葉 彬 陳令斌 劉 融

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氯化鎘誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)及其分子機(jī)制

葉 彬 陳令斌 劉 融

目的 通過(guò)觀(guān)察氯化鎘誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞特異性周期阻滯及caspase活化的影響，闡明氯化鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)及其分子機(jī)制。方法 應(yīng)用AnnexinV/PI和API等標(biāo)記，流式細(xì)胞儀對(duì)人骨腫瘤細(xì)胞凋亡及周期特異性的檢測(cè)，運(yùn)用RT-PCR的方法檢查Caspase-3、Caspase-9活化情況。結(jié)果 處于靜止期的外周血對(duì)氯化鎘凋亡誘導(dǎo)不敏感，而G1期氯化鎘誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡。氯化鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是在細(xì)胞周期的G1期發(fā)生。觀(guān)察組采用氯化鎘凋亡誘導(dǎo)，對(duì)照組未做處理，結(jié)果顯示觀(guān)察組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)值顯著高于對(duì)照組。結(jié)論 氯化鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)，存在G1期細(xì)胞周期阻滯的周期特異性，且此過(guò)程中發(fā)生了caspase活化，參與細(xì)胞凋亡。

氯化鎘；骨肉瘤細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1759～1762)

骨肉瘤是兒童、青少年最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤，腫瘤在局部呈侵襲性生長(zhǎng)并易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中肺轉(zhuǎn)移為其死亡的主要原因[1-2]。細(xì)胞的存活和凋亡是生命的矛盾統(tǒng)一現(xiàn)象，腫瘤的生長(zhǎng)和凋亡都不能用細(xì)胞的周期和凋亡理論進(jìn)行單獨(dú)的完整解釋?zhuān)[瘤是一類(lèi)細(xì)胞增殖異常的病變，在這一過(guò)程中細(xì)胞的增殖和凋亡的調(diào)控通路受到了破壞。鎘(cadmium)是1種質(zhì)軟、具有延展性的銀白色二價(jià)重金屬，二價(jià)鎘離子(Cd2+)可溶于水，與氧、氯、硫等元素形成無(wú)機(jī)化合物分布于自然界中[3]。研究表明鎘是具有致癌和抑癌雙重作用的環(huán)境重金屬，氯化鎘(cadmium chloride,CdCl2)對(duì)多種癌細(xì)胞株有明顯的腫瘤抑制效應(yīng)，但目前 CdCl2對(duì)骨肉瘤是否有效尚未見(jiàn)研究[4]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞與儀器

試劑：人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，含血清的完全培養(yǎng)基及不含血清培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，PCR試劑盒(上海碩盟生物)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(武漢博士德)，人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63中組織型纖溶酶原激活劑tPA(上海碧云天生物)，含EDTA的胰酶(美國(guó)GIBCO公司)，凋亡相關(guān)基因Bax(美國(guó)Santa Cruz公司)。儀器：細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(蘇州凈化)，培養(yǎng)箱(美國(guó)Queue systems)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，高轉(zhuǎn)速冷凍離心機(jī)(德國(guó)BiofugeStratos)，-80 ℃～4 ℃冰箱(日本松下)，高壓消毒箱(美國(guó)Tuttnauer)，F(xiàn)ACSort流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃孵箱中傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4×106以上的時(shí)候進(jìn)行傳代，清洗培養(yǎng)基后，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化，倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞回縮即終止消化，加入同體積的含血清的培養(yǎng)基，吹打，5 min 10 000 r/min離心，棄上清，取細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種到新的培養(yǎng)瓶中。

1.3 細(xì)胞處理

待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至4×106，對(duì)數(shù)是生長(zhǎng)期的細(xì)胞予以氯化鎘凋亡相關(guān)基因Bax的刺激14 h進(jìn)行細(xì)胞的收集。加入tPA刺激U251細(xì)胞，對(duì)照組未加tPA刺激，然后加入Bax(12.5 μg/ml)的刺激24 h后收集細(xì)胞。

1.4 RT-PCR(半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))方法

取人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞定量100 mg，提取總RNA。取2 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，取20 μl作為反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)由逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl以及18 s RNA和Caspase-3、Caspase-9的引物共同組成。反應(yīng)過(guò)程按照標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR進(jìn)行：首先預(yù)變性的反應(yīng)條件為95 ℃、5 mins，接著進(jìn)行梯度變性反應(yīng)，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 mins遞減，共進(jìn)行30次的循環(huán)。接著對(duì)所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)拍攝電泳圖像對(duì)所得到的電泳結(jié)果采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析。內(nèi)參選擇18 s RNA作為參照，同樣完成以上PCR系統(tǒng)的成像，對(duì)得到的半定量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)量化的吸光度積分值進(jìn)行分析(A值)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞的凋亡周期

采用Annexin V/PI的方法進(jìn)行凋亡的檢測(cè)，細(xì)胞離心去除培養(yǎng)基之后冷卻至4 ℃，進(jìn)行細(xì)胞洗滌，調(diào)整濃度至106/ml，取100 μl的細(xì)胞懸液加入Annexin V-FITC和PI，避光15 min之后進(jìn)行流式檢測(cè)。

采用API的方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡周期，對(duì)收集的細(xì)胞加入Annexin V-FITC，室溫避光30 min以后用buffer進(jìn)行洗滌2次，加入不換甲醇的甲醛1 ml進(jìn)行細(xì)胞固定，buffer洗滌2次，加入PI染色劑，靜置1 h之后進(jìn)行流式細(xì)胞的檢測(cè)。

Cyclins/DNA雙標(biāo)流式細(xì)胞儀分析人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞的周期特異性，對(duì)收集的細(xì)胞采用乙醇固定過(guò)夜，將固定后的細(xì)胞用PBS沖洗2次，用TritonX-100處理5 min 2次，用PBS清洗2次，用BSA稀釋抗體，4 ℃過(guò)夜，第2天加用羊抗鼠IgG，室溫靜置20 min，PBS洗滌之后，加入PI和RnaseA進(jìn)行DNA染色，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞加入氯化鎘誘導(dǎo)24 h，凋亡細(xì)胞增加了6.8%，加入tPA刺激的人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞再加入氯化鎘誘導(dǎo)24 h，凋亡增加至15.2%，加入tPA刺激對(duì)人骨腫瘤細(xì)胞凋亡影響較只加入氯化鎘誘導(dǎo)的凋亡效果更明顯，見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 氯化鎘誘導(dǎo)的人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

圖2 氯化鎘誘導(dǎo)的tPA刺激的人骨腫瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

2.2 鑒定加入tPA的人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期

檢測(cè)人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞加入tPA刺激后細(xì)胞增殖的情況，結(jié)果顯示，處于靜止期的人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞加入tPA以后進(jìn)入細(xì)胞周期出現(xiàn)了G2～M期的細(xì)胞，如圖3。

圖3 人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞刺激后細(xì)胞增殖的情況

2.3 應(yīng)用API的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞周期特異性

氯化鎘誘導(dǎo)人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞發(fā)生在G1期，氯化鎘誘導(dǎo)tPA刺激的人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞，細(xì)胞周期發(fā)生在G1期，對(duì)照組未加tPA幾乎沒(méi)有明顯的凋亡發(fā)生。

2.4 CyclinE/DNA雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期的分析

人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞處在G0期，tPA刺激之后出現(xiàn)在G0、早/晚G1、S2、G2、M期，加入氯化鎘誘導(dǎo)之后CyclinE表達(dá)下降，細(xì)胞阻滯存在G1期。

2.5 2組人骨腫瘤細(xì)胞株 MG-63細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響比較

觀(guān)察組采用氯化鎘誘導(dǎo)，對(duì)照組未做處理。觀(guān)察凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示觀(guān)察組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)值(1.12±0.56、1.10±0.29)顯著高于對(duì)照組(0.82±0.31、0.72±0.26)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，觀(guān)察組細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)相血清細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化±s)

注：*為與對(duì)照組比較，P<0.05；△為與3 h比較，P<0.05。

3 討論

骨肉瘤是起源于間葉組織，為青少年最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨瘤，大多數(shù)情況下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不成熟的骨質(zhì)或骨，其發(fā)展迅速，主要病變部位位于長(zhǎng)骨干骷端，侵襲性強(qiáng)，可出現(xiàn)全部組織器官的轉(zhuǎn)移，其中肺部轉(zhuǎn)移較為常見(jiàn)。該病預(yù)后較差，經(jīng)積極治療后5年的存活率僅為70%[5]。目前主要的治療方法是手術(shù)及全身化療的綜合治療方法，但是還是存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能。由于疾病發(fā)病隱匿，進(jìn)展很快，很多患者就診時(shí)已到達(dá)晚期，同時(shí)目前還缺乏骨肉瘤的診斷和治療靶標(biāo)，因此尋找生物學(xué)靶標(biāo)對(duì)于疾病的診治至關(guān)重要。本研究探求該病的侵襲機(jī)制，尋找靶點(diǎn)基因與疾病的相關(guān)性，對(duì)該病的治療和預(yù)后判斷提供一定的指導(dǎo)價(jià)值[6-8]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，腫瘤細(xì)胞的生存凋亡與細(xì)胞周期有關(guān)，細(xì)胞周期具有高度的保守性，凋亡不會(huì)對(duì)正常機(jī)體需要的細(xì)胞產(chǎn)生威脅，能夠?qū)Σ槐匾募?xì)胞產(chǎn)生精確的生理調(diào)控，凋亡與細(xì)胞增殖之間有著潛在相關(guān)性，很多與增殖關(guān)系密切的癌基因與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡認(rèn)識(shí)的深入，臨床研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的預(yù)后與組織化療反應(yīng)明顯相關(guān)，提示了化療在骨肉瘤治療中的重要作用。而骨肉瘤的治療在近 30 年的時(shí)間里進(jìn)入了平臺(tái)期，患者的長(zhǎng)期生存率并沒(méi)有明顯提高，且有部分患者對(duì)目前使用的化療藥物不敏感，探索新的、有效的化療藥物就顯得尤為重要。細(xì)胞的凋亡具有周期性的特征，往往凋亡的發(fā)生是細(xì)胞被阻滯在細(xì)胞周期的其中一個(gè)時(shí)相當(dāng)中，絕大多數(shù)的腫瘤化療是采用該理論誘導(dǎo)細(xì)胞在特定的周期內(nèi)發(fā)生凋亡，以殺傷腫瘤細(xì)胞[9-11]。然而在已有的研究中相關(guān)氯化鎘誘導(dǎo)的人骨腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期特異性相關(guān)的研究尚未涉及，氯化鎘是如何通過(guò)細(xì)胞周期的特異性阻滯而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9活化有何影響，本文對(duì)其凋亡的特異性進(jìn)行了闡述。

人骨腫瘤細(xì)胞在人體炎癥和外傷的時(shí)候會(huì)急劇的增殖，當(dāng)人體的炎癥病灶消退以后其狀態(tài)又趨向穩(wěn)定[12]。我們?cè)隗w外對(duì)人骨腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，在未經(jīng)刺激的情況下，細(xì)胞處于G0期的狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞被氯化鎘誘導(dǎo)之后，發(fā)生凋亡的細(xì)胞較少，細(xì)胞不進(jìn)入細(xì)胞周期，而在此基礎(chǔ)上采用人骨腫瘤中組織型纖溶酶原激活劑tPA可以激活人骨腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，促使細(xì)胞增殖，細(xì)胞進(jìn)入了S、G2/M期，細(xì)胞凋亡率大大增加了[13-14]?？梢?jiàn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生只有在進(jìn)入到細(xì)胞中期之后才被檢測(cè)到。這也與臨床放化療的治療作用有一定的相似之處，放化療對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生打擊，使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，細(xì)胞的凋亡發(fā)生率遠(yuǎn)高于靜止期的腫瘤細(xì)胞[15]。

細(xì)胞的凋亡是否具有周期特異性，我們通過(guò)API的方法對(duì)氯化鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，在凋亡的早期細(xì)胞凋亡出現(xiàn)伴隨著膜外翻的現(xiàn)象，API的方法就是利用AnnexinV與此現(xiàn)象的相結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞核染色，對(duì)凋亡周期特異性進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示，氯化鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與周期特異性的凋亡主要發(fā)生在細(xì)胞周期的G1期。細(xì)胞的周期蛋白是一類(lèi)在細(xì)胞周期中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)刺激細(xì)胞周期的依賴(lài)性蛋白激酶使細(xì)胞有特異性周期表現(xiàn)，周期蛋白最大的特點(diǎn)就是時(shí)相性，CyclinE/DNA雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期的分析主要是將細(xì)胞CyclinE的表達(dá)與細(xì)胞處的位置結(jié)合分析，可以得到細(xì)胞的詳細(xì)周期信息[16]。CyclinE完全在G1期合成，G0期不會(huì)出現(xiàn)CyclinE，其中以晚G1期表達(dá)最強(qiáng)，CyclinE可以完全將G0、G1很好的分開(kāi)，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)氯化鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對(duì)人骨腫瘤細(xì)胞CyclinE的表達(dá)是下降的，細(xì)胞在G1期被阻滯，此過(guò)程也伴隨著凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9的高表達(dá)及活化。

綜上所述，人骨腫瘤細(xì)胞在靜止期的時(shí)候并沒(méi)有啟動(dòng)周期進(jìn)程，進(jìn)入周期后細(xì)胞凋亡才會(huì)變得敏感，氯化鎘誘導(dǎo)凋亡與人骨腫瘤細(xì)胞的周期有密切關(guān)系，會(huì)發(fā)生在特定的時(shí)相中，這樣也將細(xì)胞凋亡和周期特異性做了一個(gè)很好的解釋?zhuān)瑥囊环矫嬲f(shuō)明了凋亡的周期性。細(xì)胞凋亡在惡性腫瘤中具有重要作用，本研究對(duì)氯化鎘誘導(dǎo)凋亡做了探索性的研究，對(duì)腫瘤的誘導(dǎo)凋亡和治療來(lái)說(shuō)有著一定的臨床指導(dǎo)意義。

[1] Maestro R,Salerno P,Garcia-Rostan G,et al.TWIST1 plays a pleiotropic role in determining the anaplastic thyroid cancer phenotype〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2011,96(5):772-781.

[2] Shi J,Severson C,Yang J,et al.Snail2 controls mesodermal BMP/Wnt induction of neural crest〔J〕.Development,2011,138(15):3135-3145.

[3] Nowak SJ,Aihara H,Gonzalez K,et al.Akirin links twist-regulated transcription with the brahma chromatin remodeling complex during embryogenesis〔J〕.PLoS Genetics,2012,8(3):1-16.

[4] Danciu TE,Li Y,Koh A,et al.The basic helix loop helix transcription factor Twist1 is a novel regulator of ATF4 in osteoblasts〔J〕.J Cell Biochem,2012,113(1):70-79.

[5] 徐萬(wàn)鵬,馮傳漢.骨科腫瘤學(xué)〔M〕.第2版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2008:211.

[6] Franco HL,Casasnovas J,Rodríguez-Medina JR,et al.Redundant or separate entities roles of Twist1 and Twist2 as molecular switches during gene trans-cription〔J〕.Nucleic Acids Res,2011,39(4):1177-1186.

[7] Yin G,Alvero AB,Craveiro V,et al.Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential〔J〕.Oncogene,2013,32(1):39-49.

[8] De Marco P,Raso A,Beri S,et al.A de novo balanced tra-

nslocation t(7;12)(p21.2;p12.3)in a patient with Saethre-Chotzen-like phenotype downregulates TWIST and an osteoclastic protein-tyrosine phosphatase,PTP-oc〔J〕.Eur J Med Genet,2011,54(5):478-483.

[9] Warren C,Wallace W,Campbell WJ.Splenic laceration wi-

th a twist:a lesson learnt from gastric volvulus〔J〕.Ann R Coll Surg Engl,2012,94(2):88-89.[10] Jerónimo C,Esteller M.DNA methylation markers for prostate cancer with a stem cell twist.Cancer Prev Res(Phila)〔J〕.2010,3(9):1053-1055.

[11] Fu J,Zhang L,He T,et al.TWIST represses estrogen receptor-alpha expression by recruiting the NuRD protein complex in breast cancer cells〔J〕.Int J Biol Sci,2012,8(4):522-532.

[12] Gao Y,Xuan XY,Zhang HY,et al.Relationship between -

TWIST expressions and epithelial-mesenchymal transition of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Cell Biol Int,2012,23(6):488-496.

[13] Yang J,Eckert MA.Targeting invadopodia to block breast cancer metastasis〔J〕.Oncotarget,2011,2(7):562-568.

[14] Pinho AV,Rooman I,Real FX.p53-dependent regulation of growth,epithelial mesenchymal transition and stemness in normal pancreatic epithelial cells〔J〕.Cell Cycle,2011,10(8):1312-1321.

[15] Wallerand H,Robert G,Pasticier G,et al.The epithelial-mesenchymal transition inducing factor TWIST is an attractive target in advanced and/or metastatic bladder and prostate cancers〔J〕.Urol Oncol,2010,28(5):473-479.

[16] Chang LH,Chen CH,Huang DY,et al.Thrombin induces expression of twist and cell motility via the hypoxia-inducible factor-1αtranslational pathwa yin colorectal cancer cells〔J〕.J Cell Physiol,2011,226(4):1060-1068.

(編輯：甘 艷)

Study on Cadmium Chloride Induced Osteosarcoma Apoptosis and Its Molecular Mechanism

YEBin,CHENLingbin,LIURong.

WuhanPurenHospital,Wuhan,430081

Objective To observe the cadmium chloride induced osteosarcoma apoptosis and cell cycle arrest and the specific activation of caspase,and clarify its molecular mechanism of apoptosis effect induced by cadmium chloride cells.Methods

Cadmium chloride;Osteosarcoma cells;Apoptosis;Cell cycle

430081 湖北省武漢市普仁醫(yī)院

劉 融

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.006

R738.7

A

1001-5930(2016)11-1759-04

2016-01-08

2016-10-12)

AnnexinV/PI and API markers were used by flow cytometry on human bone tumor cell apoptosis and cycle-specific detection,RT-PCR method were used to check Caspase-3,Caspase-9 activation conditions.Results Peripheral blood quiescent for cadmium chloride induced apoptosis was not sensitive,cadmium chloride induced G1phase osteosarcoma cells showed significant apoptosis.Cadmium chloride-induced apoptosis occurred mainly in the G1phase of the cell cycle.Cadmium chloride induced apoptosis in the observation group,the control group was unprocessed,Caspase-3,Caspase-9 mRNA expression values were significantly higher.Conclusion Cell cycle is associated with cadmium chloride induced apoptosis,G1phase of has specific cycle arrest,and caspase activation is involved in apoptosis.