陳建昌，孫其中，郝躍偉

(1山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南250022；2山東省醫(yī)學(xué)影像學(xué)研究所)

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阿司匹林抵抗的動(dòng)脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G/C多態(tài)性觀察

陳建昌1，孫其中2，郝躍偉1

(1山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南250022；2山東省醫(yī)學(xué)影像學(xué)研究所)

目的 觀察阿司匹林抵抗(AR)的動(dòng)脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者環(huán)氧化酶2(COX-2)基因啟動(dòng)子區(qū)-765G/C的多態(tài)性，探討COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G/C的多態(tài)性與AR發(fā)生的關(guān)系。方法 服用阿司匹林治療的動(dòng)脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者313例，其中AR 26例(AR組)、阿司匹林半抵抗(ASR)54例(ASR組)、阿司匹林敏感(AS)233例(AS組)。采用real-time PCR法觀察三組COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G/C多態(tài)性。結(jié)果 AR組COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765位點(diǎn)GG基因型頻率為46.2%、GC為38.5%、CC為15.4%；ASR組GG基因型頻率為48.1%、GC為42.6%、CC為9.3%；AS組GG基因型頻率為76.0%、GC為21.5%、CC為2.6%；AR組G等位基因頻率為65.4%、C等位基因頻率為34.6%，ASR組G等位基因頻率69.4%、C等位基因頻率30.6%，AS組G等位基因頻率86.7%、C等位基因頻率13.3%。AR組、ASR組COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765位點(diǎn)GC、CC基因型頻率和C等位基因頻率均高于AS組(P均<0.01)。結(jié)論 存在AR和ASR的動(dòng)脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765位點(diǎn)GC、CC基因型和C等位基因頻率高于AS患者；COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G>C可能與AR的發(fā)生有關(guān)。

環(huán)氧化酶2；基因多態(tài)性；單核苷酸多態(tài)性；阿司匹林；缺血性腦卒中；動(dòng)脈粥樣硬化

阿司匹林可有效抑制血小板活化及聚集，防止血栓形成，是腦血管病一級(jí)和二級(jí)防治的常用藥物[1]。然而部分患者常規(guī)劑量甚至高劑量服用阿司匹林不能有效抑制血小板聚集，仍有一定的血管不良事件發(fā)生率，因此有學(xué)者[2～5]提出了“阿司匹林抵抗(AR)”的概念，AR的患者不能在阿司匹林防治心血管病中獲益。AR發(fā)生的原因及機(jī)制不甚清楚，推測(cè)可能的內(nèi)源性因素有環(huán)氧化酶2(COX-2)基因多態(tài)性等[6,7]。COX-2可以誘導(dǎo)花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素E2，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成血栓素A2。阿司匹林可以抑制上述過程。COX-2基因的-765G/C位點(diǎn)位于啟動(dòng)子區(qū)域，突變可影響啟動(dòng)子活性而改變COX-2的表達(dá)，此位點(diǎn)突變是否與AR的發(fā)生有關(guān)目前鮮有報(bào)道。為此，本研究觀察了AR動(dòng)脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G/C的多態(tài)性，探討COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G/C的多態(tài)性與AR發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2013年4月～2015年8月在山東省立醫(yī)院西院住院治療的動(dòng)脈粥樣硬化缺血性腦卒中患者313例，男192例、女121例，年齡(67±11)歲。患者均按醫(yī)囑規(guī)范服用阿司匹林100 mg/d超過20 d。AR或阿司匹林半抵抗(ASR)判定標(biāo)準(zhǔn)[3]：取空腹靜脈血3 mL，采用全血電阻法，應(yīng)用配套的二磷酸腺苷(ADP)和膠原(COL)為誘導(dǎo)劑，測(cè)定血小板聚集率，即電阻抗值，同時(shí)滿足ADP誘導(dǎo)的電阻抗值>13 Ω、COL誘導(dǎo)的電阻抗值≥18 Ω兩個(gè)條件者判定為AR，滿足其一者為ASR，均不滿足者為阿司匹林敏感(AS)。排除近4周使用其他抗血小板、抗凝和非甾體抗炎藥物者。313例中，AR 26例(AR組)，ASR 54例(ASR組)，AS 233例(AS組)。三組在年齡、性別構(gòu)成、BMI、合并糖尿病和高脂血癥方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AR組、ASR組合并原發(fā)高血壓比例高于AS組(P均<0.01)。詳見表1。

1.2 COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G/C多態(tài)性觀察 采用real-time PCR法。采集三組空腹外周靜脈血2 mL，存儲(chǔ)于EDTA抗凝管中，抽提基因組DNA。PCR引物序列參照文獻(xiàn)[8,9]設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，等位基因特異引物AS1序列為5′-GCGGGCTCCTTGTTTCTTGGAAAGAGATGG-3′，AS2序列為5′-GCGGGCAGGGCGGCTCCTTGTT-TCTTGGAAAGAGATGC-3′，共同引物CP序列為5′-AGGGTAACTGCTTAGGACCAGTATTATGAGGAG-3′。PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括基因組DNA為1 μL，三種引物每種0.2 μmol/L，AmpliTaq DNA Polymerase 1.8 U，Tris-HCl 10 mmol/L，氯化鉀40 mmol/L(pH 8.0)，氯化鎂2 mmol/L，dATP、dCTP、dGTP各50 μmol/L，dTTP 25μmol/L，dUTP 75 μmol/L，0.2× SYBR Green Ⅰ、5%二甲基亞砜(DMSO)、2.5%甘油、ROX 染料0.25 μmol/L，不足15 μL的部分由雙蒸水(dH2O)補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 12 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，分析熔解曲線。

表1 三組一般資料比較

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；用LDA軟件進(jìn)行連鎖不平衡狀態(tài)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

COX-2基因-765G/C的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),具有群體代表性。AR組COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765位點(diǎn)GG基因型頻率為46.2%、GC為38.5%、CC為15.4%,ASR組GG基因型頻率為48.1%、GC為42.6%、CC為9.3%,AS組GG基因型頻率為76.0%、GC為21.5%、CC為2.6%,AR組G等位基因頻率為65.4%、C等位基因頻率為34.6%，ASR組G等位基因頻率69.4%、C等位基因頻率30.6%，AS組G等位基因頻率86.7%、C等位基因頻率13.3%。AR組、ASR組COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765位點(diǎn)GC、CC基因型頻率和C等位基因頻率高于AS組(P均<0.01)。

3 討論

阿司匹林是動(dòng)脈粥樣硬化缺血性腦卒中防治中最常用的藥物[10]，目前AR的發(fā)生率為8%～45%[11,12]，可能與藥物劑量及基因多態(tài)性等[6,7]有關(guān)。COX是前列腺素合成的重要限速酶，分為COX-1和COX-2。COX-1表達(dá)于所有組織細(xì)胞，參與機(jī)體正常的生理功能；COX-2在生理狀態(tài)下較少表達(dá)，但在多種病理因素(如炎癥介質(zhì)、激素、細(xì)胞因子等)誘導(dǎo)下可高表達(dá)。COX-2的產(chǎn)物前列腺素在炎癥及粥樣硬化斑塊破裂中發(fā)揮重要作用[13～16]。常規(guī)劑量阿司匹林對(duì)COX-2的抑制作用微弱，可能導(dǎo)致AR的發(fā)生。研究[17]表明，COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G/C突變可改變啟動(dòng)子活性而影響基因表達(dá)，可能成為個(gè)體發(fā)生AR的一個(gè)因素。

本研究結(jié)果顯示，AR組、ASR組COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765位點(diǎn)GC、CC基因型及C等位基因頻率均高于AS組，與國內(nèi)外一些報(bào)道結(jié)論相同，提示C等位基因攜帶者有較高幾率發(fā)生AR，從而增加腦血管事件的發(fā)生率。楊蓉等[18]研究發(fā)現(xiàn)AS組與AR組等位基因C頻率有差異，推斷等位基因C可促進(jìn)COX-2的表達(dá)，使得血栓素A2生成增加、血小板激活，影響阿司匹林的抗血小板功能，導(dǎo)致AR的發(fā)生。也有一些學(xué)者[19]得出了相反結(jié)論，但該研究納入樣本量較少，可能對(duì)結(jié)果有一定影響。Takahashi等[20]研究結(jié)果顯示冠心病患者發(fā)生AR與COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G>C并無顯著關(guān)系，推測(cè)可能存在其他的分子生物學(xué)機(jī)制。出現(xiàn)這種差異，可能是由于各獨(dú)立研究者選取的人群、種族不同以及樣本量的較大差異導(dǎo)致的。

綜上可見，COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)-765G>C可能與AR的發(fā)生有關(guān)，但未來仍需要進(jìn)行多中心、更大樣本量的研究以及進(jìn)一步功能試驗(yàn)來驗(yàn)證上述結(jié)論。

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