張霄霄 汪定成 戈偉 邵海蓮 程芝 蘇博 臺(tái)錦閣 楊銘 張倩 陳靜文 張惠中

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710038)

?

·論著·

MALDI-TOF-MS技術(shù)在酵母樣真菌鑒定中的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

張霄霄 汪定成 戈偉 邵海蓮 程芝 蘇博 臺(tái)錦閣 楊銘 張倩 陳靜文 張惠中

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710038)

目的 評(píng)價(jià)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight- Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)對(duì)酵母樣真菌鑒定的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 將2015年6月～2016年6月臨床檢出的142株酵母樣真菌標(biāo)本同時(shí)采用MALDI-TOF-MS技術(shù)和傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法進(jìn)行鑒定，記錄結(jié)果并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 兩種方法對(duì)于常見的白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌和新生隱球菌的鑒定率很高 (100%)，符合率較高 (100%)；對(duì)于少見的葡萄牙念珠菌、解脂念珠菌、產(chǎn)朊念珠菌，兩種方法的符合率較低，分別為25.00%、00.00%、00.00%。結(jié)論 MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)酵母樣真菌的鑒定率較高，操作簡(jiǎn)便快速，是傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)鑒定的有力補(bǔ)充，可將其推廣應(yīng)用于酵母樣真菌的早期快速鑒定。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間；酵母樣真菌；鑒定

[Chin J Mycol，2016，11(5):285-288]

由于激素、廣譜抗生素和抗腫瘤藥物等在臨床上的廣泛應(yīng)用，免疫功能低下人群的不斷增加，酵母樣真菌感染的患者逐年遞增[1]。臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)鑒定方法周期長(zhǎng)、操作繁瑣，生化鑒定及菌落形態(tài)也需要有經(jīng)驗(yàn)的工作人員才能完成?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MAL-DI-TOF-MS)技術(shù)是目前微生物鑒定領(lǐng)域的新技術(shù)，準(zhǔn)確快速是其最大的特點(diǎn)[2]。質(zhì)譜技術(shù) (Mass Spectrometry，MS)就是將待檢樣品通過誘導(dǎo)碰撞轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)的氣態(tài)離子碎片，并按質(zhì)荷比 (m/z)大小順序排列的圖譜[3]。2012年Firacative等[4]利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)164株新生隱球菌和格特隱球菌進(jìn)行鑒定，可以100.00%鑒定到種，并且可以對(duì)8個(gè)主要分子類型 (新生隱球菌 VNⅠ-VN Ⅳ、格特隱球菌VGⅠ-VG Ⅳ)進(jìn)行分類。Sendid等[5]對(duì)1 207例臨床酵母菌分別采用MALDI-TOF-MS和傳統(tǒng)的科瑪嘉酵母菌顯色培養(yǎng)基，聯(lián)用API ID 32C生化鑒定試劑盒的方法鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者符合率可達(dá)91.5%，通過ITS區(qū)測(cè)序，在不符合結(jié)果的74株標(biāo)本中，73株顯示MALDI-TOF-MS方法鑒定正確。上述實(shí)例可說明MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)酵母菌的準(zhǔn)確率高，結(jié)果可靠，適用于臨床快速鑒定。因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)臨床分離的酵母樣真菌菌株，分別采用MALDI-TOF-MS技術(shù)和傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法進(jìn)行鑒定，評(píng)估結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1 材料與方法

1.1 參考菌株來源

校準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌ATCC8739。質(zhì)控菌株：白念珠菌ATCC90028，近平滑念珠菌ATCC22019。質(zhì)控菌株購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑

VITEK MALDI-TOP MS質(zhì)譜儀及配套試劑、哥倫比亞血平板均購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；SPX-150BIII型生化培養(yǎng)箱 (天津泰斯特儀器有限公司)；BD BECTEC 9120血培養(yǎng)儀 (美國(guó)BD公司)；沙堡弱培養(yǎng)基 (英國(guó)OXOID公司)；顯色培養(yǎng)基 (法國(guó)科瑪嘉公司)；革蘭染液 (珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；日本奧林巴斯顯微鏡 (OLYMPUS CX21)；酵母樣真菌同化試驗(yàn)編碼鑒定管TH-15C (杭州濱和微生物試劑有限公司)。

1.3 酵母樣真菌的分離及培養(yǎng)

痰液、皮膚拭子、糞便、分泌物等標(biāo)本直接分別接種至哥倫比亞血平板和沙堡弱培養(yǎng)基。尿液3 000 r/min離心15 min后接種至哥倫比亞血平板和沙堡弱培養(yǎng)基。靜脈血、腦脊液、胸腹水等先接種至需氧培養(yǎng)瓶，35℃血培養(yǎng)儀中進(jìn)行檢測(cè)，有陽性瓶報(bào)警后分別接種至哥倫比亞血平板和沙堡弱培養(yǎng)基。所有哥倫比亞血平板和沙堡弱培養(yǎng)基放置到35℃培養(yǎng)箱中孵育，待培養(yǎng)出肉眼可見的菌落，鏡檢見到真菌孢子后，挑取單個(gè)菌落分純后再分別進(jìn)行MALDI-TOF-MS和傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法鑒定，記錄所鑒定出真菌的種類。

1.4 MALDI-TOF-MS方法鑒定

根據(jù)VITEK MALDI-TOF MS標(biāo)準(zhǔn)操作流程，用1 μL定量接種環(huán)直接挑取新 鮮純菌落涂在靶板點(diǎn)位內(nèi)，先加0.5 μL VITEK MALDI-TOF MS FA試劑待干燥，再將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 8739涂在靶板的校準(zhǔn)點(diǎn)位中，所有檢測(cè)位點(diǎn)加入1 μL Vitek MS-α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液，待干燥后放入MALDI-TOF MS儀器獲取細(xì)菌全細(xì)胞蛋白質(zhì)譜，然后將待測(cè)菌質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫(kù)已知菌質(zhì)譜進(jìn)行比較分析從而獲得鑒定結(jié)果。VITEK MALDI-TOF MS結(jié)果分為3種顏色：綠色表示唯一的鑒定結(jié)果，可信概率 (60.0%～99.9% )；黃色表示低分辨率結(jié)果，可信概率 (>60.0%)需要進(jìn)一步做補(bǔ)充試驗(yàn)才能確定；紅色表示不能鑒定，可信概率 (<60.0%)與數(shù)據(jù)庫(kù)的任何質(zhì)譜不匹配[6]。

1.5 傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法鑒定

將培養(yǎng)出的純菌直接接種于顯色培養(yǎng)基上，35℃，培養(yǎng)24～48 h，觀察其菌落顏色，依據(jù)菌落顯示的顏色進(jìn)行菌種鑒定；將純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等糖同化管，35℃，孵育24～48 h，觀察糖同化管濁度變化[7]，根據(jù)已知酵母菌的生化特性達(dá)到鑒定目的。

2 結(jié) 果

2.1 MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

使用質(zhì)譜儀共檢測(cè)2015年6月～2016年6月經(jīng)醫(yī)院臨床分離出的142株酵母樣真菌菌株。根據(jù)不同菌種各有其特征的質(zhì)譜峰，結(jié)果在可信概率之間的酵母樣真菌有135株，占95.07%，未鑒定出的真菌占4.93%。其中43株鑒定為白念珠菌，25株熱帶念珠菌，16株光滑念珠菌，11株近平滑念珠菌，10株葡萄牙念珠菌，10株克柔念珠菌，6株菌膜念珠菌，6株解脂念珠菌，4株產(chǎn)朊念珠菌，4株新生隱球菌，0株異常漢遜酵母菌。

2.2 傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法鑒定結(jié)果

用傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法鑒定出的酵母樣真菌有113株，占79.58%，未鑒定出的真菌占20.42%。其中43株為白念珠菌，25株熱帶念珠菌，9株光滑念珠菌，11株近平滑念珠菌，2株葡萄牙念珠菌，10株克柔念珠菌，6株菌膜念珠菌，0株解脂念珠菌，0株產(chǎn)朊念珠菌，4株新生隱球菌，3株異常漢遜酵母菌。

2.3 MALDI-TOF-MS技術(shù)與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法鑒定結(jié)果比較

兩種方法對(duì)于白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、菌膜念珠菌、新生隱球菌的鑒定率很高 (100%)，且符合率較高；對(duì)于近平滑念珠菌的檢測(cè)，兩種方法鑒定率都為78.57%；對(duì)于葡萄牙念珠菌、解脂念珠菌、產(chǎn)朊念珠菌、異常漢遜酵母菌的檢測(cè)，符合率較低，分別為20.00%、00.00%、00.00%、00.00%。見表1。

3 討 論

近年來臨床上由于酵母樣真菌所造成的重度感染逐漸增多，尤其是免疫低下人群發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。因此，早期快速準(zhǔn)確的鑒定出酵母樣真菌已經(jīng)成為臨床診斷和治療的關(guān)鍵[8]。

本實(shí)驗(yàn)通過MALDI-TOF-MS技術(shù)與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)鑒定方法對(duì)臨床分離的142株酵母樣真菌標(biāo)本鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：兩種方法對(duì)于常見的白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、新生隱球菌的鑒定率很高，符合率較高；對(duì)于少見的葡萄牙念珠菌、解脂念珠菌、產(chǎn)朊念珠菌、異常漢遜酵母菌的檢測(cè)，符合率較低，分別為20.00%、00.00%、00.00%、00.00%。從總體來看，MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)酵母樣真菌的鑒定率高于傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法的鑒定率。

表1 兩種方法對(duì)酵母樣真菌的鑒定率與符合率 (%)比較

在臨床工作中,傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法中的分離培養(yǎng)是微生物實(shí)驗(yàn)室必不可少的基本技術(shù)，是獲得純培養(yǎng)物的必要手段。然而對(duì)人類致病的細(xì)菌及酵母樣真菌，在利用傳統(tǒng)培養(yǎng)、手工生化法鑒定時(shí)需要技術(shù)人員有較多的工作經(jīng)驗(yàn)，且易受到多因素影響[9]。培養(yǎng)鑒定過程耗時(shí)長(zhǎng)，且最后可能得不到正確的鑒定結(jié)果，尤其是對(duì)于一些不常見菌株更不容易鑒定出來[10]。本次實(shí)驗(yàn)中利用傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)鑒定方法有29例酵母樣真菌未檢出，經(jīng)分析原因可能是：(1)傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法依賴致病菌的生長(zhǎng)代謝，且真菌細(xì)胞壁硬度大，生化反應(yīng)不明顯，導(dǎo)致對(duì)其鑒定錯(cuò)誤或者鑒定不出。(2)某些酵母菌生化反應(yīng)相似，難于區(qū)分。(3)培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等都會(huì)影響傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確。MALDI-TOF-MS技術(shù)在酵母菌屬鑒定方面應(yīng)用比較廣泛，且極大的縮短了臨床鑒定時(shí)間，使臨床患者的治療成功機(jī)會(huì)顯著增加[11]。質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)包括了大量臨床酵母菌的參考圖譜，尤其適用于不常見的酵母菌。從這些方面看，質(zhì)譜技術(shù)有一定的優(yōu)勢(shì)。但是利用質(zhì)譜儀對(duì)酵母樣真菌的檢測(cè)仍然存在著一些問題。本實(shí)驗(yàn)中采用MALDI-TOF-MS技術(shù)有7例酵母樣真菌未檢出，經(jīng)分析原因可能是：(1)真菌菌落一般較干燥、細(xì)胞壁厚，未能與甲酸更好的結(jié)合破壁，核蛋白未完全釋放出來。(2)數(shù)據(jù)庫(kù)不完善，圖譜庫(kù)中未含有此菌，還需不斷補(bǔ)充。(3)靶點(diǎn)涂菌不均勻，過薄或過厚均不能形成較好的結(jié)晶[12]。(4)臨床上有些菌株缺乏特異性峰值或峰值數(shù)量不足，無法形成圖譜而不能鑒定[13]。

綜上所述，MALDI-TOF-MS是一種快速、準(zhǔn)確、通量高、成本相對(duì)較低的新型真菌檢測(cè)方法。采用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)可降低傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法對(duì)罕見酵母樣真菌的漏診率，且該技術(shù)操作簡(jiǎn)易，只需要簡(jiǎn)單的培訓(xùn)就可以上機(jī)進(jìn)行菌種的鑒定。然而傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)方法特別是涂片加分離培養(yǎng)依然很重要，MALDI-TOF-MS是傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)鑒定方法的有力補(bǔ)充，為真菌的鑒定提供了新的選擇，建議在條件允許的情況下可以同時(shí)使用兩種檢測(cè)方法。

[1] 張霄霄,汪定成,張惠中.質(zhì)譜在臨床病原真菌檢測(cè)及鑒定中的研究進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2015,4(4):294-296.

[2] Becker PT,Stubbe D,Claessens J,et al.Quality control in culture collections:Confirming identity of filamentous fungi by MALDI-TOF MS[J].Mycoscience,2014,56(3):273-279.

[3] Cooks RG,Jarmusch AK,Wleklinski M.Direct analysis of complex mixtures by mass spectrometry[J].Int J Mass Spectrom,2015,377(10):709-718.

[4] Firacative C,Trilles L,Meyer W.MALDI-TOF-MS enables the rapid identification of the major molecular types within theCryptococcusneoformans/C.Gattiispecies complex[J].PLoS One,2012,7(5):e37566.

[5] Sendid B,Ducoroy P,Franois N,et al.Evaluation of MALDI-TOF mass spectrometry for the identification of medically-important yeasts in the clinical laboratories of Dijon and Lille hospitals[J].Med Mycol,2013,51(1):25-32.

[6] Kudirkiene E,Welker M,Knudsen NR,et al.Rapid and accurate identification ofStreptococcusequisubspecies by MALDI-TOF MS[J].Syst Appl Microbiol,2015,38(5):315-322.

[7] 孫哲,鄒桂玲,杜雪飛,等.酵母樣真菌的培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn)分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2014(6):1011-1012.

[8] Christian L,Elio C,Angela C,et al.Rapid identification of bacterial and fungal pathogens from positive blood cultures by MALDI-TOF MS[J].Int J Med Microbiol,2013,303(4):205-209.

[9] 宋敏,劉靳波,王開正,等.表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在病原微生物分析中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013,28 (4):324-328.

[10] Van Veen SQ,Class EC,Kuijper EJ.High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories [J].J Clin Microbiol,2010,48(3):900-907.

[11] 張金艷,郭秀娟.質(zhì)譜儀在臨床病原菌感染診斷中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 2014,37(11):879-880.

[12] 葉麗艷，郭玲，馬艷寧,等.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在快速鑒定真菌中的臨床應(yīng)用研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志2015,25(15):3361-3363.

[13] Stevenson LG,Drake SK,Shea YR,et al.Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of clinically important yeast species[J].J Clin Microbiol,2010,48(10):3482-3486.

[本文編輯] 施 慧

Evaluation of the clinical application of MALDI-TOF-MS technology in detection of yeast-like fungi

ZHANG Xiao-xiao，WANG Ding-cheng，GE Wei，SHAO Hai-lian，CHENG Zhi，SU Bo，TAI Jin-ge，YANG Ming，ZHANG Qian，CHEN Jing-wen,ZHANG Hui-zhong

(TangDuHospital，Xi'an710038，China)

Objective MALDI-TOF-MS technology was evaluated the clinical application value of MALDI-TOF-MS in the rapid identification of yeast-like fungi.Methods MALDI-TOF-MS technology and traditional fungi cultural method were used to identify 142 yeast-like fungi of clinical isolates which from June 2015 to June 2016,results were recorded and analyzed.Results The rate of identification of two methods for commonC.albicans,C.tropical,C.kruseiandCryptococcusneoformanswere very high (100%),concordant rate was 100%;The rate of identification of two methods for uncommonC.lusitaniae,C.lipolyticaandC.utiliswere very low,concordant rate were 25.00%,00.00% and 00.00% respectively.Conclusion MALDI-TOF-MS had a better identification rate of yeast-like fungi,and the characteristic of simple and rapid operation provided a powerful complement for traditional manual method,which could be applied in the early rapid identification of yeast-like fungi.

MALDI-TOF-MS;yeast-like fungi;detection

張霄霄，女 (漢族)，檢驗(yàn)技師.E-mail:644136010@qq.com

張惠中,E-mail:huizz328@163.com

R 446.5

A

1673-3827(2016)11-0285-04

2016-08-05