用單因素方差分析及LSD-t檢驗比較組間差異,方差不齊則采用Mann-WhitneyU檢驗比較組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、研究對象的一般情況

        43例AIH患者,其中31例為活動期患者,男性3例,女性28例,平均年齡(47.2±12.4) 歲;12例為免疫抑制劑治療后緩解期患者,男1例、女11例,平均年齡(48.6±11.8) 歲?;顒悠诨颊弑憩F(xiàn)為肝功能不同程度異常、IgG水平增高,外周血出現(xiàn)多種自身抗體陽性,緩解期AIH患者肝功能及IgG水平均恢復(fù)正常,但外周血中自身抗體陽性比例與活動期相似,且滴度較活動期無明顯變化(見表1、表2)。

        表1 AIH患者肝功能及免疫球蛋白檢測結(jié)果

        TBil:總膽紅素;DBil:直接膽紅素;ALT:丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶;AST:天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶;GGT:谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶;ALP:堿性磷酸酶;GLO:球蛋白;IgG:免疫球蛋白G;IgA:免疫球蛋白A;IgM:免疫球蛋白M

        表2 AIH患者自身免疫抗體檢測結(jié)果

        ANA:抗核抗體;AMA:抗線粒體抗體;SMA:抗平滑肌抗體;抗SLA/LP:抗可溶肝抗原/肝胰抗體

        二、AIH患者肝臟組織病理學(xué)改變

        AIH以肝實質(zhì)損傷為主要表現(xiàn),31例活動期AIH患者以界面性肝炎和匯管區(qū)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤為主,且大部分肝小葉內(nèi)可見點狀或碎屑樣壞死,多數(shù)不累及膽管。界面性肝炎29例(93.5% ),淋巴、漿細(xì)胞浸潤27例(87.1% ),膽管破壞性炎癥2例(6.45% )(見圖1)。12例緩解期患者匯管區(qū)及小葉間隔周圍肝細(xì)胞均無明顯壞死,無或僅有少量淋巴細(xì)胞浸潤,無界面性炎,亦未見橋接壞死。此外,幾乎所有AIH都存在不同程度的纖維化,嚴(yán)重病例可出現(xiàn)肝硬化。

        三、PD-1在肝組織中的表達(dá)情況

        肝組織切片中PD-1主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞(包括T細(xì)胞、少量漿細(xì)胞)及一些庫普弗細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),不同炎癥及纖維化程度的肝組織中PD-1陽性表達(dá)細(xì)胞的分布較一致,主要分布在炎性細(xì)胞浸潤的匯管區(qū)及壞死區(qū),以匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤較多處較為顯著,肝細(xì)胞中未見表達(dá)。PD-1在對照組中無表達(dá)或極弱陽性表達(dá)(見圖2~4)。定量圖像分析結(jié)果顯示AIH患者肝組織PD-1為(10.12±5.31)%,高于對照組(1.74±0.37)%(P<0.05);AIH活動期肝組織PD-1為(15.68±6.31)%,高于緩解期(6.24±3.25)%,(P<0.05)。

        四、PD-L1在肝組織中的表達(dá)情況

        所有43例AIH患者的PD-L1在肝組織炎性細(xì)胞浸潤較明顯的區(qū)域部分肝細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)均有著色。AIH活動期患者在肝組織匯管區(qū)、小葉肝竇內(nèi)沿肝細(xì)胞竇側(cè)及炎性壞死區(qū)可見到較明顯PD-L1表達(dá),常伴有淋巴細(xì)胞包繞及密切接觸,并沿肝板在肝竇壁、壞死灶呈放射狀分布,炎性細(xì)胞浸潤較明顯的區(qū)域部分肝細(xì)胞胞質(zhì)亦有著色,陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加;治療后緩解組肝組織可見少量PD-L1表達(dá),陽性細(xì)胞散在分布,可表達(dá)于匯管區(qū),同時在小葉肝竇內(nèi)沿肝細(xì)胞竇側(cè)及炎性壞死區(qū)有少量表達(dá)。PD-L1在對照組中無表達(dá)或極弱陽性表達(dá)(見圖5~7)。定量圖像分析結(jié)果顯示AIH患者肝組織PD-L1為(7.45±4.29)%,高于對照組(1.48±0.32)%,(P<0.05);AIH活動期肝組織PD-L1為(9.47±4.67)%,高于緩解期(4.78±2.43)%(均P<0.05)。

        注:圖1為HE染色,×100;圖2~7均為ABC法,×400。圖1 活動期AIH患者肝組織,圖2 PD-1在活動期AIH患者肝組織中的表達(dá),圖3 PD-1在靜止期AIH患者肝組織中的表達(dá),圖4 PD-1在對照組肝組織中的表達(dá),圖5 PD-L1在活動期AIH患者肝組織中的表達(dá),圖6 PD-L1在靜止期AIH患者肝組織中的表達(dá),圖7 PD-L1在對照組肝組織中的表達(dá)

        討 論

        AIH是一種免疫介導(dǎo)的肝損傷,以肝組織內(nèi)T細(xì)胞浸潤、高γ球蛋白血癥、血清自身抗體陽性、具有人類白細(xì)胞抗原遺傳背景、常伴發(fā)其他自身免疫性疾病和對免疫抑制治療有效為特征[6]。目前盡管AIH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,但已明確自身免疫異常是AIH發(fā)病的主要原因。自身免疫異常通常指正常的免疫系統(tǒng)由于某種原因而出現(xiàn)免疫功能紊亂,會導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的包括AIH在內(nèi)的多種自身免疫異常疾病。

        PD-1作為CD28家族分子之一,屬于免疫細(xì)胞的抑制性共刺激分子,在免疫反應(yīng)特別是T細(xì)胞免疫反應(yīng)中具有重要作用。PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后,通過其胞質(zhì)尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM基序)傳入抑制信號,在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用[7]。PD-1/PD-L1通路抑制了免疫應(yīng)答的初始與效應(yīng)階段,維持機(jī)體的免疫自穩(wěn),否則過強(qiáng)的免疫應(yīng)答將導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[9]。在許多自身免疫病動物模型如實驗性自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性糖尿病等動物,阻斷PD-1/PD-L1通路則加速疾病的嚴(yán)重程度及進(jìn)展。PD-1基因敲除的小鼠出生3 d后給予切除胸腺,小鼠可發(fā)展為自身免疫性肝炎[8-9],且在自身免疫性肝炎動物模型中,肝組織內(nèi)PD-1的mRNA與蛋白含量表達(dá)增高[10-11]。在肝組織內(nèi)PD-L1可表達(dá)于肝細(xì)胞、竇上皮細(xì)胞及庫普弗細(xì)胞上,對活化T細(xì)胞的增殖和分裂有抑制作用,在活化的T細(xì)胞或者在病毒感染期,PD-L1的表達(dá)能力升高,表達(dá)于肝細(xì)胞上的PD-L1與表達(dá)于T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合能誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡[12]。PD-L1基因敲除小鼠的CD8+T細(xì)胞大量聚集在肝內(nèi),活化T細(xì)胞在肝內(nèi)的清除率下降,AIH的發(fā)病率上升[13]。

        本研究證實,AIH患者肝組織病理學(xué)特征為肝實質(zhì)破壞的界面性肝炎,提示存在針對匯管區(qū)肝界板及周圍肝細(xì)胞的特異性免疫攻擊。本研究還發(fā)現(xiàn)AIH患者肝組織內(nèi)的所有匯管區(qū)均有明顯淋巴細(xì)胞浸潤,進(jìn)一步驗證了AIH患者肝組織發(fā)生主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致了持續(xù)的肝細(xì)胞炎性損傷[14]。同時,本研究表明PD-1在活動期AIH患者表達(dá)增高,間接反映了肝內(nèi)浸潤性T淋巴細(xì)胞已被激活,發(fā)揮生物學(xué)功能。此外,在活動期AIH患者PD-L1的表達(dá)水平亦升高,表明其與PD-1結(jié)合可抑制T細(xì)胞的活化,調(diào)控肝臟浸潤效應(yīng)性T細(xì)胞的功能,阻止過度的免疫反應(yīng),從而部分程度上避免了自身反應(yīng)性T細(xì)胞對肝臟的破壞作用。研究還發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1的相互作用雖然可以起到自身免疫反饋抑制作用,但由于表達(dá)PD-L1的肝組織細(xì)胞數(shù)量較少,PD-L1的升高并不與PD-1平行。由此推測,PD-1/PD-L1通路并不能有效控制活化T細(xì)胞增殖分化的速度與強(qiáng)度,肝臟中PD-1/PD-L1通路調(diào)控失常,最終導(dǎo)致了AIH的發(fā)展。如果有藥物或其他細(xì)胞、分子等物質(zhì)上調(diào)PD-L1的表達(dá),促進(jìn)PD-1與PD-L1的相互作用,達(dá)到一定程度后,可能會加速活化的T細(xì)胞凋亡,從而起到治療AIH的作用。因此,對PD-1/PD-L1通路的干預(yù)可能為治療自身免疫性肝炎提供一種新的思路。

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        (本文編輯:錢燕)

        Expressions of PD and PD-L 1 in liver tissues of patients with autoimmune hepatitis and their clinic correlation

        KEKun-yu,WEIDa-hai,CHENLi-fang,KONGJin-feng,SUNFang,XIONGKe-gong.

        Departmentofliver,TheinfectiousdiseasehospitalofFujianmedicaluniversity,Fuzhou350012,China

        Correspondingauthor:XIONGKe-gong,Emal: 510768115@qq.com

        Objective To investigate the expressions of programmed death 1 (PD-1) and programmed death ligand 1 (PD-L1) in hepatic tissues of patients with autoimmune hepatitis (AIH), and to explore their roles in the pathogenesis of AIH. Methods The expressions of PD-1 and PD-L1 in hepatic tissues from 43 AIH patients and 9 healthy controls were detected by immunohistochemistry combined with computer image quantitative analysis. Results The PD-1 and PD-L1 expressions in hepatic tissues of AIH patients were 10.12±5.31% and 7.45±4.29%, respectively, which were significantly higher than those in controls (1.74±0.37% and 1.48±0.32%, respectively). The expressions of PD-1 and PD-L1 in hepatic tissues of AIH patients at active stage were 15.68±6.31% and 7.45±4.29%, respectively, which were higher than those in AIH patients in remission (6.24±3.25% and 4.78±2.43%, respectively) and healthy controls (1.74±0.37% and 1.48±0.32%, respectively). Conclusion PD-1 and PD-L1 are overexpressed in hepatic tissues of AIH patients, which reveals that PD-1 and its ligand might play an important role in the pathogenesis of AIH.

        AIH; PD-1; PD-L1; Liver tissues; Immunohistochemistry

        福州市衛(wèi)生系統(tǒng)科技計劃項目(2014-S-w21)

        350025 福州 福州市傳染病醫(yī)院(福建醫(yī)科大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院)肝病區(qū)

        熊克宮,Email:510768115@qq.com

        2016-06-28)

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