葉 彬 陳令斌 劉 融

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氯化鎘誘導骨肉瘤細胞凋亡的效應及其分子機制

葉 彬 陳令斌 劉 融

目的 通過觀察氯化鎘誘導的骨肉瘤細胞凋亡與細胞特異性周期阻滯及caspase活化的影響，闡明氯化鎘誘導的細胞凋亡效應及其分子機制。方法 應用AnnexinV/PI和API等標記，流式細胞儀對人骨腫瘤細胞凋亡及周期特異性的檢測，運用RT-PCR的方法檢查Caspase-3、Caspase-9活化情況。結果 處于靜止期的外周血對氯化鎘凋亡誘導不敏感，而G1期氯化鎘誘導骨肉瘤細胞出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡。氯化鎘誘導的細胞凋亡主要是在細胞周期的G1期發(fā)生。觀察組采用氯化鎘凋亡誘導，對照組未做處理，結果顯示觀察組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達值顯著高于對照組。結論 氯化鎘誘導的細胞凋亡與骨肉瘤細胞的細胞周期相關，存在G1期細胞周期阻滯的周期特異性，且此過程中發(fā)生了caspase活化，參與細胞凋亡。

氯化鎘；骨肉瘤細胞；細胞凋亡；細胞周期

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1759～1762)

骨肉瘤是兒童、青少年最常見的惡性骨腫瘤，腫瘤在局部呈侵襲性生長并易發(fā)生轉移，其中肺轉移為其死亡的主要原因[1-2]。細胞的存活和凋亡是生命的矛盾統(tǒng)一現(xiàn)象，腫瘤的生長和凋亡都不能用細胞的周期和凋亡理論進行單獨的完整解釋，腫瘤是一類細胞增殖異常的病變，在這一過程中細胞的增殖和凋亡的調控通路受到了破壞。鎘(cadmium)是1種質軟、具有延展性的銀白色二價重金屬，二價鎘離子(Cd2+)可溶于水，與氧、氯、硫等元素形成無機化合物分布于自然界中[3]。研究表明鎘是具有致癌和抑癌雙重作用的環(huán)境重金屬，氯化鎘(cadmium chloride,CdCl2)對多種癌細胞株有明顯的腫瘤抑制效應，但目前 CdCl2對骨肉瘤是否有效尚未見研究[4]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞與儀器

試劑：人骨腫瘤細胞株 MG-63(中國科學院細胞庫)，含血清的完全培養(yǎng)基及不含血清培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)，PCR試劑盒(上海碩盟生物)，異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白(武漢博士德)，人骨腫瘤細胞株 MG-63中組織型纖溶酶原激活劑tPA(上海碧云天生物)，含EDTA的胰酶(美國GIBCO公司)，凋亡相關基因Bax(美國Santa Cruz公司)。儀器：細胞培養(yǎng)超凈臺(蘇州凈化)，培養(yǎng)箱(美國Queue systems)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，高轉速冷凍離心機(德國BiofugeStratos)，-80 ℃～4 ℃冰箱(日本松下)，高壓消毒箱(美國Tuttnauer)，F(xiàn)ACSort流式細胞儀(美國BD公司)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代

人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃孵箱中傳代培養(yǎng)。當細胞密度達到4×106以上的時候進行傳代，清洗培養(yǎng)基后，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶進行細胞消化，倒置顯微鏡觀察細胞回縮即終止消化，加入同體積的含血清的培養(yǎng)基，吹打，5 min 10 000 r/min離心，棄上清，取細胞懸液，計數(shù)后接種到新的培養(yǎng)瓶中。

1.3 細胞處理

待細胞貼壁生長至4×106，對數(shù)是生長期的細胞予以氯化鎘凋亡相關基因Bax的刺激14 h進行細胞的收集。加入tPA刺激U251細胞，對照組未加tPA刺激，然后加入Bax(12.5 μg/ml)的刺激24 h后收集細胞。

1.4 RT-PCR(半定量逆轉錄聚合酶鏈反應)方法

取人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞定量100 mg，提取總RNA。取2 μg總RNA行逆轉錄cDNA，取20 μl作為反應體系。PCR反應由逆轉錄產(chǎn)物2 μl以及18 s RNA和Caspase-3、Caspase-9的引物共同組成。反應過程按照標準的RT-PCR進行：首先預變性的反應條件為95 ℃、5 mins，接著進行梯度變性反應，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 mins遞減，共進行30次的循環(huán)。接著對所得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過拍攝電泳圖像對所得到的電泳結果采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析。內參選擇18 s RNA作為參照，同樣完成以上PCR系統(tǒng)的成像，對得到的半定量結果進行對比分析，通過量化的吸光度積分值進行分析(A值)。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞的凋亡周期

采用Annexin V/PI的方法進行凋亡的檢測，細胞離心去除培養(yǎng)基之后冷卻至4 ℃，進行細胞洗滌，調整濃度至106/ml，取100 μl的細胞懸液加入Annexin V-FITC和PI，避光15 min之后進行流式檢測。

采用API的方法檢測細胞的凋亡周期，對收集的細胞加入Annexin V-FITC，室溫避光30 min以后用buffer進行洗滌2次，加入不換甲醇的甲醛1 ml進行細胞固定，buffer洗滌2次，加入PI染色劑，靜置1 h之后進行流式細胞的檢測。

Cyclins/DNA雙標流式細胞儀分析人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞的周期特異性，對收集的細胞采用乙醇固定過夜，將固定后的細胞用PBS沖洗2次，用TritonX-100處理5 min 2次，用PBS清洗2次，用BSA稀釋抗體，4 ℃過夜，第2天加用羊抗鼠IgG，室溫靜置20 min，PBS洗滌之后，加入PI和RnaseA進行DNA染色，進行流式細胞檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 Annexin V/PI法檢測細胞凋亡情況

對數(shù)生長的人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞加入氯化鎘誘導24 h，凋亡細胞增加了6.8%，加入tPA刺激的人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞再加入氯化鎘誘導24 h，凋亡增加至15.2%，加入tPA刺激對人骨腫瘤細胞凋亡影響較只加入氯化鎘誘導的凋亡效果更明顯，見圖1，圖2。

圖1 氯化鎘誘導的人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞凋亡散點圖

圖2 氯化鎘誘導的tPA刺激的人骨腫瘤細胞株MG-63細胞凋亡散點圖

2.2 鑒定加入tPA的人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞進入細胞周期

檢測人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞加入tPA刺激后細胞增殖的情況，結果顯示，處于靜止期的人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞加入tPA以后進入細胞周期出現(xiàn)了G2～M期的細胞，如圖3。

圖3 人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞刺激后細胞增殖的情況

2.3 應用API的方法檢測細胞凋亡的細胞周期特異性

氯化鎘誘導人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞發(fā)生在G1期，氯化鎘誘導tPA刺激的人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞，細胞周期發(fā)生在G1期，對照組未加tPA幾乎沒有明顯的凋亡發(fā)生。

2.4 CyclinE/DNA雙標流式細胞術對細胞周期的分析

人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞處在G0期，tPA刺激之后出現(xiàn)在G0、早/晚G1、S2、G2、M期，加入氯化鎘誘導之后CyclinE表達下降，細胞阻滯存在G1期。

2.5 2組人骨腫瘤細胞株 MG-63細胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達的影響比較

觀察組采用氯化鎘誘導，對照組未做處理。觀察凋亡相關基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達，結果顯示觀察組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達值(1.12±0.56、1.10±0.29)顯著高于對照組(0.82±0.31、0.72±0.26)，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著時間延長，觀察組細胞凋亡指數(shù)逐漸升高，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 不同時相血清細胞凋亡指數(shù)的變化±s)

注：*為與對照組比較，P<0.05；△為與3 h比較，P<0.05。

3 討論

骨肉瘤是起源于間葉組織，為青少年最常見的原發(fā)惡性骨瘤，大多數(shù)情況下腫瘤細胞產(chǎn)生不成熟的骨質或骨，其發(fā)展迅速，主要病變部位位于長骨干骷端，侵襲性強，可出現(xiàn)全部組織器官的轉移，其中肺部轉移較為常見。該病預后較差，經(jīng)積極治療后5年的存活率僅為70%[5]。目前主要的治療方法是手術及全身化療的綜合治療方法，但是還是存在復發(fā)和轉移的可能。由于疾病發(fā)病隱匿，進展很快，很多患者就診時已到達晚期，同時目前還缺乏骨肉瘤的診斷和治療靶標，因此尋找生物學靶標對于疾病的診治至關重要。本研究探求該病的侵襲機制，尋找靶點基因與疾病的相關性，對該病的治療和預后判斷提供一定的指導價值[6-8]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的過程，腫瘤細胞的生存凋亡與細胞周期有關，細胞周期具有高度的保守性，凋亡不會對正常機體需要的細胞產(chǎn)生威脅，能夠對不必要的細胞產(chǎn)生精確的生理調控，凋亡與細胞增殖之間有著潛在相關性，很多與增殖關系密切的癌基因與細胞凋亡密切相關。隨著對細胞凋亡認識的深入，臨床研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的預后與組織化療反應明顯相關，提示了化療在骨肉瘤治療中的重要作用。而骨肉瘤的治療在近 30 年的時間里進入了平臺期，患者的長期生存率并沒有明顯提高，且有部分患者對目前使用的化療藥物不敏感，探索新的、有效的化療藥物就顯得尤為重要。細胞的凋亡具有周期性的特征，往往凋亡的發(fā)生是細胞被阻滯在細胞周期的其中一個時相當中，絕大多數(shù)的腫瘤化療是采用該理論誘導細胞在特定的周期內發(fā)生凋亡，以殺傷腫瘤細胞[9-11]。然而在已有的研究中相關氯化鎘誘導的人骨腫瘤細胞凋亡與細胞周期特異性相關的研究尚未涉及，氯化鎘是如何通過細胞周期的特異性阻滯而誘導細胞凋亡的，對凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-9活化有何影響，本文對其凋亡的特異性進行了闡述。

人骨腫瘤細胞在人體炎癥和外傷的時候會急劇的增殖，當人體的炎癥病灶消退以后其狀態(tài)又趨向穩(wěn)定[12]。我們在體外對人骨腫瘤細胞株進行培養(yǎng)，在未經(jīng)刺激的情況下，細胞處于G0期的狀態(tài)，當細胞被氯化鎘誘導之后，發(fā)生凋亡的細胞較少，細胞不進入細胞周期，而在此基礎上采用人骨腫瘤中組織型纖溶酶原激活劑tPA可以激活人骨腫瘤細胞進入細胞周期，促使細胞增殖，細胞進入了S、G2/M期，細胞凋亡率大大增加了[13-14]?？梢娂毎蛲龅陌l(fā)生只有在進入到細胞中期之后才被檢測到。這也與臨床放化療的治療作用有一定的相似之處，放化療對細胞產(chǎn)生打擊，使細胞進入細胞周期，細胞的凋亡發(fā)生率遠高于靜止期的腫瘤細胞[15]。

細胞的凋亡是否具有周期特異性，我們通過API的方法對氯化鎘誘導的細胞凋亡情況進行檢測，在凋亡的早期細胞凋亡出現(xiàn)伴隨著膜外翻的現(xiàn)象，API的方法就是利用AnnexinV與此現(xiàn)象的相結合，通過細胞核染色，對凋亡周期特異性進行判斷，結果顯示，氯化鎘誘導的細胞凋亡與周期特異性的凋亡主要發(fā)生在細胞周期的G1期。細胞的周期蛋白是一類在細胞周期中特異性表達的蛋白質，可以通過刺激細胞周期的依賴性蛋白激酶使細胞有特異性周期表現(xiàn)，周期蛋白最大的特點就是時相性，CyclinE/DNA雙標流式細胞術對細胞周期的分析主要是將細胞CyclinE的表達與細胞處的位置結合分析，可以得到細胞的詳細周期信息[16]。CyclinE完全在G1期合成，G0期不會出現(xiàn)CyclinE，其中以晚G1期表達最強，CyclinE可以完全將G0、G1很好的分開，根據(jù)本實驗結果可見氯化鎘誘導的細胞凋亡對人骨腫瘤細胞CyclinE的表達是下降的，細胞在G1期被阻滯，此過程也伴隨著凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-9的高表達及活化。

綜上所述，人骨腫瘤細胞在靜止期的時候并沒有啟動周期進程，進入周期后細胞凋亡才會變得敏感，氯化鎘誘導凋亡與人骨腫瘤細胞的周期有密切關系，會發(fā)生在特定的時相中，這樣也將細胞凋亡和周期特異性做了一個很好的解釋，從一方面說明了凋亡的周期性。細胞凋亡在惡性腫瘤中具有重要作用，本研究對氯化鎘誘導凋亡做了探索性的研究，對腫瘤的誘導凋亡和治療來說有著一定的臨床指導意義。

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(編輯：甘 艷)

Study on Cadmium Chloride Induced Osteosarcoma Apoptosis and Its Molecular Mechanism

YEBin,CHENLingbin,LIURong.

WuhanPurenHospital,Wuhan,430081

Objective To observe the cadmium chloride induced osteosarcoma apoptosis and cell cycle arrest and the specific activation of caspase,and clarify its molecular mechanism of apoptosis effect induced by cadmium chloride cells.Methods

Cadmium chloride;Osteosarcoma cells;Apoptosis;Cell cycle

430081 湖北省武漢市普仁醫(yī)院

劉 融

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.006

R738.7

A

1001-5930(2016)11-1759-04

2016-01-08

2016-10-12)

AnnexinV/PI and API markers were used by flow cytometry on human bone tumor cell apoptosis and cycle-specific detection,RT-PCR method were used to check Caspase-3,Caspase-9 activation conditions.Results Peripheral blood quiescent for cadmium chloride induced apoptosis was not sensitive,cadmium chloride induced G1phase osteosarcoma cells showed significant apoptosis.Cadmium chloride-induced apoptosis occurred mainly in the G1phase of the cell cycle.Cadmium chloride induced apoptosis in the observation group,the control group was unprocessed,Caspase-3,Caspase-9 mRNA expression values were significantly higher.Conclusion Cell cycle is associated with cadmium chloride induced apoptosis,G1phase of has specific cycle arrest,and caspase activation is involved in apoptosis.