胡繼君，孫麗君，管一春，郝大勇，馬曉娟，齊若凡，董孝貞

α亞麻酸對體外成熟人卵母細胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

胡繼君，孫麗君，管一春，郝大勇，馬曉娟，齊若凡，董孝貞

目的：探討α亞麻酸（ALA）對人未成熟卵母細胞體外成熟的影響及對卵母細胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響。方法：收集2014年10月—2015年10月因男方因素行胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）的273例患者的未成熟卵母細胞441枚，其中MⅠ期179枚，GⅤ期262枚。將MⅠ期和GⅤ期卵母細胞按相同的構成比隨機分為5組，分別放入含不同濃度[0（對照組），10 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L]ALA的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h后觀察卵母細胞的成熟情況，實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）測定各組卵母細胞的線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)。結果：①各組未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)（IVM）后總成熟率以ALA 50 μmol/L組（70.1%）最高，明顯高于對照組（42.1%）及ALA 200 μmol/L組（34.1%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；②5組GⅤ期卵母細胞成熟率以ALA 50 μmol/L組（64.4%）最高，明顯高于對照組（28.9%）及ALA 200 μmol/L組（18.2%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；③ALA 50 μmol/L組成熟卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)（3.64×107±1.85×106）大于對照組（3.42×106±1.95×105），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：50 μmol/L ALA在體外實驗中可增加卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)，有促進人未成熟卵母細胞體外成熟的作用。

α亞麻酸；卵母細胞；細胞培養(yǎng)技術；DNA，線粒體

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：454-458）

未成熟卵母細胞在GⅤ期被抑制，在體內(nèi)外對促性腺激素（Gn）刺激做出反應后繼續(xù)進行減數(shù)分裂形成MⅡ期卵母細胞，這個過程被稱為卵母細胞核成熟。調(diào)控卵母細胞成熟的分子機制復雜，許多通路參與此調(diào)控過程，包括環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和cAMP依賴的蛋白激酶途徑。卵母細胞繼續(xù)減數(shù)分裂成熟和Gn刺激后的生殖泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD），主要是通過增加細胞內(nèi)cAMP濃度介導的。未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)（in vitro maturation，IVM）技術是指從卵巢中取得的未成熟卵母細胞，在體外合適條件下進行培養(yǎng)，使卵母細胞成熟且具有受精能力的一項技術。有報道稱在正常的體外受精/胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（invitro fertilization/intracytoplasmic sperm injectionembryo transfer，IVF/ICSI-ET）周期中，約有15%的卵母細胞未成熟，這些卵母細胞因無法受精而被廢棄[1]。IVM的出現(xiàn)無疑為充分利用這些未成熟卵母細胞奠定了基礎。α亞麻酸（alpha-linolenic acid，ALA）為全順式9、12、15十八碳三烯酸，屬n-3系列多不飽和脂肪酸（poly unsaturated fatty acids，PUFAs），體內(nèi)可以轉化為二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（dehydroacetic acid，DHA）。對哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn)，ALA不僅可以通過膳食改善哺乳動物的繁殖能力，而且還能通過IVM提高卵母細胞的體外成熟率和發(fā)育至囊胚階段的能力[2]。然而ALA作用于卵母細胞的機制仍不明確，且尚少見ALA對人未成熟卵母細胞體外成熟和發(fā)育潛能影響的報道。本研究初步探討不同濃度ALA對人未成熟卵母細胞體外成熟中對卵母細胞線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)的影響，以期尋找ALA在人未成熟卵母細胞IVM中的適宜濃度，作為優(yōu)化IVM方案的參考。

1　對象與方法

1.1研究對象未成熟卵母細胞均來自2014年10月—2015年10月于鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心因男方因素行ICSI-ET的273例患者，平均年齡（30.6±4.0）歲，收集441枚未成熟卵母細胞，其中MⅠ期卵母細胞179枚，GⅤ期卵母細胞262枚。將MⅠ期和GⅤ期卵母細胞按相同的構成比隨機分為5組，各組患者的年齡、不孕時間、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、基礎內(nèi)分泌水平[基礎卵泡刺激素（bFSH）、基礎雌二醇（bE2）、基礎黃體生成激素（bLH）]比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。所有患者無長期吸煙、吸毒或酗酒等不良嗜好，均采用標準長方案促排卵。本研究已獲鄭州大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2制備IVM培養(yǎng)液將ALA（美國Sigma公司）溶于二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）中，配制10 mmol/L儲備液。①基礎IVM培養(yǎng)液：IVF受精液中加入75 IU/L FSH、75 IU/L LH和1%雙抗；②ALA 0 μmol/L組（對照組）IVM培養(yǎng)液：基礎IVM培養(yǎng)液中添加同等濃度的DMSO；③ALA 10 μmol/L組IVM培養(yǎng)液：基礎IVM培養(yǎng)液中含10 μmol/L的ALA；④ALA 50 μmol/L組IVM培養(yǎng)液：基礎IVM培養(yǎng)液中含50 μmol/L的ALA；⑤ALA 100 μmol/L組IVM培養(yǎng)液：基礎IVM培養(yǎng)液中含100 μmol/L的ALA；⑥ALA 200 μmol/L組IVM培養(yǎng)液：基礎IVM培養(yǎng)液中含200 μmol/L的ALA。各組培養(yǎng)液均于37℃5%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱中過夜平衡后使用。

1.3未成熟卵母細胞的收集因男方因素行ICSI的不孕癥患者采用常規(guī)促排卵方案。當最大卵泡直徑達18 mm時注射人絨毛膜促性腺激素（hCG），34～36 h后超聲引導經(jīng)陰道穿刺取卵。取卵后4 h將卵丘復合物置于含80 U/mL透明質(zhì)酸酶0.2 mL的四孔板中，拆除卵母細胞周圍的大部分顆粒細胞，經(jīng)倒置顯微鏡觀察卵母細胞的成熟程度，生殖泡仍存在即生殖泡期（GⅤ期）卵母細胞，生殖泡破裂但尚未排出第一極體即MⅠ期卵母細胞，GⅤ期或MⅠ期卵母細胞供本研究使用。

表1　各組患者一般情況比較（x±s）

1.4未成熟卵母細胞的體外培養(yǎng)采用微滴培養(yǎng)，50 μL/滴，1枚/滴。各組配制培養(yǎng)液滴在使用前于37℃、5%CO2孵箱（Galaxy 48 R，Eppendorf有限公司）中平衡至少6 h，將收集的MⅠ期卵母細胞和GⅤ期卵母細胞按相同的構成比隨機分為5組，采用隨機數(shù)字表將未成熟卵母細胞編號后隨機分配到各組，分別放入含不同濃度（0 μmol/L，10 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L）ALA培養(yǎng)液中。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡（IX70，Olympus公司）下觀察卵母細胞的成熟情況，以第一極體排出為卵母細胞成熟的標志。

1.5體外成熟卵母細胞的保存將對照組和ALA 50 μmol/L組成熟卵母細胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，單個卵母細胞移入裝有10 μL細胞裂解液[50 mmol/L Tris-HCl+0.1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），體積分數(shù)0.5%Tween-20+200 mg/mL蛋白酶K，pH值8.5]的0.2 mL薄壁聚合酶鏈反應（PCR）管中，使細胞裂解釋放DNA備用。

1.6引物設計查閱相關文獻，根據(jù)引物設計原則，應用生物信息學方法和Primer生物軟件結合生物信息學方法，由上海生物工程有限公司合成本研究所需引物，設計引物序列：上游為5′-CGAAAGGACAAGAGAAATAAGG-3′；下游為5′-CTGTAAAGTTTTAAGTTTTATGCG-3′，Tm 60，產(chǎn)物片段158 bp。將合成的固體引物離心到管底，輕輕加入滅菌雙蒸水，配制100 μmol/L的貯存液，-20℃保存。

1.7體外成熟卵母細胞mtDNA的測定

1.7.1卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)定量標準品的制備以檢測標本中有無卵母細胞mtDNA存在的PCR擴增產(chǎn)物的反應體系和反應條件進行目的產(chǎn)物的擴增，按DNA快速純化/回收試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]說明書要求進行目的產(chǎn)物的分離、純化，測定分離純化的DNA濃度，按1 ng 158 bp的PCR產(chǎn)物含5.8×109雙鏈DNA分子，計算出分離純化的DNA樣品即標準品的拷貝數(shù)；將標準品按照1∶10的比例進行等倍比稀釋而形成標準品梯度濃度。

1.7.2實時熒光定量PCR反應檢測卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)使用SYBT Premix Ex TaqTM試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]，在ABI PRISM7900HT實時熒光定量PCR擴增儀（德國Eppendorf公司）上檢測mtDNA拷貝數(shù)。根據(jù)試劑盒說明書制備10 μL PCR反應體系：1 μL模板，5 μL SYBR Premix Ex TaqTM，0.2 μL ROX Reference Dye，D41、D56引物各0.2 μL，PCR水補齊至10 μL。反應條件為：95℃預變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)并收集熒光曲線。然后將樣品加熱到95℃15 s，馬上降低到60℃保持15 s，按照0.5℃/s梯度遞增到95℃，在升溫中收集熒光信號。設定溶解曲線，檢測PCR反應特異性。每次反應的標準曲線通過已知拷貝數(shù)的標準品確定，每個樣品的起始mtDNA拷貝數(shù)通過此標準曲線來確定。

實驗第1部分發(fā)現(xiàn)，ALA濃度在50 μmol/L時對卵母細胞體外成熟作用更明顯，在此基礎上，實驗第2部分將ALA 50 μmol/L組和對照組的成熟卵母細胞的線粒體DNA進行比較。55℃加熱含卵母細胞PCR管2 h，95℃10 min滅活蛋白酶K，然后進行PCR擴增。按Real-time PCR試劑盒說明書[寶生物工程（大連）有限公司]進行操作，-70℃保存。以洗滌過卵母細胞的磷酸鹽緩沖液PBS作陰性對照。

1.8統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件包。定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。定性資料采用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗。檢驗水準為α=0.05。組間多重比較時，按比較次數(shù)（k）適當調(diào)整檢驗水準，α′=0.05/k。

2　結果

2.1各組培養(yǎng)液對未成熟卵母細胞體外成熟的影響不同濃度（0 μmol/L，10 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L）ALA體外培養(yǎng)MⅠ期卵母細胞，24 h成熟率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而各組的GⅤ期卵母細胞24 h成熟率及卵母細胞24 h總成熟率比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且ALA 50 μmol/L組顯著高于對照組及ALA 200 μmol/L組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.2對照組和ALA50 μmol/L組成熟卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)比較ALA50 μmol/L組卵母細胞線粒體拷貝數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見表3。

3　討論

在卵母細胞的IVM體系中添加某些特定物質(zhì)（如血清、特定的激素、抗氧化劑等）可以提高培養(yǎng)體系的效率。雖然不同物質(zhì)作用機制不同，但是在一定程度上可以改善卵母細胞IVM體系，提高卵母細胞成熟率和胚胎發(fā)育潛能。本實驗探討不同濃度ALA對人未成熟卵母細胞體外成熟和卵母細胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響，有望以此提高患者卵母細胞的利用率和發(fā)育潛能。

表2　不同濃度ALA對人類MⅠ/GⅤ期卵母細胞體外成熟情況比較

表3　對照組和ALA50 μmol/L組成熟卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)比較

ALA可充當前列腺素（PGs）合成的前體物質(zhì)，而前列腺素E2（PGE2）被認為是卵母細胞成熟的關鍵介質(zhì)。PGE2通過卵丘細胞上的自分泌/旁分泌途徑介導的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，PTGERs）通路起作用，作為第二信使刺激細胞內(nèi)cAMP增加。IVM培養(yǎng)液中添加ALA可增加卵母細胞內(nèi)cAMP含量，高濃度的cAMP介導ALA對卵母細胞的核成熟。同時，有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）也是卵母細胞成熟的必需物。增加MAPK活性可加速減數(shù)分裂的恢復和生殖泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD），從而提高卵母細胞的核成熟率。Marei等[2]的研究推測，一方面ALA通過增加PGE2促進卵母細胞成熟，另一方面ALA依賴于MAPK途徑（或通過增加胞內(nèi)cAMP水平）加速GVBD從而促進GⅤ期卵母細胞成熟。

據(jù)報道ALA在山羊竇狀卵泡中的濃度范圍是64.6～100.6 μmol/L，在牛血漿中的濃度是53.9～143.66 μmol/L，在卵泡液中的濃度是35.9～71.8 μmol/L[3-4]，在子宮內(nèi)膜組織中的濃度是71.8 mmol/L。據(jù)此，本研究選用濃度范圍0～200 μmol/L的ALA對人未成熟卵母細胞進行IVM，也能在一定程度上反映正常的生理狀況。

本實驗中ALA 50 μmol/L組的卵母細胞24 h成熟率最高，且與ALA 200 μmol/L組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這表明50 μmol/L ALA比高濃度（200 μmol/L）ALA更有利于人卵母細胞的體外成熟，且對GⅤ期卵母細胞的作用比對MⅠ期卵母細胞作用更明顯。對牛、羊卵母細胞體外培養(yǎng)的研究結果表明，50 μmol/L ALA促進卵母細胞成熟，并提高卵母細胞的發(fā)育潛能，而更高濃度的ALA降低了卵母細胞成熟率[2，5-6]。

MⅠ期卵母細胞比GⅤ期卵母細胞體外培養(yǎng)成熟率高，成熟所需條件相對較低，本實驗結果與此符合。但不同濃度ALA對GⅤ期卵母細胞的作用比對MⅠ期卵母細胞的作用明顯，可能因為ALA能使卵母細胞內(nèi)MAPK1和MAPK3磷酸化水平升高，MAPKs也是卵母細胞成熟的必需物，增加MAPK活性可加速減數(shù)分裂的恢復和GVBD，從而提高卵母細胞的核成熟率[7]。因此認為適宜濃度ALA對人GⅤ期卵母細胞體外成熟有積極作用，關于ALA對MⅠ期卵母細胞的影響機制有待研究。

卵母細胞體外成熟的難題之一就是核、質(zhì)成熟同步性的問題。由于IVM得到的卵母細胞的核、質(zhì)發(fā)育不同步，所以胚胎的發(fā)育潛能受到影響。本實驗觀察卵母細胞的成熟以第一極體的排出為標志，對胞質(zhì)的成熟沒有直接的測量指標，但是本實驗研究組的相關研究顯示，經(jīng)ALA培養(yǎng)的卵母細胞卵裂率有所提高，且形成囊胚數(shù)增多。提示ALA對卵母細胞胞質(zhì)成熟起了重要作用，一定程度上提高卵母細胞的發(fā)育潛能[8]。但是對ALA如何促進IVM卵母細胞核質(zhì)成熟同步、改善卵母細胞質(zhì)量，仍需進一步探索。

在卵母細胞成熟過程中，線粒體（數(shù)目、膜電位、形態(tài)和位置等）也發(fā)生明顯的變化。mtDNA拷貝數(shù)是隨之增加的[9]。已有研究表明卵母細胞中mtDNA的含量與受精結局和胚胎發(fā)育力密切相關[10-11]。由于mtDNA拷貝數(shù)可以表示卵母細胞中mtDNA的含量[12]，所以保證受精后胚胎能完成發(fā)育的mtDNA拷貝數(shù)就是卵母細胞MⅡ期中線粒體的含量[13]。有研究認為體外培養(yǎng)環(huán)境中氧含量高于體內(nèi)環(huán)境可導致體外成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)、三磷酸腺苷（ATP）和活性氧簇（ROS）產(chǎn)量等都顯著低于體內(nèi)成熟卵母細胞，線粒體分布也不同于體內(nèi)成熟卵母細胞[14]。但本實驗發(fā)現(xiàn)來自ALA組的MⅡ期卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)顯著增多，表明ALA可增加卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)。這可能與ALA在體外培養(yǎng)中作為一種潛在抗氧化劑，發(fā)揮抗氧化應激作用有關[15]。Marei等[6]分別用亞油酸（100 μmol/L）和ALA（50 μmol/L）體外培養(yǎng)牛未成熟卵母細胞，發(fā)現(xiàn)卵母細胞的核成熟率增加，亞油酸減少了細胞內(nèi)ROS水平。Ge等[16]發(fā)現(xiàn)在小鼠卵母細胞體外成熟過程中，mtDNA拷貝數(shù)的減少也影響胚胎的發(fā)育潛能。本實驗研究組發(fā)現(xiàn)在IVM培養(yǎng)液中添加ALA能夠提高卵裂率，增加囊胚形成數(shù)[8]。這可能與本實驗中ALA培養(yǎng)的卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)增加有關。因為保證受精后胚胎能完成發(fā)育的mtDNA拷貝數(shù)就是卵母細胞MⅡ期中線粒體的含量[13]。當然也有觀點認為在代謝原料減少等特殊情況下，細胞會反應性地增加mtDNA的拷貝數(shù)，試圖產(chǎn)生更多的線粒體[17]。但是就本實驗中卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)的增加在一定程度上反映了ALA對卵母細胞成熟的影響。

在影響IVM結局的諸多因素中，IVM體系直接關系到卵母細胞成熟及其形成胚胎的質(zhì)量。盡管目前將各種促成熟物質(zhì)添加至體外培養(yǎng)液中的方法較常見，但仍然難以改善IVM治療結局。因此還應擴大樣本量進一步研究ALA的作用機制，為提高IVM結局及增加累積臨床妊娠率提供新思路。

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[本文編輯王昕]

Effect of Linolenic Acid on Mitochondrial DNA Copy Numbers of Human Oocyte Derived from in Vitro Maturation

HU Ji-jun,SUN Li-jun,GUAN Yi-chun,HAO Da-yong,MA Xiao-juan,QI Ruo-Fan,DONG Xiao-zhen.
Reproductive Medicine Center,the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Correspondirng author:SUN Li-jun,E-mail:docslj@sina.com

Objective:To explore the effect of alpha-linolenic acid(ALA)on human oocytes maturation and the mitochondrial DNA（mtDNA）copy numbers of oocyte.Methods:A total of 441 morphologically normal immature oocytes were recruited from 273 infertile women underwent ICSI in our Center from October 2014 to October 2015.There were 179 oocytes at MⅠstage and 262 oocytes at GⅤstage.Oocytes with the same proportion of MⅠand GⅤwere randomly divided into 5 groups,and in vitro cultured for 24 hours in the medium with ALA at different level[0（as control）,10 μmol/L,50 μmol/L,100 μmol/L,200 μmol/L].The oocyte maturation was observed,and the mtDNA copy numbers in the ALA 0 μmol/L(as control)group and the ALA 50 μmol/L group were determined by real-time PCR.Results:①The total maturation rate of the ALA 50 μmol/L group（70.1%）was significantly higher than that of the control group（42.1%）and the ALA 200 μmol/L group（34.1%,both P＜0.05）.②The total maturation rate of GⅤin the ALA 50 μmol/L group（64.4%）was significantly higher than that in the control group（28.9%）and the ALA 200 μmol/L group（18.2%,both P＜0.05）.③The mtDNA copy number of in vitro matured oocytes in the ALA 50 μmol/L group（3.64×107±1.85×106）was significantly higher than that in the ALA 0 μmol/L group（3.42×106±1.95×105,P＜0.05）.Conclusions:50 μmol/L ALA can increase the mtDNA copy number of the in vitro matured human oocyte,suggesting that ALA can promote the in vitro maturation of human oocyte.

Alpha-linolenic acid;Oocytes;Cell culture techniques;DNA,mitochondrial

2014年度河南省醫(yī)學科技攻關計劃普通項目（201403109）

450052鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心

孫麗君，E-mail:docslj@sina.com

（2016-08-11）