何文婧 高志琴 徐紅 譚靜文 蔡晴 楊虹 楊連娟

(1.上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200050；2.上海市長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所 全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

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·短篇論著·

82株甲真菌病致病菌分布及藥敏結(jié)果分析

何文婧1高志琴1徐紅2譚靜文1蔡晴1楊虹1楊連娟1

(1.上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200050；2.上海市長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所 全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

抗真菌藥；體外敏感性試驗(yàn)；甲真菌?。患t色毛癬菌

甲真菌病是甲及其周圍組織的真菌感染，是皮膚科最常見的甲病，占甲病的50%。致病真菌包括皮膚癬菌、念珠菌等酵母菌及非皮膚癬菌性霉菌等。其中，紅色毛癬菌是最常見的致病菌，約占90%[1]。本文對(duì)我院2014年11月～2015年1月皮膚科門診甲真菌病患者的菌種分布和體外藥敏試驗(yàn)做一回顧性分析，為臨床診斷治療提供用藥依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

受試者為我院皮膚科門診2014年11月～2015年1月就診的甲真菌病患者，臨床表現(xiàn)典型者予以真菌直接鏡檢和真菌培養(yǎng)以明確診斷。登記年齡和性別等一般資料。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

刮取病甲甲屑做真菌直接鏡檢并同步進(jìn)行真菌培養(yǎng)。

真菌直接鏡檢 取甲屑置于載玻片上；加1滴15%KOH溶液，蓋上蓋玻片；放置片刻或酒精燈火焰微加熱，即在火焰上快速過火2～3次不應(yīng)沸騰；輕壓蓋玻片；冷卻后先在低倍鏡下檢查有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)、特征、位置、大小和排列等。

真菌培養(yǎng)鑒定 甲屑標(biāo)本接種在含有50 μg/mL氯霉素和500 μg/mL的放線菌酮的沙堡斜面培養(yǎng)基 (SDA)上，每個(gè)樣本接種2管，置于25～28℃培養(yǎng)14 d。絲狀真菌通過菌落形態(tài)和小培養(yǎng)顯微鏡下特征鑒定；念珠菌通過轉(zhuǎn)種科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基或API20CAUX測試板條鑒定。

1.3 體外藥敏試驗(yàn)

抗真菌藥物 咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、聯(lián)苯芐唑和特比萘芬為原藥藥粉，均來自Selleck Chemicals公司 (咪康唑批號(hào)S253601，酮康唑批號(hào)S135302，氟康唑批號(hào)02，伊曲康唑批號(hào)S247603，聯(lián)苯芐唑批號(hào)S185402，特比萘芬批號(hào)S172501)，藥物純度達(dá)99.9%。各藥物濃度范圍為：氟康唑0.125～64 μg/mL；伊曲康唑、酮康唑、聯(lián)苯芐唑和咪康唑0.03～16 μg/mL；特比萘芬0.007 8～4 μg/mL。

質(zhì)控菌株 須癬毛癬菌ATCC MYA 4439和近平滑念珠菌ATCC 22019，均來源于第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院皮膚科惠贈(zèng)。

試驗(yàn)方法 皮膚癬菌參考改良的絲狀真菌M38-A2方案[2]，念珠菌參考M27-A3方案[3]。用試管倍比稀釋法制備藥物稀釋液10個(gè)濃度梯度，分別加入96孔板的1～10列，每孔均為0.1 mL，第11列為生長對(duì)照，只含有0.1 mL RPMI-1640，不含抗真菌藥物，第12列作陰性對(duì)照，均為0.2 mL的RPMI-1640。將純化的菌種培養(yǎng)成熟后制備菌懸液，應(yīng)用比濁儀結(jié)合血細(xì)胞計(jì)數(shù)板肉眼計(jì)數(shù)，RPMI-1640稀釋，最終將絲狀真菌調(diào)整菌懸液濃度至 (1～5)×104CFU/mL，念珠菌調(diào)整至 (1～5)×103CFU/mL。將制備好的菌懸液接種至藥敏板上第1～11列，每孔均為0.1 mL。絲狀真菌28℃、念珠菌35℃溫箱靜止孵育培養(yǎng)。絲狀真菌96 h、念珠菌24 h開始觀察結(jié)果，用肉眼觀察結(jié)合酶標(biāo)儀測OD值判定終點(diǎn)，與陽性對(duì)照孔比較，咪康唑、聯(lián)苯芐唑、酮康唑、氟康唑和特比萘芬取80%的生長抑制作為終點(diǎn)判定，伊曲康唑取100%的生長抑制為終點(diǎn)判定。每株受試菌株均重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次，結(jié)果平行。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

102例臨床懷疑甲真菌病患者中，真菌鏡檢陽性率61.8% (63/102)，培養(yǎng)陽性率80.4% (82/102)。真菌培養(yǎng)陽性患者中，男∶女=1∶1.73；患者發(fā)病年齡4～77歲，平均 (46±15.3)歲；指甲∶趾甲=1∶1.1。50歲以上的老年人指甲感染更常見，指甲∶趾甲=2.25∶1 (見表1)。

2.2 菌種分布

共分離到82株真菌，其中皮膚癬菌60例 (73.2%)，念珠菌屬21例 (25.6%)，非皮膚癬菌霉菌1例 (1.2%)(見表2)。

2.3 體外藥敏試驗(yàn)

82株臨床分離株對(duì)咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、聯(lián)苯芐唑和特比萘芬的MIC濃度范圍與幾何均數(shù)情況 (見表3)。皮膚癬菌對(duì)咪康唑、酮康唑、氟康唑、聯(lián)苯芐唑和特比萘芬?guī)缀尉鶖?shù)較低，提示敏感性較好，但是也有個(gè)別菌株在藥物工作濃度范圍內(nèi)不敏感。根據(jù)M27-S4[4]念珠菌的敏感性折點(diǎn)判定結(jié)果，80%以上的近平滑念珠菌對(duì)咪康唑、酮康唑、聯(lián)苯芐唑和特比萘芬敏感，4株對(duì)氟康唑耐藥，3株對(duì)伊曲康唑中度敏感；70%以上的白念珠菌對(duì)酮康唑和聯(lián)苯芐唑的敏感；1株熱帶念珠菌除對(duì)聯(lián)苯芐唑耐藥外，對(duì)其他試驗(yàn)菌株都敏感。1株毛霉菌對(duì)所有實(shí)驗(yàn)藥物均不敏感。

表1 82例甲真菌病患者年齡段和性別分布

表2 甲真菌病患者82株分離株菌種分布

表3 常見抗真菌藥物對(duì)82株甲真菌病臨床分離株的體外藥敏結(jié)果 (μg/mL)

3 討 論

甲真菌病的發(fā)病率逐年增高，在老年人中更常見。我們研究發(fā)現(xiàn)50歲以上的老年人占調(diào)查人數(shù)的47.57%，與Dorko[5]報(bào)道的一致。女性的發(fā)病率明顯高于男性，尤其在40～49歲年齡段，男女構(gòu)成比是1∶5.5，可能和女性更注重外表美觀而就診意愿高于男性有關(guān)。

我國各地綜合的病原學(xué)調(diào)查中顯示皮膚癬菌約占65%～70%，酵母菌約占10%～30%，主要分布在南方溫暖潮濕地區(qū)[6]。我們的研究結(jié)果顯示皮膚癬菌占73.2%，念珠菌屬占25.6%，與文獻(xiàn)結(jié)果相符。

隨著抗真菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，念珠菌感染的耐藥也日趨升高，尤其是唑類抗真菌藥物常是臨床經(jīng)驗(yàn)性治療的首選藥物。因此，對(duì)臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定和體外藥敏試驗(yàn)有助于臨床醫(yī)師了解念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感情況和選擇用藥。我們的藥敏結(jié)果顯示，絕大部分紅色毛癬菌和須癬毛癬菌對(duì)臨床常用的抗真菌藥物的MIC值幾何均數(shù)較低，提示敏感。氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬和聯(lián)苯芐唑?qū)毎_毛癬菌的MIC值范圍與之前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果幾乎相同[2]。我們分離到的酵母菌主要為白念珠菌和近平滑念珠菌，各為10株 (12.2%)。10株白念珠菌中，各有5株對(duì)氟康唑和伊曲康唑耐藥，與文獻(xiàn)報(bào)道的氟康唑 (54.1%)和伊曲康唑 (53.4%)耐藥情況一致[7]，這可能與臨床長期廣泛使用氟康唑和伊曲康唑有關(guān)[8]。白念珠菌和近平滑念珠菌對(duì)特比萘芬的敏感性分別為20% (2/10)和80% (8/10)，與文獻(xiàn)報(bào)道的4.9%和87.5%相近[9]。

藥敏試驗(yàn)采用酶標(biāo)儀與肉眼共同判讀結(jié)果，具有較好的一致性。利用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果可以提高靈敏度與精確度，使結(jié)果更加客觀準(zhǔn)確，減少主觀視覺的誤差[10-11]，可行性高，可提高效率。治療前了解致病真菌的菌種和體外藥敏情況有助于臨床醫(yī)師參考用藥。

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[本文編輯] 施 慧

何文婧，女 (漢族)，本科，技師.E-mail:hewenjing19901228@163.com

楊連娟,E-mail:lianjuan_yang@aliyun.com

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2016-05-18