張濤，阿力木·熱合曼，張云宇,邵齊，吳冠偉

(新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，烏魯木齊 830063)

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miR-451在腎癌患者血清中的異常表達及其臨床意義

張濤，阿力木·熱合曼，張云宇,邵齊，吳冠偉

(新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，烏魯木齊 830063)

目的 檢測miR-451在腎癌患者血清中的表達，研究miR-451與腎癌患者臨床病理特征之間的關聯(lián)性。方法 收集35例新診斷腎癌患者術(shù)前血清樣本，另外收集35例健康體檢者血清樣本做為對照，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-451在腎癌患者血清中的表達情況，分析腎癌患者臨床病理特征和miR-451表達量兩者之間的關系。結(jié)果 與對照組比較，腎癌組患者血清中miR-451表達量明顯低于健康體檢組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在35例腎癌患者血清樣本中，27例(77.14%)miR-451下調(diào)，而8例(22.86%)則表現(xiàn)為上調(diào)。腎癌患者的性別、年齡、腎癌組織類型、腎腫瘤大小、TNM分期和腎癌患者血清中miR-451表達量無相關性(P>0.05)。結(jié)論 miR-451在腎癌患者血清中低表達，提示其可能與腎癌的發(fā)生和發(fā)展相關。

腎腫瘤；微RNAs；基因表達

腎細胞癌(RCC)簡稱腎癌，是泌尿系統(tǒng)三大腫瘤之一，占全身腫瘤的3%，是比較常見的一種腎臟惡性腫瘤，而且最近十年來腎癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)比較明顯的上升趨勢[1-4]。探索能對腎癌患者進行早期診斷的腫瘤生物標志物，成為當前研究的熱點問題。已經(jīng)證實[5]microRNA(miRNA)是機體處于正常狀態(tài)下以及病理狀態(tài)下細胞的重要分子成分。miR-451在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等腫瘤中異常表達[6-8]，有關miR-451與腎癌方面的研究很少，本研究旨在探討miR-451在腎癌患者血清中的表達水平，及其與腎癌患者臨床病理特征之間的關聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2014年1月至2015年12月期間初次就診并診斷為腎細胞癌的患者(術(shù)后病理證實)35例為腎癌組，其中男27例，女8例；年齡為35～68歲。平均年齡(50±13)歲。選取同一時間在我院健康體檢中心35例健康體檢者作為健康對照組，男26例，女9例；年齡為38～59歲。平均年齡(48±12)歲。兩組人員在年齡、性別、族別的比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腎癌組和健康對照組所有人員均在抽取血標本前被詳細告知本研究項目，同意并簽署了知情同意書，本課題研究通過了新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 采樣 腎癌組(在行手術(shù)前)和健康對照組均采集空腹血標本，在5 h內(nèi)進行以下處理：3000 r/min,離心10 min，4 ℃，收集上層血清后保存于-80°C冰箱中待用。

1.2.2 總RNA的提取 遵循mirVanaTMPARISTMKit(Ambion,USA)說明書來操作進行提取總RNA。流程如下；提取300 μL血清，混入300 μL的變性液待混勻后，將acidic phenol:chloroform滴入，進行離心，離心后在上清液中滴入無水乙醇，給予多次的離心與洗脫，洗脫液60 μL加熱到95 °C后來洗脫RNA，這時保存收集到的RNA液于-80 °C冰箱中，準備下一步進行反轉(zhuǎn)錄(在2 h之內(nèi))。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 特異性反轉(zhuǎn)錄引物是由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成，Has-miR-451反轉(zhuǎn)錄引物序列： 下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，上游引物：5′-GCGGCGGAAAAGTGCTTACAGTG-3′，5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT-3′ 。

Has-U6反轉(zhuǎn)錄引物序列：下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。合成目的基因 c DNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo scientific)。

1.2.4 實時熒光定量 PCR 應用 Maxima SYBR Green qPCR Kit(Thermo scientific)試劑盒來實施定量,具體步驟嚴格遵循說明書來操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0 軟件處理數(shù)據(jù)，先對基因相對表達量數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，對不服從正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后其數(shù)值服從正態(tài)分布規(guī)律，兩組數(shù)據(jù)間差異比較使用t檢驗或方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-451在腎癌患者血清中的表達 對35例腎癌患者術(shù)前血清與健康對照組血清中miR-451的表達水平進行定量分析，結(jié)果顯示：與健康對照組比較,miR-451在腎癌患者血清中低表達，在35例腎癌血清樣本中，有27例miR-451出現(xiàn)下調(diào)(77.14%)，而8例則表現(xiàn)為上調(diào)(22.86%)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 miR-451表達水平與臨床資料的關聯(lián)性 根據(jù)腎癌患者的性別、年齡、腎癌組織類型、腎腫瘤大小、TNM分期和腎癌患者血清中miR-451表達無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 血清中miR-451表達與腎癌臨床病理的關系

3 討論

miRNA是一類短鏈的小分子非編碼RNA，通過結(jié)合靶信使RNA的非翻譯區(qū)，控制影響靶mRNA的翻譯后的調(diào)節(jié)，進而來調(diào)節(jié)多種生物進程。在腫瘤的研究中，miRNA被認為是可行的腫瘤標記物[9]，miRNA可能在發(fā)揮抑癌基因或者促癌基因的作用[10]，參與調(diào)節(jié)細胞周期各環(huán)節(jié)，對細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程發(fā)揮重要作用[11-12]。VEGF、HIF等腎癌的多種分子機制都和miRNA的調(diào)控相關[13-14]。既往關于腫瘤的miRNA研究主要以腫瘤組織及腫瘤旁組織為標本，然而作為腫瘤標記物腫瘤組織的取材是非常困難的，而且創(chuàng)傷非常大，因此不適合作生物標記物。然而血清具有創(chuàng)傷小，抽取便捷，同時能夠反復操作的優(yōu)點，是作為腫瘤標記物的理想介質(zhì)。國外學者研究[15]發(fā)現(xiàn)血清miRNA可以非常穩(wěn)定地存在，更為重要的發(fā)現(xiàn)是腎癌患者血清中循環(huán)miRNA的表達水平和腎細胞癌組織具有一致性[16]。這讓miRNA成為腫瘤標志物的前景變得光明。

miR-451相鄰于癌基因人類表皮生長因子受體2(HER2)的17q11.2-21,位于染色體17q11.2。miR-451在人類各個系統(tǒng)中存在，對于心血管系統(tǒng)病變、腫瘤、血液系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等都有非常顯著的影響[17-18]。miR-451可以抑制癌細胞的分化和癌細胞增殖，同時它還可以導致癌細胞加速凋亡[19-21]。

近來國內(nèi)外研究提示miR-451在多種腫瘤中異常表達。然而關于miR-451在腎癌中的表達相關報道很少。本研究檢測到miR-451在腎癌血清組中的表達與健康對照組相比明顯呈現(xiàn)低表達，提示在腎癌發(fā)生發(fā)展中miR-451很可能起一個抑癌基因的作用，可能抑制某種已知或者未知的轉(zhuǎn)錄因子，從而導致腎臟例行的轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生變化，從而導致腎癌的發(fā)生。循環(huán)miR-451的表達水平和臨床相關指標如年齡、性別、腫瘤直徑、Fuhrman分級、腫瘤直徑、TNM分期無關，這表明血清miR-451表達穩(wěn)定，受其他因素影響小，miR-451表達水平改變可能是促使腎癌發(fā)生發(fā)展的因素之一，血清miR-451下調(diào)有可能發(fā)生于腎細胞癌早期，有望作為腎癌早期分子標記物。

[1] SIEGEL R,MA J,ZOU Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[2] CHOW WH，DONG LM，DEVESA SS.Epidemiology and risk factors for kidney cancer[J].Nat Rev Urol，2010，7(5)：245-257.

[3] AZEEM K，KOLLAROVA H，HORAKOVA D,et al.Genetic syndromes associated with renal cell carcinoma：a review[J].Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2011，155(3)：231-238.

[4] XIAO H,ZENG J,LI H,et al.MiR-1 downregulation correlates with poor survival in clear cell renal cell carcinoma where it interferes with cell cycle regulation and metastasis[J].Oncotarget,2015,6(15):13201-13215.

[5] LIN S，GREGORY RI.MicroRNA biogenesis pathways in cancer[J].Nat Rev Cancer，2015，15(6)：321-333.

[6] SU Z,ZHAO J,RONG Z,et al.MiR-451,a potential prognostic biomarker and tumor suppressor for gastric cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(8):9154-9160.

[7] LI Y,WANG J,DAI X,et al.miR-451 regulates FoxO3 nuclear accumulation through Ywhaz in human colorectal cancer[J].Am J Transl Res,2015,7(12):2775-2785.

[8] GU X,LI JY,GUO J,et al.Influence of MiR-451 on drug resistances of paclitaxel-resistant breast cancer cell line[J].Med Sci Monit,2015,21:3291-3297.

[9] LIN XJ，CHONG Y，GUO ZW，et a1.A serum microRNA classifier for early detection of hepatocellular carcinoma：a multicentre，retrospective，longitudinal biomarker identification study with a nested case-control study[J].Lancet Oncol，2015，16(7)：804-815.

[10] SERVIN-GONZáLEZ LS,GRANADOS-LóPEZ AJ,LóPEZ JA.Families of microRNAs expressed in clusters regulate cell signaling in cervical cancer[J].Int J Mol Sci,2015,16(6):12773-12790.

[11] ZHU D，PAN CY，LI L，et a1.MicroRNA-17/20a/106a modulate macrophage inflammatory responses through targeting signal-regulatory protein[J].J Allergy Clin Immunol，2013，132(2)：426-436.

[12] ZHU M，ZHANG N，HE S，et a1.MicroRNA-106a targets TIMP2 to regulate invasion and metastasis of gastric cancer[J].FEBS Lett，2014，588(6)：600-607.

[13] MATHEW LK，LEE SS，SKULI N，et a1.Restricted expression of miR-30c-2-3p and miR-30a-3p in clear cell renal cell carcinomas enhances HIF2alpha activity[J].Cancer Discov，2014，4(1)：53-60.

[14] CANCER GENOME ATLAS RESEARCH NETWORK.Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma[J].Nature，2013，499(7456)：43-49.

[15] GILAD S，MEIRI E，YOGEV Y，et a1.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoS One,2008,3(9):e3148.

[16] TSUJIURA M，ICHIKAWA D.KOMATSU S，et al，Circulating microRNAs in plasma of patients with gastric cancers[J].Br J Cancer，2010，102(7)：1174-1179.

[17] PAPAPETROU EP，KORKOLA JE.SADELAINM，et al.A genetic strategy for single andcombinatorial analysis of miRNA function in mammalian ematopoietlc stem cells[J].Stem Cells，2010，28(2)：287-296.

[18] BOSTJANCIC E，ZIDAR N，GLAVAC D.MicroRNA microarray expression profiling inhuman myocardial infarction[J].Dis Markers，2009，27(6)：255-268.

[19] BANDRES E,BITARTE N,ARIAS F,et a1.microRNA-451 regulates macrophagemigration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J].Clinical Cancer Research，2009，15(10)：2281-2290.

[20] 姚莉，孫艷，查何，等.miRNA-451表達質(zhì)粒的構(gòu)建及對人A549肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡的影響[J].重慶醫(yī)科大學學報，2012，37(10):841-846.

[21] GODLEWSKI J，NOWICKI MO，BRONISZ A，et a1.Microrna-451 regulateslkbl/ampk signaling and allows adaptation to metabolic stress in glioma cells[J].Mol Cell，2010,37(5):620-632.

The miR-451 expression in the serum of patients with renal cell carcinoma

ZhangTao,Alimu·Reheman,ZhangYunyu,ShaoQi,WuGuanwei

(DepartmentofUrology,SecondAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830063,China)

Objective To investigate the miR-451 expression in the serum of patients with renal cell carcinoma and the correlations between the miR-451expression and clinical pathologic characteristics.Methods A total of 35 serum samples in patients with RCC were collected before the surgery .35 healthy subjects were collected as the control.The real-time PCR was used to detect the expression of miR-451 in patients with RCCand healthy controls.Results The expression of miR-451 in the serum of patients with RCC is decreasd compared with the health control(P<0.05).Among the 35 serum samples of the patients with RCC, the miR-451 expression were down-regulated in 27 samples(77.14% ) ,and up-regulated in 8 samples (22.86%).Expression of miR-451 was not related with the age of patients,the gender，tumor size ,histology and TNM stage.Conclusion Reduced miR-451 expression may be involved in the oncogenesis and development of patients with RCC.

Kidney neoplasms；MicroRNAs；Gene expression

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(2014211C086)

張濤，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，Email：13999990532@163.com

R737.11

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.011

2016-08-17)