張鳳琴，張旺凡，李小龍，趙彤

（1.湖南工業(yè)大學(xué)包裝與材料工程學(xué)院，湖南 株洲 412007；2.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012）

幾種靈芝rDNA基因間隔序列分析與鑒定*

張鳳琴1，張旺凡2，李小龍1，趙彤1

（1.湖南工業(yè)大學(xué)包裝與材料工程學(xué)院，湖南 株洲 412007；2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012）

目的基于基因間隔序列（ITS）序列對靈芝進(jìn)行分類。方法培養(yǎng)靈芝、提取DNA、優(yōu)化聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體系、純化與克隆、測序、構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹、進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果經(jīng)過一系列的梯度實(shí)驗(yàn)得知優(yōu)化的PCR體系為25μl反應(yīng)混合物中含模板DNA 25 ng、Mg2+為2.0 mmol/L、dNTPs 200μmol/L、Taq 1.5 U、引物為20 pmol；最佳反應(yīng)程序?yàn)?3℃預(yù)變性4 min，93℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min，4℃無限循環(huán)。所采用的HZ002、DZ003、NZ004和XC005在遺傳進(jìn)化樹上面十分接近，說明其可以劃分為同一菌屬，同屬于靈芝菌屬。結(jié)論基于ITS序列對靈芝進(jìn)行分類，與其他的分子標(biāo)記技術(shù)所取得的分類結(jié)果一致，證實(shí)依據(jù)ITS序列來對真菌菌屬進(jìn)行分類是十分合理的。

靈芝；聚合酶鏈反應(yīng)；基因間隔序列；遺傳進(jìn)化

靈芝是一種名貴的藥用真菌，在我國有悠久的藥用歷史[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)上也廣泛研究和使用[3-6]。靈芝生長的適宜環(huán)境為：28～30℃溫度、空氣濕度70%～80%、二氧化碳CO2的比例＜0.1%、黑暗的外界生長條件[7]。以靈芝的形態(tài)學(xué)特征作為分類標(biāo)準(zhǔn)是靈芝科傳統(tǒng)的分類鑒定方法，主要是以其孢子大小和成體的外在的形態(tài)學(xué)特征作為分類依據(jù)[8]，也有其他的區(qū)分野生和種植的方法[9]。但是子實(shí)體的形態(tài)特征易受氣候、溫度、水分、光照等外界條件的影響，很不穩(wěn)定，才會(huì)出現(xiàn)同一個(gè)菌種在不同的環(huán)境中生長會(huì)出現(xiàn)不同的菌體形態(tài)的現(xiàn)象[10]。所以對于菌種的準(zhǔn)確命名帶來很大的障礙，從而導(dǎo)致出現(xiàn)的靈芝菌種的分類以及命名紊亂的現(xiàn)象?；蜷g隔序列（internal transcribed spacer，ITS）包含核糖體脫氧核糖核酸（ribosomal deoxyri bonucleic acid，rDNA）中介于18 S與5.8 S之間的ITSl，5.8S及5.8S與28S之間的ITS2共3個(gè)區(qū)域[11]。ITS序列被普遍用于研究屬和種間的分類鑒定中，由于進(jìn)化速率快且長度適宜（在高等真菌中一般＜1 000 bp）而被開發(fā)成為高等真菌屬內(nèi)種間和種群系統(tǒng)學(xué)研究的核基因標(biāo)記[12]。本實(shí)驗(yàn)就是以鑒定出的ITS序列為分析基礎(chǔ)，將各種靈芝樣品的ITS序列作為目標(biāo)脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），結(jié)合相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)，得到各個(gè)靈芝樣品的遺傳序列和遺傳進(jìn)化樹，并將其與其他的菌種進(jìn)行對比分析進(jìn)而得到靈芝的遺傳進(jìn)化現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料為以下列4種菌種：赤大芝、赤小芝、南韓甜芝和高腳靈芝，其序號(hào)為：HZ002、DZ003、NZ004、XC005，均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所提供。實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行ITS序列的測定與分析。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethylammonium Ammonium bromide，CTAB）。取長勢較好的靈芝菌絲將其放入到低于80℃的高溫干燥箱進(jìn)行干燥，再取其大約20 mg干燥的菌絲用液氮研磨成粉末，加入到1.5 ml離心管中；加入已經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取液800μl，加入10%β-巰基乙醇20μl，顛倒混勻，放在65℃的恒溫水浴鍋里面水浴40 min（每隔10 min對其進(jìn)行振蕩搖勻1次），取出，靜置冷卻至室溫。加入400μl Tris飽和酚，在65℃的水浴鍋中進(jìn)行水浴15 min（樣品要進(jìn)行顛倒混勻幾次），取出后，10 000 r/min離心10 min，取上清液。加等體積的Tris飽和酚，充分混勻，10 000 r/min離心10 min，取上清液。加入等體積的體積比為25∶24∶1的酚/氯仿/異戊醇，充分混勻，10 000 r/min離心5 min，取上清液。注意吸取的時(shí)候，不要碰到上、下分層的中間隔層。將步驟5重復(fù)1遍。加入相等體積的異丙醇，在室溫下靜置10min后，12 000 r/min冷凍離心10 min，丟棄其上清液。注意傾倒其上清液時(shí)，要小心不要將管底的微小沉淀倒出去。加入1 ml的70%乙醇洗滌沉淀，使得沉淀處于懸浮狀態(tài)后即可，棄去乙醇。沉淀用50μl由Tris堿和EDTA配制而成的緩沖液溶解。若未能及時(shí)溶解，可在37℃的恒溫水浴鍋中水浴約30 min左右即可將其完全溶解。取10μl溶液進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用752型紫外分光光度計(jì)測定各個(gè)DNA樣品的濃度和純度，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測在整個(gè)PCR體系中，所需要添加的反應(yīng)物主要有雙脫氧的無菌水、10 Taq酶的配套緩沖液、MgCl2溶液、4dNTPs溶液、引物、DNA模板和Taq DNA聚合酶。在整個(gè)PCR體系中，Mg2+濃度、dNTPs濃度，以及PCR循環(huán)的退火溫度是對于擴(kuò)增結(jié)果影響較大的主要因子。因此，本實(shí)驗(yàn)對每一個(gè)主要變量采用梯度實(shí)驗(yàn)的方法以獲得最優(yōu)的反應(yīng)體系，變量的設(shè)置分別為：退火溫度57、59、61、63、65和67℃梯度；Mg2+濃度1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mmol/L；梯度：dNTPs濃度100、150、200、250和300μmol/L梯度。取10μl溶液進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色。在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、分析與記錄。

1.2.3ITS序列克隆與分析將樣品DNA導(dǎo)入到載體上，與經(jīng)冷氯化鈣處理過的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行目的DNA轉(zhuǎn)化，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。將得到的呈現(xiàn)為白斑的單菌落挑取出來，與PCR產(chǎn)物一起送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測定。利用遺傳分析軟件MEGA 6.06與Clustalx兩種工具軟件對4種靈芝進(jìn)行遺傳分析以及建立遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增的優(yōu)化體系

通過一系列的梯度實(shí)驗(yàn)得知，最佳的25μl PCR體系為：10 Taq配套緩沖液2.0 mmol/L MgCl2、200μmol/L 4dNTP溶液、0.4μmol/L ITS1和ITS2、25 ng DNA模板和1.5 U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸2 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min，4℃無限循環(huán)。

2.2ITS序列的PCR結(jié)果

通過使用特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的電泳圖像見圖1。該實(shí)驗(yàn)研究的4種靈芝樣品的PCR擴(kuò)增出來的ITS序列在600～700 bp，經(jīng)查閱相關(guān)的資料，符合一般的rDNA的ITS序列的典型長度。

圖14　種靈芝樣品的ITS序列

2.3ITS序列分析

經(jīng)測序最終得到包括ITS1、5.8 S及ITS2的長度分別為600（HZ002）、561（DZ003）、601（NZ004）和595 bp（XC005）的序列。見圖2。

2.4聚類分析

DZ003、HZ002、NZ004、XC005與其他的真菌的ITS序列數(shù)條在美國國立生物技術(shù)信息中心的GenBank中記錄為KU145513.1（艾隱球菌）、JN164961.1（復(fù)本栓菌）、KX147237.1（鍺栓孔菌）、KM822753.1（絨毛栓孔菌）、KF963616.1（小薄孔菌）、KC907401.1（香栓孔菌）、KT876604.1（云芝孔菌）、JN164978.1（多帶革孔菌）等。通過對比數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ITS序列的相似度＞99%，可將其分類為1個(gè)菌屬。見圖3。

圖2　ITS序列圖

圖34　種靈芝的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

DZ003與艾隱球菌的遺傳距離比較遠(yuǎn)，說明其進(jìn)化過程有一定的差距，有不相似的地方，而與復(fù)本栓菌、鍺栓孔菌、絨毛栓孔菌、栓菌屬真菌、香栓菌、云芝孔菌菌種的遺傳距離比較近，說明在進(jìn)化的過程中有很大程度的重疊性，形態(tài)學(xué)特征和性質(zhì)特征有一定的相似性。HZ002、NZ004、XC005與小薄孔菌的遺傳距離比較遠(yuǎn)，說明在有些方面具有一定的差異性，而與盤栓孔菌、雅致栓菌、毛栓孔菌、鍺栓孔菌、多帶革孔菌、絨毛栓孔菌、香栓孔菌、粗毛栓菌、粗壯口蘑菌的遺傳距離較近，在其生理學(xué)特征及形態(tài)學(xué)特征有很大程度的相似性，特別是與鍺栓孔菌的遺傳距離最近，有很大程度的相似性。4種實(shí)驗(yàn)樣品的相似性很大，遺傳距離很近，在很多方面都有極大地相似性，說明可將其歸屬于同一菌屬，都屬于靈芝菌屬，與使用形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)的傳統(tǒng)分類學(xué)和其他的分子標(biāo)記技術(shù)的分類情況一致[7]。綜上所述，利用ITS序列分析的結(jié)果與傳統(tǒng)的分類學(xué)和其他的分子標(biāo)記技術(shù)所呈現(xiàn)的結(jié)果十分接近，甚至出現(xiàn)一些傳統(tǒng)分類學(xué)不能精確分類的結(jié)果，再次驗(yàn)證使用ITS序列對靈芝菌屬分類的合理性。

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（童穎丹 編輯）

Analysis and identification of rDNA ITS sequences of severalGanodermaspecies*

Feng-qin Zhang1,Wang-fan Zhang2,Xiao-long Li1,Tong Zhao1
(1.College of Materials Science and Engineering,Hunan University of Technology, Zhuzhou,Hunan 412007,China;2.Hunan Traditional Chinese Medical College, Zhuzhou,Hunan 412012,China)

Objective To classifyGanodermabased on internal transcribed spacer(ITS)sequences.Methods Several species ofGanodermawere cultivated.DNA was extracted.PCR system was optimized followed by purification and cloning,and sequencing.Then phylogenetic tree was constructed,and genetic analysis was made.Results The whole PCR system was optimized which included 25 μl reaction mixture containing template DNA 25 ng,Mg2+2.0 mmol/L,dNTPs 200 μmol/L,Taq 1.5 U,primer 20 pmol.The optimum reaction program was pre-denaturation at 93℃for 4 min,denaturation at 93℃for 40 s,annealing at 59℃for 40 s, prolongation at 72℃for 1 min for 35 cycles;then final prolongation at 72℃for 7 min followed by 4℃infinite loop.Adopted HZ002,DZ003,NZ004 and XC005 were very close in the phylogenetic tree,indicating that they belonged to the same genus,Ganoderma.Conclusions ITS sequence classification is consistent with the traditional taxonomy and classification obtained with other molecular markers,which is very reasonable for classification of fungal genus.

Ganoderma lucidum;polymerase chain reaction;internal transcribed spacer;genetic evolution

R282

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.007

1005-8982（2016）21-0035-05

2016-06-23

湖南省科技廳項(xiàng)目（No：2014sk3026）

張旺凡，Tel：13707338091；E-mail：zwf8866@163.com