劉璇 邵玉龍 吳澤鈺 高凡凡 吳愷琪 劉素輝 陳鋒

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

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·論著·

薰衣草精油對(duì)白念珠菌體外抗菌活性及生物膜的影響

劉璇 邵玉龍 吳澤鈺 高凡凡 吳愷琪 劉素輝 陳鋒

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

目的 研究薰衣草精油對(duì)白念珠菌的體外抗菌活性和生物膜的影響，為臨床真菌感染的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 采用紙片擴(kuò)散法、連續(xù)稀釋法測(cè)定薰衣草精油對(duì)白念珠菌的敏感性、最低抑菌濃度 (MIC)和最低殺菌濃度 (MBC)；采用XTT法檢測(cè)其抑制白念珠菌生物膜50%細(xì)胞活性的濃度 (SMIC50)，鏡下觀察對(duì)生物膜形態(tài)的影響。結(jié)果 白念珠菌對(duì)薰衣草精油高度敏感，薰衣草精油對(duì)白念珠菌的MIC為12.5 μL/mL，MBC為25 μL/mL；對(duì)生物膜的SMIC50是100 μL/mL，對(duì)白念珠菌的菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。結(jié)論 薰衣草精油在體外對(duì)白念珠菌有抑菌作用。

白念珠菌；薰衣草精油；最低抑菌濃度；最低殺菌濃度；生物膜

[Chin J Mycol，2016，11(5):272-274]

近20 a來，隨著抗腫瘤藥物、免疫抑制劑和廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，器官移植、骨髓移植等新型診療技術(shù)的開展，糖尿病、艾滋病患者的增加等原因，醫(yī)院內(nèi)條件致病性真菌感染日漸增多。其中白念珠菌占大部分[1]。白念珠菌可感染皮膚、黏膜引起鵝口瘡、口角糜爛和陰道炎等疾病。

目前，念珠菌臨床耐藥菌株逐漸增多，需要尋找新的、有效的抗真菌藥物。研究表明精油對(duì)多種微生物有抑制作用，且精油對(duì)真菌的抑制效果要強(qiáng)于對(duì)細(xì)菌的抑制效果[2]。由于植物精油來源于植物，而且易揮發(fā)，作為外用殺菌藥物，具有較好的安全性。文獻(xiàn)報(bào)道薰衣草精油對(duì)多種微生物有抑制作用，但目前尚未見關(guān)于薰衣草精油抗白念珠菌作用的報(bào)道。本研究擬檢測(cè)新疆薰衣草精油體外對(duì)白念珠菌的抗菌作用及對(duì)其生物膜的影響，為精油抗菌藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥品及菌種 薰衣草精油 (純度100%)，購(gòu)自新疆伊帕爾汗香料發(fā)展有限公司。白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231由新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)中心微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基 (賽默飛世爾公司)，酵母膏蛋白胨葡萄糖 (YPG)培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基 (杭州濱和微生物試劑有限公司)、XTT試劑盒 (南京凱基生物公司)。

儀器與設(shè)備 96孔微量反應(yīng)板，酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡。

1.2 方法

體外抑菌試驗(yàn) (紙片法) 將白念珠菌接種于YPG液體培養(yǎng)基中，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再以RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液為1×104～1×106CFU/mL備用。取濾紙，用打孔機(jī)打成6 mm直徑的圓形小紙片。經(jīng)高壓蒸汽121℃、15 min滅菌后，放在35℃溫箱中數(shù)天，使完全干燥。在紙片上加入新疆伊帕爾汗薰衣草精油原液，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透精油。取適量白念珠菌涂布到沙氏培養(yǎng)基上。取充分浸泡過精油的紙片貼到平皿培養(yǎng)基表面。35℃溫箱中培養(yǎng)24 h。

最小抑菌濃度 (MIC)的測(cè)定 將白念珠菌接種于YPG液體培養(yǎng)基中，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再以RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液為1×104～1×106CFU/mL備用。將薰衣草精油倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.55、0.78、0.36、0.18 μL/mL。取96孔板，每孔加入100 μL菌液，再加入100 μL相應(yīng)濃度的精油；并設(shè)不加藥物的對(duì)照孔和兩性霉素B對(duì)照孔。37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，肉眼觀察結(jié)果，以無菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為最小抑菌濃度 (MIC)。

薰衣草精油對(duì)白念珠菌生物膜的影響 (XTT試劑盒檢測(cè)) 將白念珠菌劃線接種培養(yǎng)后，挑單個(gè)菌落接種于YPG液體培養(yǎng)基中，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再以RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液為1×103～1×104CFU/mL備用。將100 μL菌懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)液，PBS輕柔洗滌3次，每孔加入100 μL含不同濃度精油的RPMI-1640養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL XTT，37℃避光培養(yǎng)4 h。在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔OD值。另設(shè)空白對(duì)照孔 (只加培養(yǎng)液與XTT溶液)、陽(yáng)性對(duì)照孔 (只加菌液與XTT溶液，不含藥物)。

薰衣草精油對(duì)白念珠菌生物膜的形態(tài)學(xué)觀察 將100 μL的菌液 (1×106個(gè)細(xì)胞/mL)接種于96孔板中，分別加入不同濃度的薰衣草精油，37℃培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察生物膜形態(tài)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 體外抑菌試驗(yàn)

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)薰衣草精油為高度敏感，抑菌圈直徑23.2 mm。表明薰衣草精油對(duì)白念珠菌有抗菌作用 (見圖1)。

2.2 最低抑菌濃度 (MIC)

薰衣草精油對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC為12.5 μL/mL，MBC為25 μL/mL。

2.3 薰衣草精油對(duì)白念珠菌生物膜的影響

隨著薰衣草精油濃度的降低，OD值也逐漸升高，表明薰衣草精油對(duì)生物膜中白念珠菌活性有抑制作用，50%抑制率的精油濃度是100 μL/mL。2.4 薰衣草精油對(duì)白念珠菌生物膜作用的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下可見陽(yáng)性對(duì)照孔酵母細(xì)胞與其出芽延伸所形成的菌絲密集交織，并可沿著菌絲形成團(tuán)塊狀聚集。在6.25 μL/mL薰衣草精油作用下白念珠菌菌絲開始減少 (見圖2～3)。

圖1 薰衣草精油對(duì)白念珠菌抑菌活性 圖2 未經(jīng)薰衣草精油處理的生物膜 圖3 6.25 μL/mL薰衣草精油處理后的生物膜

Fig.1 Antifungal activity of lavender essential oilinvitroFig.2 Biofilm model without lavender essential oil administration Fig.3 Biofilm treated with 6.25 μL/mL of lavender essential oil

3 討 論

白念珠菌是臨床最常見的條件致病性真菌，在機(jī)體免疫功能低下或菌群失調(diào)時(shí)可引起鵝口瘡、陰道炎等疾病。目前臨床上治療念珠菌感染的藥物主要是三唑類氟康唑等唑類抗真菌藥物。但是越來越多的耐藥菌株日漸增多，再加上唑類藥物明顯的肝臟損傷，也限制了其臨床使用。研究表明，在傳統(tǒng)中醫(yī)中精油是常用的一大類芳香藥物，由于其來源于植物，易揮發(fā)，常采用吸入或涂抹等給藥途徑，具有較好的安全性。因此，從豐富的精油資源中尋找有效的抗真菌藥物，用于臨床或與唑類藥物聯(lián)合應(yīng)用，已引起越來越多的重視。

薰衣草 (lavender)又名歐薄荷，為唇形科薰衣草屬LavandulaLinn.植物，原產(chǎn)于地中海沿岸[3]。在法國(guó)、中國(guó)、俄羅斯等國(guó)家均有分布，具有悠久的種植和應(yīng)用歷史。新疆是我國(guó)薰衣草主產(chǎn)地。研究證實(shí)薰衣草精油有一定的抗真菌活性，其主要成分是芳樟醇、乙酸芳樟酯、桉樹腦、薰衣草醇和樟腦等[4]。Lis-Balchin等[5]發(fā)現(xiàn)芳香醇是薰衣草精油抗菌的主要成分，它能抑制10種真菌的生長(zhǎng)。姜黎等[6]報(bào)道新疆薰衣草精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、毛霉、綠色木霉菌和酵母菌均有抑制作用，對(duì)真菌的抑制作用強(qiáng)于細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果白念珠菌對(duì)薰衣草精油高度敏感，MIC為12.5 μL/mL，MBC為25 μL/mL。

白念珠菌感染常與其生物膜形成有關(guān)，而生物膜一旦形成很難清除，因此預(yù)防和清除生物膜是臨床急待解決的問題。研究表明白念珠菌形成生物膜的能力強(qiáng)于其他念珠菌。白念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為基底數(shù)層酵母細(xì)胞黏附于物體表面，其上方有胞外多聚基質(zhì) (extracellular matrix，ECM)覆蓋，內(nèi)有大量菌絲生長(zhǎng)。因?yàn)槭艿缴锬さ谋Ｗo(hù)，膜內(nèi)菌能夠逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊以及藥物的殺傷，且能在體內(nèi)播散，并表現(xiàn)出高度耐藥。本試驗(yàn)采用XTT法檢測(cè)薰衣草精油對(duì)體外白念珠菌生物膜的影響。該方法在不破壞生物膜的條件下能檢測(cè)出生物膜中菌細(xì)胞的活性。結(jié)果表明，薰衣草精油對(duì)白念珠菌SMIC50為100 μL/mL，表現(xiàn)出明顯的抗生物膜功能。

白念珠菌是具有酵母一菌絲二相性的真核微生物，菌絲的出現(xiàn)對(duì)其致病性與生物膜的形成均至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)薰衣草精油能明顯抑制白念珠菌菌絲的形成，從形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步驗(yàn)證了薰衣草精油對(duì)白念珠菌生物膜的影響。提示一定濃度的薰衣草精油能通過抑制白念珠菌的菌絲形成進(jìn)而抑制其生物膜的形成及致病性。

薰衣草在我國(guó)新疆資源豐富、產(chǎn)量高，其精油對(duì)真菌具有較好的抑制作用，作為中藥資源有必要對(duì)其進(jìn)行更深入的抑菌活性實(shí)驗(yàn)，為天然抗菌藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

[1] 趙穎，徐英春.臨床常見酵母菌感染及耐藥現(xiàn)狀[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志，2010，5(1):48-52.

[2] 田玉紅，周琪，頗俊華，等.廣林九號(hào)桉葉精油的抑菌活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,52(21):5193-5196.

[3] Teuscher E,Brinckmann J A,Lindenmaier M P.Medicinal spices:A handbook of culinary herbs,spices,spices mixtures and their essential oils[M].Stuttgart,Germany:Medpharm Scientific Publishers,2006:309-310.

[4] 王玉芹，孫亞軍，施獻(xiàn)兒.薰衣草精油的化學(xué)成分與藥理活性[J].國(guó)外醫(yī)藥.植物藥分冊(cè)，2004，19(1):5-8.

[5] Lis-BalchinM,HartS.Studies on themode ofaction of the essential oil of lavender[J].Phytother Res，1999，3(6):540.

[6] 姜黎，王向未，江英.薰衣草精油抑制作用的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2011(4):73-75.

[本文編輯] 王 飛

Invitroantifungal activity of lavender essential oil and its effect on biofilm ofCandidaalbicans

LIU Xuan,SHAO Yu-long,WU Ze-yu,GAO Fan-fan,WU Kai-qi,LIU Su-hui,CHEN Feng

(Basicmedicalcollegeofxinjiangmedicaluniversity,Urumqi,830011)

Objective To study antifungal activity of lavender essential oilinvitroand the effect on biofilm ofCandidaalbicans.Methods Disk diffusion and microdilution were used to determine the susceptibility and minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) ofCandidaalbicansto lavender essential oil.XTT reduction assay was performed to determine the SMIC50 of lavender essential oil toC.albicansbiofilms.The effect of lavender essential oil on morphogenesis ofC.albicansbiofilms was observed by inverted microscopy.Results The standard strain ofCandidaalbicanswas highly sensitive to lavender essential oil.MIC of Lavender essential oil toCandidaalbicanswas 12.5 μL/mL,MBC was 25 μL/mL.SMIC50 of lavender essential oil toC.albicansbiofilms was 100 μL/mL.Lavender essential oil could inhibit the filamentous growth.Conclusion Lvender essential oil had antifungal activity againstCandidaalbicansinvitro.

lavender essential oil;Candidaalbicans;MIC;MBC；biofilm

新疆醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金 (CX2014019)

劉璇，女 (漢族)，本科在讀.E-mail:1521561423@qq.com

陳鋒,E-mail:464230407@qq.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0272-03

2016-01-06