弋欽，魏小紅，強旭，趙穎，丁春發(fā)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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NO介導(dǎo)的Ca2+信號在干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)及抗氧化酶中的傳導(dǎo)作用研究

弋欽，魏小紅*，強旭，趙穎，丁春發(fā)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

本試驗以紫花苜蓿種子為試驗材料，添加外源一氧化氮供體硝普鈉(SNP)、CaCl2及抑制劑亞甲基藍(lán)(methylene blue，MB)和LaCl3，對種子進(jìn)行浸種處理，以研究NO介導(dǎo)的Ca2+信號在干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)及抗氧化酶中的傳導(dǎo)作用。結(jié)果表明，15%PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)受到明顯抑制，當(dāng)外源添加NO或Ca2+處理后萌發(fā)指標(biāo)均有上升，外施0.1 mmol/L SNP或10 mmol/L CaCl2都能有效緩解PEG對紫花苜蓿種子的脅迫傷害。干旱脅迫下NO+Ca2+共處理時效果最為顯著，萌發(fā)率較SNP處理提高了8.96%，較CaCl2處理提高了19.67%。共處理時比SNP、CaCl2處理時提高了種子淀粉酶活性、淀粉含量、可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量，降低了MDA含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率，顯著提高了SOD，POD，CAT活性。其中淀粉酶活性、淀粉含量、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量以及POD活性的變化中，均表現(xiàn)出：NO和Ca2+共處理下各指標(biāo)變化要慢于單一處理。當(dāng)添加外源NO的同時添加Ca2+通道抑制劑La3+，NO的促進(jìn)效果受到抑制，而添加外源Ca2+的同時添加NO抑制劑亞甲基藍(lán)，Ca2+的促進(jìn)效果受到抑制，表明NO經(jīng)由Ca2+信號通路調(diào)控干旱脅迫下紫花苜蓿的信號傳導(dǎo)。

一氧化氮；鈣離子；紫花苜蓿；干旱脅迫；種子萌發(fā)；抗氧化酶

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為牧草之王，在草地畜牧業(yè)生產(chǎn)中的地位無可替代。我國是苜蓿種植大國，地處干旱半干旱區(qū)的甘肅省是苜蓿種植的第一大省，約占全國種植面積的33%。長期以來，在實際生產(chǎn)中，因干旱脅迫等因素，不僅導(dǎo)致苜蓿草產(chǎn)量和質(zhì)量下降，也限制了其規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化發(fā)展。同時，西北地區(qū)種植的很多紫花苜蓿品種的抗旱能力普遍不高，在灌溉不足的條件下難獲高產(chǎn)。干旱環(huán)境下通常會引起一系列對植物細(xì)胞、器官或組織有害的生理影響，如活性氧的堆積，而氧化損傷會使細(xì)胞受損和新陳代謝發(fā)生紊亂[1]。

一氧化氮(NO)是一種短暫存在并具有高擴散性的氣態(tài)生物活性分子，是植物體中具有多種功能的信號物質(zhì)[2-4]。NO在植物的生長及形態(tài)建成過程中均有參與，如種子萌發(fā)、根生長、開花、休眠、衰老以及光形態(tài)的建成[5-9]；而通過外源添加SNP(硝普鈉，NO供體)提高植物內(nèi)源NO含量可提高鹽[10-11]、干旱[12]、重金屬脅迫[13]及冷害脅迫[14]下植物的抗逆性。NO處于激素誘導(dǎo)和生理反應(yīng)的交叉點，在植物體中，NO的產(chǎn)生包括酶促和非酶促兩類途徑，酶促途徑包括以L-Arg為底物的類一氧化氮合酶過程。信號調(diào)控過程中，NO可通過cGMP依賴途徑，調(diào)節(jié)cADPR改變胞漿內(nèi)Ca2+濃度而調(diào)控各項生理反應(yīng)[15]。而亞甲基藍(lán)(methylene blue, MB)可使cGMP含量降低[16],是鳥苷酸環(huán)化酶(gulanylatecyclase, GC)和一氧化氮合酶(NOS)的強效抑制劑[17]。有研究表明，NO通過誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+濃度升高而控制氣孔的開閉[18]，并且植物細(xì)胞內(nèi)NO的合成也依賴于Ca2+的存在[19]，在植物生理調(diào)控中NO與Ca2+之間存在著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。而Ca2+作為一種大量元素，同時也作為第二信使參與植物體內(nèi)的許多生理生化過程，具有穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，激活NAD激酶、膜結(jié)合蛋白激酶及Ca-ATPase等許多激酶活性的作用[20]。

已知低濃度NO能夠緩解干旱脅迫對種子萌發(fā)及生長的抑制作用，但干旱脅迫下NO與Ca2+在紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中是否存在調(diào)控關(guān)系并不清楚。為此，本試驗利用Ca2+抑制劑La3+及NO抑制劑MB，對種子萌發(fā)過程中淀粉酶活性、淀粉含量、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA含量、O2-·產(chǎn)生速率以及SOD、POD、CAT活性動態(tài)變化進(jìn)行研究，以探討NO介導(dǎo)的Ca2+信號在干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)及抗氧化酶中的傳導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

供試苜蓿品種為阿爾岡金(M.sativacv. Algonquin)，購于甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子公司。千粒重為2.261 g。本試驗于2013年11月-2014年6月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物生理實驗室進(jìn)行。

參照牧草種子檢驗規(guī)程，選取大小一致、飽滿且無病蟲害的種子，用0.1% HgCl2溶液浸泡消毒3 min，蒸餾水沖洗5～6次，分別用蒸餾水、SNP、CaCl2、SNP+CaCl2、SNP+LaCl3、CaCl2+MB浸種48 h后(每皿加入10 mL處理液，浸沒種子，培養(yǎng)皿中加蓋浸種，每隔24 h更換一次處理液)，將種子置于鋪有兩層濾紙9 cm培養(yǎng)皿中，每皿放置40粒，加入6 mL 15% PEG干旱脅迫，即T0：蒸餾水(CK)；T1：PEG；T2：0.1 mmol/L SNP+PEG；T3：10 mmol/L CaCl2+PEG；T4：0.1 mmol/L SNP+10 mmol/L CaCl2+PEG；T5：0.1 mmol/L SNP+10 μmol/L LaCl3+PEG；T6：10 mmol/L CaCl2+5 μmol/L MB+PEG。培養(yǎng)箱中(25±1) ℃，12 h光照/12 h黑暗恒溫培養(yǎng)，每組處理設(shè)置3個重復(fù)。分別在PEG干旱脅迫的第0、2、4、6天測定相關(guān)生理指標(biāo)，并做POD同工酶電泳。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 種子發(fā)芽指標(biāo) 以胚根0.2 cm作為萌發(fā)標(biāo)志，每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，共7 d。第7天測定萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)。公式如下：

萌發(fā)率=(萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%[21]

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)[22]

式中：Dt為日發(fā)芽種子數(shù)，Gt為與Dt相對應(yīng)天數(shù)的發(fā)芽種子數(shù)。

活力指數(shù)(VI)=GI×第7天正常幼苗平均鮮重[23]

1.2.2 生理指標(biāo)測定 淀粉酶活性采用3,5-二硝基水楊酸法測定[24]；淀粉采用蒽酮比色法測定[25]；脯氨酸含量采用茚三酮顯色法[26]；可溶性糖含量測定采用蒽酮法[25]；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定[24]；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[26]；O2-·產(chǎn)生速率采用王愛國等[27]的方法；SOD采用NBT顯色法測定[28]；POD采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定[29]；CAT采用紫外吸收法測定[30]。

1.2.3 POD同工酶分析 采用不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳；染色采用改良的聯(lián)苯胺染色法[31]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)最少設(shè)定3個重復(fù)，采用Microsoft Excel 2010整理分析數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析比較差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO與Ca2+對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

表1 可知，干旱脅迫下紫花苜蓿種子的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著低于對照組(CK)。外源添加SNP 或Ca2+處理后均可不同程度促進(jìn)萌發(fā)。與干旱脅迫相比較，添加外源NO處理，種子的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別提高了63.41%，57.93%，180.00%; 外源添加Ca2+處理時分別提高了48.78%，37.11%，80.00%。其中SNP 處理下發(fā)芽率及活力指數(shù)顯著高于Ca2+處理。SNP + Ca2+共處理比SNP處理時萌發(fā)率提高了8.96%，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別降低了4.24%，11.90%; 共處理比CaCl2處理萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別提高了19.67%，10.52% 和37.04%。當(dāng)外源添加SNP 的同時添加Ca2+通道抑制劑La3+后萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別比SNP 處理降低了58.21%，51.84%和61.90%; 而CaCl2+ MB處理比CaCl2+處理時萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別降低了49.18%，36.95%和55.56%。

表1 外源NO與Ca2+對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響Table1 EffectsofexogenousnitricoxideandCa2+onseedgerminationofalfalfaseeds處理Treatment萌發(fā)率Germinationrate(%)發(fā)芽指數(shù)Germinationindex(GI)活力指數(shù)Vigorindex(VI)T00.83±0.01a16.33±0.64a0.59±0.02aT10.41±0.04e9.08±1.25c0.15±0.03dT20.67±0.03c14.37±1.56ab0.42±0.03bT30.61±0.03d12.45±0.87b0.27±0.02cT40.73±0.01b13.76±1.22b0.37±0.03bT50.28±0.05f6.92±2.31c0.16±0.05dT60.31±0.01f7.85±0.78c0.12±0.07d T0:蒸餾水Distilledwater(CK);T1:PEG;T2:0.1mmol/LSNP+PEG;T3:10mmol/LCaCl2+PEG;T4:0.1mmol/LSNP+10mmol/LCaCl2+PEG;T5:0.1mmol/LSNP+10μmol/LLaCl3+PEG;T6:10mmol/LCaCl2+5μmol/LMB+PEG.同列不同小寫字母表示差異達(dá)5%顯著水平。Differentlowercaselettersinthesamecolumnindicatesignificantdifferenceat5%level.下同Thesamebelow.

2.2 外源NO與Ca2+對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中淀粉酶活性、淀粉含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

由圖1可知，干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中淀粉酶活性隨干旱脅迫時間的增加而降低，SNP、CaCl2及共處理均提高了干旱脅迫下淀粉酶活性；第0天時SNP處理顯著高于其他處理組；SNP+CaCl2處理與SNP處理相比較變化慢，第6天時，共處理下淀粉酶活性比干旱處理提高了43.94%，比SNP、CaCl2預(yù)處理提高了20.37%和30.01%，比添加抑制劑La3+和MB處理提高了95.61%和66.88%，但又顯著低于對照組(CK)。

種子萌發(fā)過程中淀粉含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。干旱脅迫下種子淀粉含量均低于對照組(CK)；SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理較干旱處理淀粉含量均顯著增加，添加La3+和MB則含量減少。第2天時各處理含量最高，其中SNP處理最顯著，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理分別較干旱處理提高了20.92%，6.59%，12.99%；第4、6天時SNP+CaCl2處理含量最高(CK除外)，比SNP處理增加了8.60%和9.25%，比CaCl2處理增加了14.32%和22.10%。其中，第4天時，SNP+La3+處理比SNP處理減少了35.27%，CaCl2+MB處理比CaCl2處理減少了23.17%，其間差異顯著。

可溶性糖含量變化與淀粉含量變化趨勢一致，呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，第2天時各處理含量均達(dá)到最大值，其中SNP處理可溶性糖含量最高，較干旱脅迫下增加了18.65%；第4天時，SNP+CaCl2處理可溶性糖含量高于其他處理組，較SNP處理提高了8.77%，較CaCl2處理提高了22.82%。

可溶性蛋白含量先增高后降低，干旱處理可溶性蛋白含量顯著低于對照組(CK)；SNP、CaCl2和SNP+CaCl2預(yù)處理均顯著提高了干旱脅迫下苜蓿種子的可溶性蛋白含量，而添加La3+和MB的處理組可溶性蛋白含量降低；第2天時各處理均達(dá)到最大值，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理比干旱處理下分別提高了28.80%，33.28%，22.11%，La3+和MB處理則降低了3.55%和4.40%；第4天時共處理下效果最顯著，較SNP、CaCl2處理分別提高了9.06%和12.71%。

圖1 外源NO對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中淀粉酶活性(A)、淀粉含量(B)、可溶性糖含量(C)和可溶性蛋白含量(D)的影響Fig.1 Effect of exogenous NO on the amylase activity (A), starch content (B), soluble sugar content (C) and soluble protein content (D) in germination alfalfa seeds under drought stress 相同處理天數(shù)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different letters in the same treatment time mean siginificant differences at P<0.05, the same below.

2.3 外源NO與Ca2+對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中脯氨酸、MDA含量和O2-·產(chǎn)生速率的影響

從圖2可看出，脯氨酸含量變化呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，干旱脅迫下脯氨酸含量增加，對照組(CK)變化緩慢。SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理脯氨酸含量均顯著高于干旱處理，2 d時SNP處理效果最顯著；第4天時各處理達(dá)到最大值，共處理較SNP、CaCl2處理分別提高了9.90%和14.51%；SNP+La3+處理比SNP處理降低了26.99%，CaCl2+MB處理比CaCl2處理降低了20.90%。

丙二醛含量隨干旱脅迫時間的增加而升高，干旱脅迫下丙二醛含量顯著高于對照組(CK)。第6天時，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理丙二醛含量分別比干旱處理減少了27.08%，26.29%，37.35%；La3+和MB處理抵消了促進(jìn)作用，MDA含量比干旱處理分別減少了9.07%和11.86%。

干旱脅迫明顯提高了超氧陰離子產(chǎn)生速率，并且隨干旱脅迫時間的增加超氧陰離子產(chǎn)生速率提高。第6天時SNP、CaCl2和SNP+CaCl2預(yù)處理后超氧陰離子產(chǎn)生速率均顯著低于干旱處理，分別降低了17.54%，20.63%和35.46%，而SNP+La3+處理比SNP處理提高了28.95%，CaCl2+MB處理則比CaCl2處理提高了23.32%。

2.4 外源NO與Ca2+對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中抗氧化酶的影響

如圖3所示，SOD活性隨著干旱脅迫時間的延長而增加，CK變化平緩，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理SOD活性均顯著高于干旱處理，第6天時，SNP+CaCl2處理分別比SNP處理和CaCl2處理增加了2.72%和6.62%；SNP+La3+處理比SNP處理減少了11.98%，CaCl2+MB處理則比CaCl2處理減少了18.00%。

圖2 外源NO對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中脯氨酸(A)、MDA含量(B)和O2-·產(chǎn)生速率(C)的影響Fig.2 Effect of exogenous NO on the proline (A), MDA content (B) and O2-·production (C) in germination alfalfa seeds under drought stress

圖3 外源NO對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中SOD(A)、POD(B)和CAT(C)活性的影響Fig.3 Effect of exogenous NO on the SOD (A), POD (B) and CAT (C) activities in germinating alfalfa seeds under drought stress

POD活性隨著干旱脅迫時間的延長逐漸升高，CK變化緩慢，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2預(yù)處理種子POD活性均顯著高于干旱處理。第2天時CaCl2處理組POD活性最大，SNP、CaCl2和共處理之間比較差異不顯著。第6天時各處理POD活性快速增加，共處理比SNP處理和CaCl2處理分別提高了15.70%和10.71%；添加La3+后比SNP處理降低了14.60%，添加MB后比CaCl2處理組降低了12.57%。

CAT活性呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢(CK除外)，SNP、CaCl2和SNP+CaCl2處理時CAT活性顯著增加。2 d時差異最顯著，SNP顯著高于Ca2+處理；第4天時CAT活性迅速上升并達(dá)到最大值，其中SNP+CaCl2處理分別比SNP和CaCl2處理增加了20.30%和24.54%；而添加La3+處理比SNP處理減少了14.54%，添加MB處理則比CaCl2處理減少了9.05%。第6天時Ca2+處理下酶活性顯著高于SNP處理。

2.5 不同處理及不同時間下干旱脅迫對紫花苜蓿各生理指標(biāo)的影響

表2中，對各生理指標(biāo)在干旱脅迫下不同處理和不同時間的多因素方差分析可知，淀粉酶活性、淀粉含量、可溶性糖含量中，SNP和SNP+CaCl2互作處理較其他處理差異顯著，各處理在不同脅迫時間差異顯著，均呈降低的趨勢，第2天時，SNP處理和SNP+CaCl2處理下最優(yōu)?？扇苄缘鞍缀恐校琒NP、CaCl2和SNP+CaCl2處理之間差異不顯著而較其他處理差異顯著。MDA含量和超氧陰離子產(chǎn)生速率中，SNP+CaCl2共處理顯著低于其他處理組，各處理在不同脅迫時間均差異顯著，且均呈現(xiàn)遞增的變化趨勢。脯氨酸含量中，SNP+CaCl2共處理顯著優(yōu)于其他處理，而各處理在第4天時效果最佳。POD、SOD和CAT活性變化中，SNP+CaCl2共處理效果最佳，各處理在不同時間均差異顯著，其中POD和SOD活性呈逐漸升高的變化趨勢，而CAT活性在第4天有最佳效果。

表2 不同處理、不同時間對干旱脅迫下紫花苜蓿種子生理指標(biāo)的影響

注：同行不同小寫字母表示差異達(dá)5%顯著水平。

Note: Different lowercase letters in the same row indicate significant differences at 5% level.

2.6 外源NO與Ca2+對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中POD同工酶的影響

圖4所示，共出現(xiàn)6條酶帶，其中A5為共有酶帶，干旱脅迫下A6酶帶消失。其中，1、8、15泳道均為CK對照，隨著萌發(fā)的進(jìn)行，POD同工酶組分發(fā)生明顯變化。其余泳道為干旱脅迫下不同處理POD酶條帶。第4天時，各處理中酶種類發(fā)生了顯著變化，干旱脅迫下酶帶數(shù)多于CK處理。CK出現(xiàn)A1、A2酶帶，同時A3、A4酶帶消失，A1顏色深，酶帶寬；干旱脅迫下，單一添加NO和Ca2+處理時均出現(xiàn)A1酶帶，A3、A4酶帶顏色變淡；添加NO的同時添加La3+，A1酶帶未出現(xiàn)；添加Ca2+的同時添加MB處理，無A1酶帶，A4酶帶變寬變深。而干旱脅迫下同時添加NO和Ca2+時，僅出現(xiàn)A5酶帶。

3 討論

植物種子萌發(fā)階段是對外界環(huán)境脅迫最為敏感的時期，缺水或干旱脅迫下種子的萌發(fā)與幼苗的存活都會受到極大的影響[32]。萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)則可以反映種子的發(fā)芽能力[33]。使用SNP溶液預(yù)處理后可快速的增加外源NO含量，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物生理機制來適應(yīng)生物及非生物脅迫。本試驗結(jié)果表明，外源添加0.1 mmol/L SNP溶液預(yù)處理的紫花苜蓿種子在干旱脅迫下萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)顯著提高，萌發(fā)過程中淀粉酶活性、淀粉含量、可溶性蛋白及可溶性糖含量均有增加；外源添加10 mmol/L CaCl2溶液得到相似結(jié)果，其中SNP與Ca2+共處理下促進(jìn)效果更顯著,并且在第4天時達(dá)到最大值(CK除外)；第2天時淀粉及可溶性糖在SNP處理下含量最高，可溶性蛋白在第2天時Ca2+預(yù)處理組含量最高，即SNP與Ca2+共處理時促進(jìn)種子萌發(fā)的效果顯著提高，而生理應(yīng)答反應(yīng)較添加單一因素滯后；添加NO和Ca2+的同時添加Ca2+抑制劑La3+和NO抑制劑MB后促進(jìn)效果受到抑制。

圖4 外源NO與Ca2+調(diào)控干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中POD同工酶電泳圖譜Fig.4 Effects of exogenous NO and Ca2+ on the POD isoenzyme electrophoresis atlas of alfalfa germinating seeds under drought stress泳道1～7: 0 d脅迫；泳道8～14: 2 d脅迫；泳道15～21: 4 d脅迫。1、8、15為對照組；2、9、16為15%PEG處理(T1)；3、10、17為SNP+PEG(T2)；4、11、18為Ca2++PEG(T3)；5、12、19為SNP+Ca2++PEG(T4)；6、13、20為SNP+La3++PEG(T5)；7、14、21為Ca2++MB+PEG(T6)。A1～A6表示6條不同的酶帶。Lane 1-7: Before the stress; Lane 8-14: The second day under drought stress; Lane 15-21: The fourth day under drought stress. The lane of 1, 8 and 15 indicated the CK; Lane of 2, 9 and 16 indicated the treatments by 15% PEG (T1); Lane of 3, 10 and 17 indicated treatments by SNP+PEG (T2); Lane of 4, 11 and 18 indicated treatments by Ca2++PEG (T3); Lane of 5, 12 and 19 indicated treatments by SNP+Ca2++PEG (T4); Lane of 6, 13 and 20 indicated treatments by SNP+La3++PEG (T5); Lane of 7, 14 and 21 indicated treatments by Ca2++MB+PEG (T6). A1-A6 indicated the differences bands.

干旱脅迫下，植物體內(nèi)生理代謝發(fā)生變化，如活性氧的堆積，會對植物體造成氧化損傷、細(xì)胞破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡[34]。SNP預(yù)處理可以很大程度的增加抗氧化物質(zhì)含量來緩解干旱脅迫[32]，而添加適宜濃度的外源Ca2+可提高內(nèi)源Ca2+濃度，提高抗氧化酶活性，促進(jìn)種子的萌發(fā)[35]。試驗結(jié)果表明，外源添加SNP可提高抗氧化酶SOD、CAT、POD活性和脯氨酸含量，降低了MDA含量和O2-·產(chǎn)生速率，促進(jìn)自由基的清除，緩解干旱脅迫下膜脂過氧化而造成的氧化損傷；而單一添加Ca2+時也達(dá)到了同樣的效果。SNP處理中SOD、CAT及脯氨酸含量在第2天時均高于Ca2+處理，隨著脅迫時間的延長差異減小，其中脯氨酸含量中SNP處理顯著優(yōu)于Ca2+處理，而SOD和CAT變化中則差異不顯著。POD活性的變化在第2、4、6天時Ca2+處理高于NO處理。結(jié)合表2可知，0.1 mmol/L SNP在淀粉酶活性、淀粉含量、可溶性糖、脯氨酸含量的變化中的調(diào)控作用比10 mmol/L Ca2+的促進(jìn)效果強，而POD活性的調(diào)控中則相反。NO提高酶活性路徑包括：1)通過含鐵的相關(guān)酶，如NO促進(jìn)含血紅素鐵的CAT和細(xì)胞色素c氧化酶活性，或抑制含非血紅素鐵的順烏頭酸酶等靶酶的活性來參與抗性生理反應(yīng)[36]；2)NO通過cGMP途徑改變胞漿Ca2+濃度來提高抗氧化酶活性和細(xì)胞膜膜脂不飽和度，減少氧化損傷進(jìn)而緩解逆境脅迫[37]。本試驗中,添加NO的同時添加外源Ca2+促進(jìn)效果更明顯，但共處理下POD和脯氨酸含量在2 d時低于單一處理。添加NO的同時添加Ca2+通道抑制劑La3+后，NO促進(jìn)效果受到抑制；而在添加外源Ca2+的同時添加NO抑制劑MB后，Ca2+的促進(jìn)作用被抑制。由此可知，干旱脅迫下NO提高紫花苜蓿種子抗旱性與胞質(zhì)內(nèi)Ca2+有關(guān)，并且Ca2+參與了NO的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控作用，同時，Ca2+與NO存在著交叉作用，不僅僅是NO信號通路的下游信號物質(zhì)。

POD同工酶電泳試驗中，對照組CK隨著萌發(fā)的進(jìn)行，POD組分發(fā)生明顯變化。4 d時酶種類變化差異顯著，對照組POD同工酶主要是較大分子酶蛋白的合成，而干旱脅迫下酶的合成主要是在較小分子量的蛋白處。NO與Ca2+共處理時，分子量小的A5條帶下酶的合成增加，較大分子量的蛋白酶的合成被抑制，生理應(yīng)答反應(yīng)路徑發(fā)生改變。第4天時共處理下POD活性最高，而此時酶種類最少。添加抑制劑的處理組與SNP和Ca2+單獨處理組相比較大分子量的酶蛋白未出現(xiàn)。可知，NO與Ca2+共處理時，干旱脅迫下紫花苜蓿種子的調(diào)控路徑發(fā)生改變，POD產(chǎn)物變單一，其他分子量蛋白的合成受到抑制。當(dāng)添加La3+和MB后，大分子量酶帶未出現(xiàn)，酶帶寬度發(fā)生改變。因此可知，紫花苜蓿種子在受到干旱脅迫時，胞質(zhì)Ca2+參與了NO的信號傳導(dǎo)來進(jìn)行生理應(yīng)答，并且NO能夠通過調(diào)節(jié)Ca2+通道提高胞質(zhì)Ca2+濃度從而起到抗旱保護作用。

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Investigation into the mechanism of Mo-mediated Ca2+signaling during seed germination and antioxidation inMedicagosativaunder drought stress

YI Qin, WEI Xiao-Hong*, QIANG Xu, ZHAO Ying, DING Chun-Fa

CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

The Ca2+transduction pathways have been implicated in mediating stress response and tolerance in plants. In order to investigate the mechanism of Ca2+signaling mediated by nitric oxide (NO) during seed germination and antioxidation inMedicagosativaunder drought stress, sodium nitroprusside (SNP, nitric oxide donor), CaCl2, and methylene blue (NO blockers) and LaCl3(Ca2+channel blockers) were used in this study, and alfalfa seeds were pre-soaked with these solutions. An index of germination was markedly decreased under drought stress induced by 15% polyethylene glycol treatment, but this effect was reversed after treatments with SNP and Ca2+. Moreover, 0.1 mmol/L SNP or 10 mmol/L CaCl2alleviated drought stress damage. Compared to SNP or CaCl2treatment alone, germination rate significantly increased by 8.96% and 19.67% respectively when the seeds were treated with both SNP and Ca2+. Furthermore, both SNP and CaCl2treatments increased content of starch, soluble sugar, soluble protein and proline, and activities of amylase, superoxide dismutase, peroxidase and catalase, whereas malondialdehyde content decreased compared to that under SNP or CaCl2treatment alone. The changes were slower for seeds receiving both NO and Ca2+treatments than for NO or Ca2+treatment alone. Interestingly, with added exogenous Ca2+and methylene blue, the promotional effect of Ca2+was inhibited. In addition, the promotional effect of NO was inhibited by La3+. This indicates that NO mediated protein modifications in alfalfa seeds under drought stress through the Ca2+signaling pathway.

nitric oxide; Ca2+; alfalfa; drought stress; seed germination; antioxidant enzymes

10.11686/cyxb2015591

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-12-31；改回日期：2016-03-15

國家自然基金項目(31560663)和甘肅省自然基金項目(145RJZA196)資助。

弋欽(1990-)，女，陜西渭南人，在讀碩士。E-mail:yiqin2008@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: weixh@gsau.edu.cn

弋欽，魏小紅，強旭，趙穎，丁春發(fā). NO介導(dǎo)的Ca2+信號在干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)及抗氧化酶中的傳導(dǎo)作用研究. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(11): 57-65.

YI Qin, WEI Xiao-Hong, QIANG Xu, ZHAO Ying, DING Chun-Fa. Investigation into the mechanism of Mo-mediated Ca2+signaling during seed germination and antioxidation inMedicagosativaunder drought stress. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 57-65.