梁青龍，郭婷婷，溫揚敏

泉州醫(yī)學高等專科學?；A醫(yī)學部，福建泉州 362011

欖綠粗葉木粗多糖提取工藝及對H22肝癌細胞毒性影響

梁青龍，郭婷婷，溫揚敏

泉州醫(yī)學高等?？茖W?；A醫(yī)學部，福建泉州 362011

目的 研究欖綠粗葉木多糖提取工藝優(yōu)化及對H22肝癌細胞增殖抑制效果。方法 2016年2—5月從福建寧化泥坑村采集欖綠粗葉木粗，在單因素分析的基礎上，設計3因素3水平正交實驗優(yōu)化欖綠粗葉木粗多糖提取工藝。并采用MTT法測定欖綠粗葉木粗多糖對H22肝癌細胞增殖抑制效果。 結果 影響欖綠粗葉木粗多糖提取的首要因素是固液比，其次是水浴時間和溫度。粗多糖最佳提取條件為：溫度70℃、時間12 h、固液比為1∶15 (A2B2C3)。粗多糖對H22肝癌細胞具有一定增殖抑制活性，抑制效果隨粗多糖濃度增大而增加。 結論 水提醇沉淀法欖綠粗葉木多糖提取有效方法，欖綠粗葉木多糖具有抑制腫瘤細胞增殖作用。

粗多糖；提取工藝；正交試驗；肝癌

1 資料與方法

1.1 實驗材料與試劑

欖綠粗葉木由福建寧化泥坑村采擷，經(jīng)過泉州林業(yè)局林彥云先生鑒定；氯仿、無水乙醇、硫酸和正丁醇等蒽酮和葡萄糖，肝癌細胞株、胎牛血清、培養(yǎng)基、MTT試劑盒等。

1.2 實驗方法

1.2.1 溫度對粗多糖提取率的影響 將欖綠粗葉木根用刀切成長約2～3 cm，寬約0.5～1 cm小塊。稱取50 g，放入1 000 mL三角瓶，再加入固液比(g/mL)為1∶10去離子水。分別放到40、50、60、70、80℃的水浴鍋中水浴8 h后，用定性濾紙對上清液進行過濾，濾液再用Sevag法除去蛋白后，用終濃度為80%乙醇溶解，4℃過夜沉淀。冷凍干燥得到粗多糖粉末，每組實驗設3個平行。

1.2.2 固液比對粗多糖提取率的影響 稱取欖綠粗葉木根50 g，分別加入固液比(g/mL)為1:4、1:8、1:12、1: 16、1:20去離子水。于50℃水浴鍋中水浴8 h，每組實驗設3個平行。粗多糖提取同1.2.1。

1.2.3 時間對粗多糖提取率的影響 稱取欖綠粗葉木根50 g，分別加入固液比(g/mL)為1:12去離子水。于50℃水浴鍋中水浴3、6、12、24、36 h，每組實驗設3個平行。粗多糖提取同1.2.1。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化粗多糖提取工藝 采用L9(34)正交進行正交試驗優(yōu)化多糖提取工藝，實驗因素及水平見表1。

表1 實驗因素與水平

1.3.5 粗多糖測定 粗多糖含量的測定應用蒽酮比色法[5]。標準曲線方程：y=0.5934x+0.4321，R2=0.9997。粗多糖提取率(%)=（粗多糖質(zhì)量/根質(zhì)量）×100%。

1.3.6 欖綠粗葉木粗多糖對H22肝癌細胞增殖抑制實驗 H22肝癌細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，分裝于96孔板，每孔100 μL調(diào)節(jié)細胞密度約為6 000個細胞每孔。每孔分別加入終濃度為0（空白對照組）、0.5，1.0、2.0、4.0 mg/mL的粗多糖。于5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48、72 h后，采用MTT法分別測定細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1－實驗組吸光度/空白對照組吸光度)×100%

2 結果與分析

2.1 溫度對粗多糖提取率的影響

隨著溫度增加，欖綠粗葉木粗多糖提取率增大（見圖1）。當溫度達到60℃以上時，粗多糖提取率趨于穩(wěn)定。與溫度為30℃比較，在60、70、80℃條件下粗多糖提取率均差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而60、70、80℃條件下，各組粗多糖提取率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。表明60、70、80℃條件下，粗多糖提取率較高且比較穩(wěn)定。

圖1 溫度對粗多糖提取率的影響

2.2 固液比對粗多糖提取率的影響

固液比小于1:12 mg/mL時，隨水量增加，粗多糖提取率迅速增大。而當固液比達到1∶12 mg/mL時，固液比繼續(xù)增加欖綠粗葉木粗多糖的提取率無顯著增加（圖2）?？紤]到水量大，后續(xù)蒸發(fā)時間過長，耗時費力，且可能破壞粗多糖，所以選擇固液比1:12 mg/mL比較合適。

圖2 固液比對粗多糖提取率的影響

2.3 時間對粗多糖提取率的影響

水浴時間＞24 h時，欖綠粗葉木粗多糖提取率隨時間增加而增大，水浴時間24 h時提取率最大（圖3）。與水浴時間24 h比較，水浴3 h和6 h實驗組粗多糖提取率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而水浴12 h和36 h實驗組粗多糖提取率差異無統(tǒng)計學意義。顯示繼續(xù)延長處理時間對粗多糖提取率無顯著影響。

圖3 時間對多糖提取率的影響

2.4 正交實驗優(yōu)化粗多糖提取工藝

表2 正交實驗結果

以粗多糖提取率為指標，采用3因素3水平正交實驗對欖綠粗葉木粗多糖提取工藝進行優(yōu)化，結果見表1。直觀分析顯示影響粗多糖提取的主次順序依次為：固液比、水浴時間和水浴溫度(C＞B＞A)。方差分析(表2)顯示，固液比對欖綠粗葉木粗多糖提取率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而溫度和時間對欖綠粗葉木粗多糖提取率差異有高度統(tǒng)計學意義(0.15＜P＜0.01)。綜合考慮欖綠粗葉木粗多糖提取最佳工藝是溫度70℃、時間12 h、固液比為1∶15(A2B2C3)。見表3。

表3 粗多糖提取的正交實驗方差分析

2.5 粗多糖對肝癌細胞毒性作用

欖綠粗葉木粗多糖對H22肝癌細增殖抑制作用見圖4，培養(yǎng)24 h后，不同粗多糖濃度對H22肝癌細抑制差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。細胞培養(yǎng)48 h和96 h，腫瘤細胞的生長抑制率顯著增加，且隨粗多糖濃度增大而增加。

圖4 多糖對H22肝癌增殖抑制率的影響

3 討論

分離及純化是研究多糖功能及性質(zhì)的前提，水提醇沉淀法是粗多糖提取最原始且應用最廣泛的方法。其原理是利用粗多糖不溶于有機溶劑，在粗多糖提取水溶液中加入高濃度乙醇等使粗多糖沉淀析出，從而達到初步分離的目的[6]。該方法具有簡單、經(jīng)濟、條件溫和不會破壞粗多糖等特點，已廣泛應用于多糖提取。張國華等[7]以多糖提取率為指標，采用正交試驗研

究冬蟲夏草多糖的提取工藝。結果顯示加水量10：1，時間0.5 h，提取3次時提取率最高。乙醇濃度67%時多糖沉淀效果最佳。提示影響粗多糖提取的主要因素包括提取時間、溫度、固液比及pH值等，通過優(yōu)化提取工藝提高粗多糖提取率是的主要手段之一。羅忠圣等[8]研究水提醇沉淀對中藥復方二巖虎果湯的提取工藝，顯示最佳提取條件為10倍量水，提取1次，1 h/次，表明該方法穩(wěn)定可行,且不影響藥效。該研究通過對欖綠粗葉木粗多糖提取工藝進行優(yōu)化，可較大程度提高粗粗多糖提取率。其中正交試驗最佳提取率（A2B3C3）粗多糖提取率達1.77%，比最低提取率（A1B1C1）粗多糖提取率達1.15%提高了53.91%。

腫瘤已成為導致人類死亡的主要疾病之一，隨著癌癥診斷和治療技術的改善和癌癥患者成活率不斷提高[9]。并由于現(xiàn)代人們不良生活習慣，環(huán)境污染因素影響以及人口增長及老齡化等原因，全球癌癥幸存者的數(shù)量越來越多[10]。在腫瘤的治療和預防中，藥物占有不可替代的地位。天然抗腫瘤活性成分也是合成化學類抗腫瘤藥物的先導化合物。天然藥物一直是人類獲得藥物的主要途徑，時至今日天然藥物仍是活性成分或先導化合物發(fā)現(xiàn)的重要途徑[11]。植物多糖可通過增強機體免疫活性、誘導腫瘤細胞分化與等發(fā)揮抗腫瘤作用。從香菇分離的多糖已應用到抗腫瘤的臨床治療，香菇多糖能極顯著增高NK細胞活性，提高血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的含量，并通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而達到良好抗腫瘤效果[12]。朱坤杰等[13]從庫拉索蘆薈多糖和木立蘆薈中提取多糖，顯示不同劑量的庫拉索蘆薈多糖和木立蘆薈多糖均具有一定腫瘤抑制活性，其中高劑量組抑制率達45.45%和46.89%。另外，還能恢復荷瘤機體免疫功能紊亂，特別是增加脾臟的免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，肖佩玉等[14]研究表明枸杞多糖也改善荷瘤小鼠免疫活性而抑制小鼠H22肝癌細胞生長。給藥10 d后可見腫瘤減小，AFP、CEA、TNF-α含量降低，而NK細胞活性增強。實驗表明，欖綠粗葉木提取物具有抗氧化、抗菌、抑制食管癌細胞等活性。顯示欖綠粗葉木多糖對H22肝癌細胞具有較強體外抑制活性，細胞培養(yǎng)48 h后，不同濃度粗多糖對H22肝癌細胞增殖均具有一定抑制作用，且抑制率隨粗多糖濃度增加而增大。

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Extraction of Crude Polysaccharides from L.lancilimbus and Inhibition of Hepatoma Cell Lines H22 in Vitro

LIANG Qing-long，GUO Ting-ting，WEN Yang-min
Department of Basic Medical Sciences,Quanzhou Medical College,Quanzhou,Fujian Province，362011 Chinia

Objective Extraction technology and inhibition of Hepatoma cell Lines H22 in Vitro of crude polysaccharides from L.lancilimbus were researched.Methods L.lancilimbus were collected from Nikeng village,Ninghua country,Fujian provience from February to May in 2016.Orthogonal experiment was applied to obtain the optimum extraction condition on the base of single factor experiment.the inhibitions of hepatoma cell Lines H22 in Vitro of crude polysaccharides were measured by MTT assay.Results The main factor affecting extracting rate of polysaccharides was solid-liquid ratio,followed by treated time and temperature.The optimum extraction conditions to obtain the highest polysaccharides were 70℃,12 h and solid-liquid ratio of 1∶15.polysaccharides from L.lancilimbus could inhibit cell proliferation of hepatoma cell Lines H22 in Vitro,and the inhibition rate increased with the polysaccharides concentration.Conclusion Water extracting-ethanol precipitation method were applicable for extraction crude polysaccharides from L.lancilimbus,and the polysaccharides can inhibit cell proliferation of gastric cancer cell in Vitro.

Crude Polysaccharides;Extraction technology;Orthogonal test;Hepatoma

R284.2

A

2096-1782（2016）11－0114-04

泉州市科技計劃項目（2012Z76)。

梁青龍（1958.11-），男，福建泉州人，本科，副教授，研究方向：生理學。

2016-08-15）

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.11.114

植物多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化等多種生物活性，且兼有較小毒副作用和體內(nèi)無殘留等優(yōu)點[1]。植物多糖的開發(fā)與利用已越來越受關注。欖綠粗葉木(Lasianthus lancilimbus,Merr.)屬于茜草科（Rubia cordifolia L.）、粗葉木屬（Lasianthus Jack,nom.cons.）的一個變種[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)實踐表明粗葉木屬植物具有治療筋骨疼痛，活血止痛等作用，民間還將其用于治

濕熱黃疸等[3]。應用現(xiàn)代分離純化技術，已從粗葉木屬中的長尾粗葉木[4]等中獲得多種具有確定生理活性的單體物質(zhì)，而有關欖綠粗葉木藥理開發(fā)研究較少。該文于2016年2—5月對欖綠粗葉木粗多糖提取工藝優(yōu)化及對H22肝癌細胞增殖抑制作用進行研究，為欖綠粗葉木植物的醫(yī)藥價值研究提供基礎。