崔立華，張淑坤，卓玉珍，李彩霞，張　一，劉洪斌，崔乃強(qiáng)

實驗研究

Fingolimod對小鼠慢性胰腺纖維化的抑制作用

崔立華1，張淑坤1，卓玉珍1，李彩霞1，張一1，劉洪斌2，崔乃強(qiáng)3

目的：觀察新型免疫抑制劑Fingolimod(FTY720)對雨蛙素致小鼠慢性胰腺纖維化的治療作用。方法：健康雄性C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為對照組、模型組和FTY720治療組。模型組和治療組腹腔注射雨蛙素，50 μg·kg-1·次-1，1周3次，連續(xù)6周；治療組于第5周開始注射FTY720，1 mg·kg-1·d-1，持續(xù)2周；對照組腹腔注射等量的生理鹽水。于第7周第1天留取胰腺組織，行HE染色和苦味酸-天狼星紅染色，分別于光鏡和偏振光顯微鏡下觀察病理改變和評分，并用免疫組織化學(xué)染色法觀察α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、CD3、FOXP3表達(dá)情況。結(jié)果：模型組病理評分中，腺泡萎縮為2.52±0.36，炎細(xì)胞浸潤為3.42±0.31，纖維化程度為3.25±0.42，顯著高于對照組的病理評分。模型組α-SMA表達(dá)為25.33±5.64，CD3表達(dá)為68.83±8.38，F(xiàn)OXP3表達(dá)為34.83±6.85，均顯著高于對照組（分別為0.33±0.52，1.83±0.75，1.33±0.82）。治療組病理評分中，腺泡萎縮為1.69± 0.27，炎細(xì)胞浸潤為2.34±0.33，纖維化程度為2.19±0.35，均較模型組明顯減少。治療組胰腺組織中α-SMA表達(dá)為12.33±2.58，CD3為25.00±4.93，F(xiàn)OXP3為17.33±4.41，也明顯低于模型組。結(jié)論：FTY720能明顯減少雨蛙素所致的T淋巴細(xì)胞浸潤和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，在一定程度上減輕胰腺間質(zhì)膠原的表達(dá)，從而抑制胰腺纖維化程度。

FTY720；胰腺纖維化；雨蛙素；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

Treg）是T淋巴細(xì)胞中的CD4+細(xì)胞群，有研究證實心梗后Treg能減輕心臟重塑[7]，此外Treg還與肝、肺纖維化密切相關(guān)[8-9]。本研究通過雨蛙素反復(fù)刺激制備胰腺纖維化模型，同時FTY720進(jìn)行干預(yù)，探討FTY720對于胰腺纖維化的作用及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動物健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量19～22 g，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2主要試劑與儀器FTY720購自MCE公司，雨蛙素為Sigma產(chǎn)品。小鼠I型膠原試劑盒購自CUSABIO公司。天狼星紅購自Fluka公司。兔抗小鼠CD3,FOXP3抗體購自abcam公司，兔抗小鼠α平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗體購自Santa Cruz公司。DM4000B型研究級顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品，BX53型偏振光顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.3分組及模型制作健康雄性C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為3組。模型組和治療組每周1、3、5腹腔注射雨蛙素，每天6次，注射間隔為1 h，劑量每次50 μg/kg，連續(xù)6周[10]。治療組注射雨蛙素4周后,每天注射雨蛙素前30 min給予FTY720 1 mg·kg-1·d-1，持續(xù)到第6周。對照組僅注射生理鹽水。實驗結(jié)束后麻醉、開腹，留取胰腺組織，福爾馬林固定。

1.4HE普通病理組織學(xué)觀察及評分福爾馬林固定的組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm切片，行HE染色，光鏡下觀察，并進(jìn)行胰腺腺泡細(xì)胞萎縮、炎性細(xì)胞浸潤及纖維化程度評分[11]。

1.5苦味酸-天狼星紅染色切片脫蠟水化，蒸餾水洗3次，入飽和苦味酸-天狼星紅液染15 min，流水沖洗浮色，無水乙醇分化，鏡下控制染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下和偏振光顯微鏡觀察胰腺纖維化及膠原分型。

1.6免疫組織化學(xué)染色觀察α-SMA、CD3、FOXP3表達(dá)情況胰腺組織切片常規(guī)脫蠟至水，加入1∶100稀釋的α-SMA、CD3、FOXP3一抗，4℃過夜（PBS代替一抗作陰性對照），然后加入羊抗兔/羊抗鼠IgG-HRP作用30 min。DAB顯色,蘇木精復(fù)染。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽性細(xì)胞。用Leica Image Analysis軟件，對各組切片單位面積陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析，每張切片任取10個視野取其平均值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異采用方差分析，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1病理組織學(xué)觀察及評分對照組胰腺組織小葉結(jié)構(gòu)基本正常。模型組胰腺組織中小葉腺泡萎縮、消失，小葉間質(zhì)明顯纖維組織增生，大量炎性細(xì)胞浸潤（圖1）。治療組腺泡仍有部分腺泡萎縮，纖維增生不明顯，有炎細(xì)胞浸潤，與模型組相比，腺泡萎縮、炎細(xì)胞浸潤及纖維化程度評分有明顯的下降（表1）。

圖1　胰腺組織HE染色（100×）

2.2苦味酸天狼星紅膠原染色觀察胰腺間質(zhì)膠原增生情況模型組小鼠胰腺組織中膠原纖維含量較對照組明顯增多，且以黃、橙、紅色的粗纖維狀Ⅰ型膠原纖維為主。治療組胰腺組織中的膠原纖維比模型組明顯減少，膠原主要分布在胰腺小葉間，腺泡之間較少（圖2）。

表1　3組小鼠胰腺病理組織學(xué)評分比較(±s)

表1　3組小鼠胰腺病理組織學(xué)評分比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05;與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組治療組n 10 10 10腺泡萎縮0 2.52±0.36a1.69±0.27b炎細(xì)胞浸潤0 3.42±0.31a2.34±0.33b纖維化程度0 3.25±0.42a2.19±0.35b

圖2　胰腺組織飽和苦味酸-天狼星紅染色(100×)

2.3胰腺組織α-SMA表達(dá)情況對照組基本未見α-SMA表達(dá)，與對照組相比，模型組胰腺組織α-SMA陽性染色細(xì)胞顯著增多，廣泛分布于腺泡周圍及小葉間質(zhì)。治療組胰腺組織α-SMA陽性細(xì)胞比模型組明顯減少，只可見少量表達(dá)(圖3,表2)。

圖3 胰腺組織α-SMA表達(dá)情況

2.4胰腺組織CD3，F(xiàn)OXP3表達(dá)情況與對照組相比，模型組胰腺組織CD3，F(xiàn)OXP3陽性染色細(xì)胞顯著增多，主要分布于損傷腺泡周圍；治療組胰腺組織CD3，F(xiàn)OXP3陽性細(xì)胞比模型組明顯減少（圖4，表2）。

表2 胰腺組織α-SMA，CD3，F(xiàn)OXP3陽性表達(dá)數(shù)量

圖4　CD3，F(xiàn)OXP3表達(dá)情況

3　討論

胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cell，PSC）活化，膠原大量生成，細(xì)胞外基質(zhì)增多是胰腺纖維化的重要病理過程[1]。雨蛙素是一種膽囊收縮素類似物,可刺激胰腺外分泌部，使胰蛋白水解酶分泌大量增加，從而引起胰腺腺泡的自溶，雨蛙素反復(fù)刺激可以產(chǎn)生明顯的胰腺纖維化。本研究顯示，雨蛙素反復(fù)腹腔注射6周，模型組小鼠產(chǎn)生了明顯的胰腺慢性炎癥及纖維化病變。腺泡明顯萎縮，大量炎細(xì)胞浸潤，膠原纖維增生明顯，主要分布于胰導(dǎo)管及萎縮變性的腺泡細(xì)胞旁和小葉間。PSC是胰腺纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，模型組中PSC活化標(biāo)志物α-SMA大量表達(dá)。

FTY720是傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草中提取的有效成分多球殼菌素，通過結(jié)構(gòu)改造而合成的一種新型的免疫抑制劑，在體內(nèi)被鞘氨醇激酶2磷酸化為FTY720-P,作用于淋巴細(xì)胞表面的鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine 1 phosphate，S1P）受體,其中 S1P1受體是淋巴細(xì)胞再循環(huán)的必需成分[12-13]。FTY720-P通過Akt和Erk的信號傳導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞向次級淋巴組織內(nèi)聚,從而減少淋巴細(xì)胞數(shù)量[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720可以通過影響 Bcl2/Bax比值,降低線粒體跨膜電勢,釋放細(xì)胞色素C,最終啟動Caspase酶系,從而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn),FTY720可明顯減少胰腺腺泡損傷，減少胰腺間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，T淋巴細(xì)胞（表面分子標(biāo)志CD3）顯著減少,下調(diào)α-SMA和膠原表達(dá),胰腺纖維化程度明顯減輕。

淋巴細(xì)胞通過分泌多種淋巴因子參與纖維化過程，來源于病人的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液能夠促進(jìn)成纖細(xì)胞膠原合成[16]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T lymphocyte，Treg）是CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，具有免疫調(diào)節(jié)功能，對機(jī)體維持免疫耐受和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3（Fork head/winged helix transcriptionfactor）是 Treg的特征性標(biāo)志之一[17-18]。Treg有低反應(yīng)性和免疫抑制性兩大特性，其作用機(jī)制可能是通過細(xì)胞間直接接觸和（或）分泌抑制性細(xì)胞因子，在維持機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、防止自身免疫性疾病發(fā)生、抑制腫瘤免疫等方面都起著重要作用。已有研究表明，Treg與心臟纖維化密切相關(guān)[7]。Treg能夠直接促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌TGF-β，并與成纖維細(xì)胞接觸，增強(qiáng)自身增殖、分化以及分泌TGF-β 的能力。Treg還可以通過促進(jìn)趨化因子CCL2，CCL3的表達(dá),作用于成纖維細(xì)胞表面受體，促進(jìn)纖維化發(fā)生[19-20]。

在本研究中，雨蛙素所致的模型組中，CD3+增多，F(xiàn)OXP3+增多，α-SMA、膠原表達(dá)增多。在FTY720治療組中，CD3+、FOXP3+、α-SMA以及膠原表達(dá)都比模型組中減少。在兩組中，在T淋巴細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及膠原表達(dá)上都有明顯的一致性，可見T淋巴細(xì)胞/Treg與纖維化有明顯的相關(guān)性。但關(guān)于T淋巴細(xì)胞/Treg如何影響PSC增殖及活化，F(xiàn)TY720如何影響PSC，還需要進(jìn)一步的研究。

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（收稿：2016-02-26修回：2016-05-16）

（責(zé)任編輯劉洪斌屈振亮）

Inhibitory Effect of Fingolimod in Pancreatic Fibrosis

CUI Li-hua,ZHANG Shu-kun,ZHUO Yu-zhen,et al.Institute of Chinese and Western Medicines for Acute Abdominal Diseases,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin (300100),China

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of Fingolimod(FTY720)in cerulein induced pancre?atic fibrosis.MethodsThirty male C57BL/6 mice were divided into control group,model group and FTY720 treated group（10 animals per group).The model mice and FTY720 treated mice were creased markedly in FTY720 group mice.ConclusionFTY720 could reduce the T lymphocytes infiltration and regulatory T cell quantity,thus alleviate the accumulation of collagen in pancrease.FTY720 inhibit pancre?atic fibrosis may be related to these.

repeated intraperi?toneal injection of cerulein for six weeks.The FTY720 group mice

intraperitoneal injection of FTY720 (1 mg/kg/d)after the fourth week.The control group mice

saline injections.Seven weeks after the first intraperitoneal injection of cerulein the pancreas was removed for pathological assessment of acinar atrophy,in?flammatory infiltration and fibrosis.The second part was stained with picric-sirius red and observed by polarized light microscopy.The third part of pancreatic specimen was used to examine α-smooth muscle actin(α-SMA), CD3 and FOXP3 expressionby immunohistochemical method.ResultsCompared with control group,the pathological score in model group mice(acinar atrophy 2.52±0.36 vs 0，inflammatory infiltration 3.42±0.31 vs 0，fibrosis 3.25±0.42 vs 0)was higher and much more expression of collagen in model mice.The expression of α-SMA（25.33±5.64 vs 0.33±0.52）、CD3（68.83±8.38 vs 1.83±0.75）and FOXP3（34.83±6.85 vs 1.33±0.82）were all increased in model mice.Compared with model group,the pathological score in FTY720 group(acinar atrophy 1.69±0.27 vs 2.52±0.36，inflammatory infil?tration 2.34±0.33 vs 3.42±0.31，fibrosis 2.19±0.35 vs 3.25±0.42)was lower and the expression of collagen was decreased.The expression ofα-SMA（12.33± 2.58 vs 25.33±5.64）、CD3（25±4.93 vs 68.83±8.38）and FOXP3（17.33±4.41 vs 34.83±6.85）were all de?

FTY720;pancreatitis fibrosis;cerulein;regulatory T lymphocyte胰腺纖維化是慢性胰腺炎的典型病理表現(xiàn)，在慢性胰腺炎和胰腺癌中發(fā)揮著重要作用[1]。Fingolimod(FTY720)是一種新型的免疫抑制劑,是由冬蟲夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分多球殼菌素（myriocin，ISP-1）進(jìn)行化學(xué)修飾而成[2]，具有顯著的免疫抑制效果,可顯著減少外周血中活化T和B淋巴細(xì)胞，減少淋巴細(xì)胞向移植器官內(nèi)浸潤，且不良反應(yīng)較少，在器官移植、自身免疫性疾病中顯示出很好的治療效果[3-4]。淋巴細(xì)胞反應(yīng)與纖維化密切相關(guān)，已有研究表明，活化的淋巴細(xì)胞能夠增強(qiáng)慢性肝炎的肝纖維化[5]，T淋巴細(xì)胞在纖維化過程中發(fā)揮重要作用[6]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T lymphocyte，

Q95-33;R657.5

A

1007-6948(2016)03-0261-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.03.015

天津市衛(wèi)生局基金（2013KY27）

1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所細(xì)胞及分子生物學(xué)實驗室（天津 300100）

2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所（天津 300700）

3.天津市南開醫(yī)院肝膽胰外科（天津 300100）

崔乃強(qiáng)，E-mail:nctsui@126.com