田青 葉文華 陶玉倩

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·基礎研究論著·

體外培養(yǎng)的乳鼠皮層神經元氧糖剝奪后軸突損傷的實驗觀察

田青 葉文華 陶玉倩

目的 建立乳鼠皮層神經元體外培養(yǎng)模型，觀察氧糖剝奪處理對神經元軸突損傷的影響。方法 取出生24 h內的SD大鼠大腦皮層神經元，采用逐漸降低培養(yǎng)液中血清濃度和添加阿糖胞苷的方法培養(yǎng)、純化神經元，觀察其形態(tài)并鑒定。建立氧糖剝奪模型，隨機分為正常對照組和氧糖剝奪處理組(2、4、6、8 h各1組)。采用噻唑藍比色法測定神經元活性，βⅢ-tubulin 免疫熒光染色觀察軸突形態(tài)學變化。結果 神經元培養(yǎng)3～5 d后，胞體變得飽滿并分出軸突和樹突，突起之間逐漸交織成密集網(wǎng)絡，神經元微管相關蛋白-2(MAP-2)標記陽性率>95%。與正常對照組相比，隨著氧糖剝奪時間的延長，軸突網(wǎng)絡逐漸損傷、崩解，同時神經元活性呈梯度下降(P<0.01)。結論 該研究成功建立了神經元體外原代培養(yǎng)及氧糖剝奪模型，并觀察到在氧糖剝奪處理過程中神經元的軸突損傷及同時出現(xiàn)的神經元活性下降。

新生乳鼠；大腦皮層神經元；氧糖剝奪；軸突損傷

缺血性腦卒中發(fā)生后，由于胞內鈣超載，繼發(fā)瀑布樣的損傷反應，導致神經細胞壞死和凋亡[1]。目前，在缺血性腦卒中中，對于神經細胞死亡的病理生理機制已有大量實驗研究證實并闡述，但卻很少關注神經元軸突損傷在其中起到的作用。已有研究表明，軸突損傷可能是一個早期誘發(fā)神經元死亡的重要因素[2]。然而，在缺血性腦卒中急性病理生理過程中，有關實驗觀察少見報道。本次研究擬建立體外培養(yǎng)的乳鼠皮層神經元模型，觀察氧糖剝奪處理對神經元軸突損傷和細胞活性的影響。

材料與方法

一、主要試劑、儀器和實驗動物

牛血清白蛋白(BSA)、Hochest33258、脫氧核糖核酸酶I (DNaseI)(美國Sigma公司)；Neurobasal培養(yǎng)基、B27(美國Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠MAP-2抗體(美國Programma公司)；倒置顯微鏡和熒光顯微鏡(Olympus公司)。實驗動物為新生24 h內的SD大鼠，雌雄不限(中山大學醫(yī)學院實驗動物中心)。

二、主要溶液配制

種植培養(yǎng)液： 98 ml Neurobasal培養(yǎng)基，2 ml B27， 1 ml BSA。維持培養(yǎng)液： 98 ml Neurobasal培養(yǎng)基，2 ml B27。缺氧液：KCl 0.224 g，NaCl 9.116 g，MgSO40.492 g，CaCl20.221 g， KH2PO40.17 g，HEPES 2.383 g，超純水定容至1 L，調節(jié)pH至7.35。

三、神經元取材、培養(yǎng)、純化

選取2只乳鼠，取大腦皮層，剪碎后收集組織碎片，消化后反復吹散、離心；用37℃預熱的種植培養(yǎng)液重懸細胞，吹散為單細胞懸液，接種于培養(yǎng)皿/板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入阿糖胞苷(濃度10 μmol/L)抑制膠質細胞生長，3 d后用維持培養(yǎng)液半量換液，以后每間隔3～4 d半量換液1次。

四、神經元氧糖剝奪 模型的建立

選取生長良好、分布均勻的神經元，吸棄原有培養(yǎng)液，加入缺氧液輕漂洗1～2次，后換入缺氧液(100 μl/96孔培養(yǎng)板,1 ml/35 mm培養(yǎng)皿)，然后將其置入密閉盒中，向盒中持續(xù)緩慢通入體積分數(shù)為5%CO2和95%N2氣體30 min，以置換盒內氧氣；將通氣后的密閉盒完全密閉后，置入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，達到所需缺氧時間后進行相應的實驗觀察。

五、神經元形態(tài)觀察及免疫熒光染色鑒定

神經元種植于培養(yǎng)皿后，連續(xù)在普通倒置顯微鏡下對其進行形態(tài)學觀察。培養(yǎng)至5～6 d，應用神經元標記物MAP-2進行免疫熒光染色，同時用Hoechst33258標記細胞核。具體方法參考文獻[3]，其中一抗為小鼠抗大鼠MAP-2，熒光二抗為FITC偶聯(lián)的羊抗小鼠。熒光顯微鏡下觀察、拍照，隨機選擇10個視野, 取平均值，計算：MAP-2標記陽性率(%)= MAP-2染色陽性細胞數(shù)/Hoechst33258標記的細胞數(shù)×100%。

六、氧糖剝奪處理致神經元軸突損傷的觀察

神經元接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5～6 d后，隨機分為5組，其中1組為正常對照組，另外4組分別進行氧糖剝奪處理2、4、6、8 h。氧糖剝奪處理相應時間后，進行軸突標記物βⅢ-tubulin免疫熒光染色，并用Hoechst33258標記細胞核(方法同前)，其中一抗為兔抗大鼠βⅢ-tubulin，熒光二抗為Cy3偶聯(lián)的羊抗兔。

七、細胞活性檢測

使用96孔培養(yǎng)板，將神經元隨機分為正常對照組和氧糖剝奪處理組(分別處理2、4、6和8 h)，每組設1個空白對照孔和6個平行復孔。避光狀態(tài)下，每孔加入終濃度為5 mg/ml 的噻唑藍 20 μl，37℃培養(yǎng)箱內放置4 h后，棄去上清，加入DMSO 100 μl，振蕩溶解紫色結晶物，后用酶標儀檢測吸光度值(D490 nm)，計算細胞存活率(%)=D處理組/D正常組×100%。實驗結果均經重復實驗3次。

八、統(tǒng)計學處理

結 果

一、神經元形態(tài)觀察及鑒定

1. 神經元總體形態(tài)觀察

神經元種植于培養(yǎng)皿，24 h后已完全貼壁，可見有細小突起開始從胞體爬出，并逐漸向外周延伸。培養(yǎng)3 d后，胞體變得飽滿、立體，折光性強，多呈圓形、橢圓形或梭形；從胞體分出1～2條相對較粗、長的軸突和若干條細、短樹突，突起之間開始彼此聯(lián)接。培養(yǎng)5 d后，胞體更加飽滿，突起之間逐漸交織成密集網(wǎng)絡(圖1)。

2.神經元生長錐形態(tài)觀察

神經元種植于培養(yǎng)皿，24 h后可觀察到神經元突起開始從胞體爬出，并逐漸向外周延伸，在突起的末端可見呈扇形膨大的生長錐(圖2，箭頭示)。

圖1 新生SD大鼠大腦皮層神經元(6 d，×200)

圖2 新生SD大鼠大腦皮層神經元生長錐(24 h, ×200)

3.神經元經阿糖胞苷純化后MAP-2免疫熒光鑒定

神經元經阿糖胞苷純化后，用神經元標記物MAP-2進行免疫熒光染色，同時Hoechst33258標記細胞核。可見神經元胞體、突起MAP-2染色陽性，胞核則被Hoechst33258標記為藍色(圖3)。計算得：神經元MAP-2標記陽性率(%)>95%，神經元純度符合要求，可用于后續(xù)實驗。

圖3 純化后神經元MAP-2免疫熒光染色(×200)

二、氧糖剝奪處理對神經元軸突及活性的影響

1. 氧糖剝奪處理后導致神經元軸突損傷

正常情況下，神經元培養(yǎng)到5～6 d，可觀察到飽滿的胞體，胞核大，軸突平滑、粗壯(圖4D)，逐漸交織成為緊密而復雜的神經軸突網(wǎng)絡(圖4A)。而經氧糖剝奪處理4 h后，神經元胞體皺縮變形，胞核固縮，軸突變得纖細、粗糙，呈斷續(xù)串珠樣(圖4E)，神經元之間仍有聯(lián)系，但神經軸突網(wǎng)絡開始崩解(圖4B)。氧糖剝奪處理8 h后，神經元胞體、胞核及軸突(圖4F)已消失，只殘留部分碎片，軸突網(wǎng)絡也完全崩解為顆粒樣碎片，細胞之間失去網(wǎng)絡聯(lián)系(圖4C)。

2. 氧糖剝奪處理后導致神經元活性下降

與正常對照組相比，氧糖剝奪處理2 h后，細胞活性即出現(xiàn)明顯下降，其細胞存活率降至70%；隨時間延長，細胞存活率也逐步下降；氧糖剝奪處理8 h后，細胞活性降至最低值14%(多組間D490nm比較，χ2值為27.87，P<0.05；存活率比較，χ2值為28.09，P<0.05，見表1。

組 別D490nm存活率(%)正常對照組0.89±0.03100.00±0.00氧糖剝奪2h0.63±0.0170.12±2.20氧糖剝奪4h0.45±0.0150.33±2.01氧糖剝奪6h0.28±0.0231.62±2.88氧糖剝奪8h0.12±0.0514.04±5.70

討 論

目前，國內外皮層神經元原代培養(yǎng)材料來源有兩種：胎鼠和新生鼠。胎鼠來源的神經元處于分裂增殖階段，分化程度低，神經元體外生存能力較強，易于成功培養(yǎng)。所以，國外研究中多采用胎鼠(多取自15～18 d胎齡)作為神經元的實驗材料來源。但是，胎鼠腦體積小，不便取材，每次原代培養(yǎng)均需處死孕鼠，此種方法耗資較大，操作繁瑣，且易造成鼠源的浪費。而以出生24 h新生鼠作為取材來源，其神經細胞雖已近分裂晚期，分化較高，但仍處于幼年階段，適應性、可塑性仍較強，并且此法對孕鼠無傷害，可保證孕鼠和新生鼠的長期供應，既可滿足實驗需求，又具有操作性強的特點[4]。因此，本實驗采用新生24 h內的大鼠作為取材對象，通過動態(tài)觀察，可見神經元體外生長狀態(tài)良好，與既往文獻報道一致。

神經元發(fā)育和再生過程中，其突起末端膨大，呈扇形，最早由Cajal描述稱為生長錐[5]。本實驗中，原代皮層神經元種植于培養(yǎng)皿后24 h，在普通倒置相差顯微鏡光鏡下即可觀察到軸突末端的生長錐，其形態(tài)特點與文獻報道吻合。生長錐位于所有突起活躍生長的尖端，軸突的延伸實際上是生長錐尖端前伸和回縮反應相競爭的結果，軸突的形狀記錄了生長錐的歷史[6]。

圖4 氧糖剝奪處理致軸突損傷(βⅢ-tubulin/Hoechst33258 染色)(×200)

神經元培養(yǎng)液可采用有和無血清兩種[7]。血清雖可為神經元生長提供豐富營養(yǎng)，但因其同時也為神經膠質細胞等雜質細胞等提供了生長條件，從而影響了神經元的純度；而無血清培養(yǎng)液雖營養(yǎng)相對缺乏，但可防止雜質細胞過度增殖，從而提高了神經元純度。并且，由于血清直接從動物血液內提取，含有很多不明成分，對實驗結果可造成一些不可預測的影響，而無血清培養(yǎng)基成分清楚，有利于實驗條件的穩(wěn)定。因此，目前無血清培養(yǎng)法被多數(shù)研究者采用[4, 8]。神經元培養(yǎng)液配方：Neurobasal培養(yǎng)基和神經生長添加劑B27，已被國內外普遍認可并使用。而本研究取兩者之長，通過逐漸降低培養(yǎng)液中的血清濃度來進行培養(yǎng)。在神經元種植入培養(yǎng)皿的第1日，使用含1% FBS的培養(yǎng)液，能夠給神經細胞提供充足營養(yǎng)，保持細胞活性；然后，在后續(xù)的換液過程中，通過半量更換無血清的培養(yǎng)液，逐漸降低培養(yǎng)液中的血清濃度，選擇性地促進神經元生長，抑制神經膠質細胞等的生長，使神經元得以純化。另外，在培養(yǎng)1 d后，加入有絲分裂抑制劑阿糖胞苷進一步純化；利用MAP-2這一特異性分布于神經元胞漿和突起中的細胞骨架蛋白作為標記物，進行免疫熒光染色鑒定，結果顯示神經元純度達95%以上，能夠滿足后續(xù)實驗要求。

缺血缺氧性腦損傷是缺血性腦卒中的基礎病理過程，有關動物模型和細胞模型國內外報道較多，造模方法也不盡相同[9-10]?？紤]到本研究的研究目的和實驗條件的可操作性，我們選擇了神經元的氧糖剝奪模型，它是在體外細胞水平下充分模擬缺血性腦血管病病理過程的經典模型[11]。本研究應用不含糖的缺氧液，完全替換原細胞培養(yǎng)液，使得神經元處于一個酸堿平衡但能量、營養(yǎng)供給完全缺失的狀態(tài)；同時將神經元置入已充填95%N2和5%CO2的密閉容器中，以達到剝奪神經元供氧的目的。結果顯示氧糖剝奪處理2 h，即可觀察到神經元活性的明顯下降；并且隨著缺氧時間延長，神經元活性逐漸下降；氧糖剝奪處理8 h及以上時間，神經元活性降至最低值；神經元存活率與缺氧時間有良好的負性梯度。此氧糖剝奪模型能夠較好地模擬體內神經元缺血缺氧性損傷，具有易操作、易控制、重復性好的特點。

腦梗死發(fā)生后，神經元死亡的初始引發(fā)機制還有很多未知，而軸突損傷對于整個神經元死亡來說可能是一個早期引發(fā)因素。本研究應用氧糖剝奪處理體外培養(yǎng)的神經元以模擬腦梗死后的急性期，以軸突標記物βⅢ-tubulin熒光染色法和噻唑藍法，分別在不同時間梯度觀察了氧糖剝奪處理對神經元軸突形態(tài)學及活性的影響。隨著氧糖剝奪時間的延長，軸突網(wǎng)絡逐漸支離崩解，細胞存活率也逐步下降；氧糖剝奪處理8 h，軸突網(wǎng)絡已基本完全消失，此時細胞活性也降至最低值。以上結果表明氧糖剝奪處理可誘導神經元軸突網(wǎng)絡的損傷、崩解，并同時導致神經元活性下降。

神經元軸突損傷后，軸突本身會發(fā)生一系列變性反應，其中華勒變性是一種經典類型。損傷后，華勒變性發(fā)生迅速，軸突骨架結構如微管、神經微絲等去組裝并呈現(xiàn)無序性地顆粒聚集，同時髓鞘發(fā)生腫脹、收縮、斷裂，最后崩解為脂質顆粒[12]。上述文獻報道與本研究神經元氧糖剝奪處理后觀察到的形態(tài)學變化相符，表明體外培養(yǎng)的神經元遭受缺氧缺糖性損傷后，軸突可發(fā)生類似于華勒變性的崩解變性反應。

除了軸突本身變性反應，軸突受損的神經元胞體也會因此發(fā)生一系列反應，稱為“逆向性反應”或“胞體反應”[13]。本研究觀察到，氧糖剝奪處理神經元可誘發(fā)軸突損傷，同時細胞活性下降，結合文獻報道，可以推測在神經元氧糖剝奪的病理機制中，軸突損傷有可能通過逆向性胞體反應誘發(fā)神經元死亡。然而，對于胞體反應的起始機制尚不清楚。由于軸突斷裂而喪失靶源性營養(yǎng)因子、逆行性損傷電流反應如高鈣內流等被認為是軸突損傷誘發(fā)胞體死亡的部分因素[13-14]。在缺血性腦損傷急性期，在病理性細胞凋亡的過程中，軸突損傷可在早期發(fā)生，繼而由于軸漿運輸?shù)钠茐?、細胞間相互營養(yǎng)支持的減少等誘發(fā)細胞死亡。

本研究成功建立了神經元體外原代培養(yǎng)及氧糖剝奪模型，并觀察到在神經元氧糖剝奪處理過程中的軸突損傷及同時出現(xiàn)的神經元活性下降，而有關軸突及軸突網(wǎng)絡損傷的分子生物學機制，則需要進一步的研究來探討。

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(本文編輯：楊江瑜)

Experimental observation of OGD-induced axonal injury in neonatal rat models with primary cultured cortical neurons

TianQing,YeWenhua,TaoYuqian.

DepartmentofNeurology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

,TaoYuqian,E-mail:taoyuqiansums@163.com

Objective The neonate rat models with primary cultured cortical neurons were established. The impact of oxygen and glucose deprivation (OGD) treatment on neuronal axonal injury was observed. Methods Cerebral cortical neurons of neonatal Sprague-Dawley (SD) rats aged < 24 h were obtained. The neurons were cultured and purified by gradual reduction of serum concentration and supplement of cytarabine (Ara-c) into the culture medium. The neuronal morphology and identification were carried out. OGD models were established. Cultured cortical neurons were randomly divided into control and OGD treatment groups(2,4,6,8 h group). Neuronal activity was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromide (MTT) assay. Morphological changes of the axon were observed with βⅢ-tubulin immunofluorescence staining. Results After 3-5 d culture, the neuron cell body became plump presenting with axons and dendrites, which gradually constructed a dense network. The positive rate of microtubule associated protein 2 (MAP-2) was >95%. Compared with the control group, the axonal network was gradually damaged and disrupted along with the prolonged OGD treatment. Meantime, the neuronal activity was decreased in a gradient manner (P<0.01). Conclusion In this study, OGD-treated neonate rat models with primary cultured cortical neurons were established. Neuronal axonal injury accompanied with decreased neuronal activity was observed after OGD treatment.

Neonatal rat; Cerebral cortical neuron; Oxygen and glucose deprivation; Axon injury

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.11.003

510630 廣州，中山大學附屬第三醫(yī)院神經內科(田青)；528200 佛山，佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院ICU(葉文華)；510080 廣州，中山大學附屬第一醫(yī)院神經科(陶玉倩)

，陶玉倩，E-mail: taoyuqiansums@163.com

2016-08-06)