郁惠蕾張志鈞李春秀錢小龍郭 飛許建和

（1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237；2 華東理工大學(xué)常熟研究院，蘇州百福安酶制劑有限公司，江蘇 215000）

大數(shù)據(jù)時代工業(yè)酶的發(fā)掘、改造和利用

許建和，本科畢業(yè)于清華大學(xué)化學(xué)系，華東理工大學(xué)與京都大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士。1995年起歷任華東理工大學(xué)助研、副研、教授。任教育部長江學(xué)者特聘教授, 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室主任，兼上海生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心主任。亞洲生物技術(shù)聯(lián)合會執(zhí)委，第一屆亞洲生物技術(shù)大會共同主席。長期從事生物催化與生物化工研究，曾主持1項“973計劃”課題、2項“863計劃”課題和7項國家自然科學(xué)基金。公開發(fā)明專利60多項，授權(quán)40項，多項技術(shù)轉(zhuǎn)讓企業(yè)。

E-mail:jianhexu@ecust.edu.cn

郁惠蕾1張志鈞1李春秀1錢小龍2郭 飛2許建和1

（1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237；2 華東理工大學(xué)常熟研究院，蘇州百福安酶制劑有限公司，江蘇 215000）

從當(dāng)今的生物信息大數(shù)據(jù)出發(fā)，提出有別于傳統(tǒng)方法的工業(yè)酶挖掘新思路。在此基礎(chǔ)上結(jié)合最新研究成果，簡要介紹幾種典型工業(yè)酶的設(shè)計和改造新策略。

隨著資源、環(huán)境問題的日益加劇，可持續(xù)發(fā)展已成為全社會的共同目標(biāo)。當(dāng)今社會對“可持續(xù)發(fā)展”、“綠色化學(xué)”以及“環(huán)境友好制造”的呼聲越來越高。以節(jié)能、降耗、減排和高效生產(chǎn)為目標(biāo)，基于工業(yè)酶催化劑的綠色制造過程也越來越多地受到學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注。微生物基因組學(xué)、分子與結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)及計算生物學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，為酶的分子設(shè)計、高效制備以及生產(chǎn)應(yīng)用提供了科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，使得更多工業(yè)規(guī)模的生物催化合成成為可能。

大數(shù)據(jù)開啟了一次重大的時代轉(zhuǎn)型，正在改變我們的生活和了解世界的方式，同時也成為新發(fā)明和新服務(wù)的源泉。在生物技術(shù)領(lǐng)域，由于測序技術(shù)成本的大幅下跌，人們獲得基因序列的速度是10年前無法想象的。如何才能在最短的時間內(nèi)，從海量的基因數(shù)據(jù)資源中迅速鑒別并獲得工業(yè)上有用的目標(biāo)酶基因和活性酶蛋白？基因挖掘（genomic mining）就是根據(jù)催化特定反應(yīng)的需要，從文獻(xiàn)中尋找相關(guān)酶的同源基因序列，并以此作為基因探針，在基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，篩選獲得同源酶的編碼信息，繼而進(jìn)行酶的批量異源表達(dá)和高通量篩選，最終獲得催化性能更優(yōu)的新型生物催化劑（1.0版）。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的迅猛發(fā)展，人們對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識逐步加深，加上基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)所提供的大量結(jié)構(gòu)與功能信息，酶的分子改造也從以往的隨機突變，逐漸發(fā)展到半理性或理性設(shè)計等更精準(zhǔn)的方法，甚至可以利用計算機從頭設(shè)計自然界不存在的酶?？傊?，生物催化劑的設(shè)計和制備已經(jīng)變得越來越簡單，從而使得各行各業(yè)對特定酶的要求也變得更加迫切和可行。

1　酶資源信息庫

目前已有眾多的數(shù)據(jù)庫公布了酶的基因序列、蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等信息，首先簡單介紹一下這些可用于工業(yè)酶挖掘和改造的“大數(shù)據(jù)”。

1.1酶基因序列庫

根據(jù)基因組測序計劃統(tǒng)計網(wǎng)站GOLD（http://www.genomesonline.org/）截止到2016年1月9日的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，已有7826種生物的全基因組完成測序，有33 630個全基因組測序項目在進(jìn)行中；另有626個宏基因組測序項目正在進(jìn)行或已完成。截止到2015年12月，美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站登記的基因序列有1.89億條，堿基數(shù)量累計達(dá)到了2039億對（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank/statistics）。而全基因組鳥槍法測序數(shù)據(jù)庫（whole genome shotgun, WGS）記錄的來自個體和宏基因組的序列已有3.17億條，堿基數(shù)量累計1.2978萬億對。在如此龐大的基因組數(shù)據(jù)庫中無疑包含著海量的工業(yè)酶基因資源。

1.2酶蛋白質(zhì)信息庫

根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://www. uniprot.org）的統(tǒng)計，截至2016年1月，已有明確功能標(biāo)注的蛋白質(zhì)序列數(shù)目達(dá)到55萬條，未標(biāo)注的蛋白質(zhì)序列超過了5527萬條（表1），由此可知其中標(biāo)注功能的蛋白質(zhì)僅占約1%，而絕大多數(shù)（約99%）蛋白質(zhì)的功能尚屬未知，有待研究解析。在已有明確功能標(biāo)注的蛋白質(zhì)序列中，屬于六大酶類的序列約有26.5萬條，其中 氧化還原酶3.9萬條，轉(zhuǎn)移酶9.1萬條，水解酶6.5萬條，裂合酶2.4萬條，異構(gòu)酶1.4萬條，連接酶3.1萬條。在未標(biāo)注功能的蛋白質(zhì)中，被預(yù)測為六大酶類的共約715.1萬條，其中氧化還原酶172.3萬條，轉(zhuǎn)移酶218.0萬條，水解酶159.0萬條，裂合酶61.6萬條，異構(gòu)酶43.4萬條，連接酶60.8萬條。其中每一類還有各種亞類的統(tǒng)計，例如圖1是預(yù)測的氧化還原酶亞類的分布情況。

表1　Uniprot數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計的蛋白質(zhì)序列數(shù)

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KAZLAUSKAS R J, BORNSCHEUER U T. Finding better protein engineering strategies. Nature Chem Biol, 2009, 5(8): 526-529.

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HILVERT D, HOUK K N, STODDARD B L, et al. De novo computational design of retro-aldol enzymes. Science, 2008, 319 (5868): 1387-1391.

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GIGER L, CANER S, OBEXER R, et al. Evolution of a designed retro-aldolase leads to complete active site remodeling. Nature Chem Biol, 2013, 9(8): 494-498.

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NI Y, LI C X, ZHANG J, et al. Efficient reduction of ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate at 620 g/L by a bacterial reductase with broad substrate spectrum. Adv Synth Catal, 2011, 353(8): 1213-1217.

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NI Y, LI C X, WANG L J, et al. Highly stereoselective reduction of prochiral ketones by a bacterial reductase coupled with cofactor regeneration. Org Biomol Chem, 2011, 9(15): 5463-5468.

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NI Y, PAN J, MA H M, et al. Bioreduction of methyl o-chlorobenzoylformate at 500 g/L without external cofactors for efficient production of enantiopure clopidogrel intermediate. Tetrahedron Lett, 2012, 53(35): 4715-4717.

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ZHANG Y J, ZHANG W X, ZHENG G W, et al. Identification of an ε-keto ester reductase for the efficient synthesis of an (R)-α-Lipoic acid precursor. Adv Synth Catal, 2015, 357: 1697-1702.

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ZHANG C S, ZHANG Z J, LI C X, et al. Efficient production of (R)-o-chloromandelic acid by deracemization of o-chloromandelonitrile with a new nitrilase mined from Labrenzia aggregate. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 95(1): 91-99.

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HOHNE M, SCHATZLE S, JOCHENS H, et al. Rational assignment of key motifs for function guides in silico enzyme identification. Nat Chem Biol, 2010, 6(11): 807-813.

另外，Brenda （http://www.brendaenzymes.org）是一個用戶友好的酶數(shù)據(jù)庫（圖2）?？梢杂媚繕?biāo)酶的名字、酶學(xué)委員會（EC）編號或者序列搜索，進(jìn)入與目標(biāo)酶屬于同一EC編號的酶數(shù)據(jù)集，其中包含該酶的各種來源信息、最適pH、最適溫度、動力學(xué)參數(shù)、催化反應(yīng)和三維結(jié)構(gòu)鏈接，甚至還有已報道的突變體等信息。

圖1　預(yù)測的氧化還原酶的亞類分布情況

1.3酶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫

圖2　Brenda酶綜合信息系統(tǒng)主頁

根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB（http:// www.rcsb.org/pdb/home/home.do）統(tǒng)計，截止到2015年12月，已公布的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)總數(shù)已達(dá)到114 741個，其中絕大多數(shù)（102 306個，約89%）是通過X射線衍射法獲得的，其次是通過核磁共振譜（11 145個，約10%）和冷凍電鏡法（926個，約1%）獲得。按六大 酶類分別統(tǒng)計，各類酶的已知結(jié)構(gòu)數(shù)總計60 443個，按Uniprot名字刪除重復(fù)和其突變體結(jié)構(gòu)后總數(shù)為6525個，占已標(biāo)注酶蛋白質(zhì)總數(shù)的2.46%。六大酶類已有結(jié)構(gòu)信息公開的統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2，其中以水解酶、轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶這三類酶為主。這些結(jié)構(gòu)信息的公布，為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究和理性設(shè)計改造提供了重要信息。

2　基因挖掘策略

在筆者前一綜述文章“后基因組時代工業(yè)酶資源的挖掘和應(yīng)用”（參見《生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)》2011年01期）中已經(jīng)介紹，基因挖掘是一種后基因組時代更加快速、高效地獲取新酶的方法，它極大地縮短了新酶的開發(fā)周期，從常規(guī)的2～3年可縮短至2～3個月，甚至2～3周。下面具體介紹幾種酶的基因挖掘策略。

表2　PDB數(shù)據(jù)庫中六大酶類蛋白結(jié)構(gòu)公布的情況

2.1從已測序的微生物基因組中挖掘目標(biāo)酶基因

隨著基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的微生物基因組被測序，其中有一部分基因的開放閱讀框所編碼的酶潛在功能已被預(yù)測，但可能未經(jīng)實驗證實；另有大量開放閱讀框所編碼的酶信息仍未被注釋或?qū)嶒炑芯?。一方面可以直接將已注釋的假想酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并通過活力檢測來獲得所需的候選生物催化劑；另一方面還可通過對未注釋酶的開放閱讀框進(jìn)行比對分析，并與已報道類似酶的保守序列進(jìn)行比較，找到具有潛在功能的目標(biāo)新酶編碼序列，進(jìn)而通過克隆表達(dá)來獲得結(jié)構(gòu)/功能全新的目標(biāo)生物催化劑。后者的風(fēng)險相對較大（成功率較低），但創(chuàng)新性更強，比較容易獲得知識產(chǎn)權(quán)。

例如，倪燕等通過對Bacillus sp.的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有13個潛在的羰基還原酶開放閱讀框，通過對這些潛在的酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中一個酶（FabG）能夠?qū)⒏邼舛龋?20g/L）的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯高立體選擇性地還原為光學(xué)純（S）-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯（光學(xué)純度＞99%）。另外一個還原酶（yueD）則對4-氯-3-羰基丁酸乙酯表現(xiàn)出很高的催化活性，通過在兩相反應(yīng)體系中進(jìn)行分批補料反應(yīng)，濃度高達(dá)215 g/L（1.3mol/L）的底物可被完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物（R）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的得率和對映體光學(xué)純度分別為97.3%和99.6%。還有一個還原酶（YtbE）能夠耐受高濃度的鄰氯苯甲酰甲酸甲酯，并將500g/L的底物完全轉(zhuǎn)化為光學(xué)純（R）-鄰氯扁桃酸甲酯，后者是世界第二大暢銷藥氯吡格雷的關(guān)鍵手性中間體。

2.2基于探針酶序列的基因挖掘

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SEFFERNICK J L, SAMANTA S K, LOUIE T M, et al. Investigative mining of sequence data for novel enzymes: a case study with nitrilases. J Biotechnol, 2009, 143(1): 17-26.

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MAK W S, TRAN S, MARCHESCHI R, et al. Integrative genomic mining for enzyme function to enable engineering of a non-natural biosynthetic pathway. Nature Commun, 2015, 6: 10005.

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SAVILE C K, JANEY J M, MUNDORFF E C, et al. Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture. Science, 2010, 329(5989): 305-309.

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ALVIZO O, NGUYEN L J, SAVILE C K, et al. Directed evolution of an ultrastable carbonic anhydrase for highly efficient carbon capture from flue gas. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 46(111): 16436-16441.

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WARDEN A C, WILLIAMS M, PEAT T S, et al. Rational engineering of a mesohalophilic carbonic anhydrase to an extreme halotolerant biocatalyst. Nature Commun, 2015, 6: 10278.

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KONG X D, LI L, CHEN S, et al. Engineering of an epoxide hydrolase for efficient bioresolution of bulky pharmaco substrates. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111 (44): 15717-15722.

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KONG X D, MA Q, ZHOU J H, et al. A smart library of epoxide hydrolase variants and the top hits for synthesis of (S)-β-blocker precursors. Angew Chem Int Ed, 2014, 53(26): 6641-6644.

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LUO X J, KONG X D, ZHAO J, et al. Switching a newly discovered lactonase into an efficient and thermostable phosphotriesterase by simple double mutations His250Ile/Ile263Trp. Biotechnol Bioeng, 2014, 111(10): 1920-1930.

當(dāng)催化某類反應(yīng)的相關(guān)酶（或多肽）基因序列已有文獻(xiàn)報道后，就可以利用此序列作為基因探針（或稱模板）在公共基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，找到與探針序列具有一定同源性的候選酶基因，進(jìn)而根據(jù)檢索到的基因序列設(shè)計引物，利用PCR擴增法獲得編碼這些酶的DNA，并將它們進(jìn)行克隆表達(dá)，最后通過目標(biāo)底物進(jìn)行活性篩選，即可能獲得所需要的具有特定催化功能的生物催化劑（圖3）。例如，筆者所在實驗室從基因組數(shù)據(jù)庫中挑選、規(guī)劃了1000多種結(jié)構(gòu)多樣、功能各異的醇脫氫酶/羰基還原酶（圖4），目前已經(jīng)成功制備了600多種凍干酶制劑，可以滿足我國醫(yī)藥化工企業(yè)對部分工業(yè)生物催化劑的定制服務(wù)需求。最近，利用上述酶庫為（R）-硫辛酸生產(chǎn)企業(yè)量身定制的ε-羰基還原酶，可高效催化還原330g/L的8-氯-6-羰基辛酸乙酯，產(chǎn)物光學(xué)純度＞99%，已申請國際專利（PCT/CN2015/073615），并成功實現(xiàn)技術(shù)轉(zhuǎn)移和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

又如，為了尋找能夠催化鄰氯扁桃腈水解制備鄰氯扁桃酸的腈水解酶，張陳勝等以扁桃腈水解酶基因的保守序列為探針在基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對篩選，選取序列同源性在40%～70%的基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并根據(jù)它們對鄰氯扁桃腈的活力和對映選擇性進(jìn)行篩選，最終獲得的重組腈水解酶能夠耐受300mmol/L鄰氯扁桃腈，產(chǎn)物的得率和光學(xué)純度分別為94.5%和96.5%。

圖3　基于探針序列信息從基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘新酶的技術(shù)路線

圖4　醇脫氫酶/羰基還原酶“千酶庫”的分子進(jìn)化樹

2.3基于序列和結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合的新酶基因挖掘

從已測序微生物基因組中直接克隆酶的基因并進(jìn)行異源表達(dá)，或者基于探針酶的序列在基因數(shù)據(jù)庫中挖掘目標(biāo)酶的技術(shù)業(yè)已成熟并取得了較好的應(yīng)用效果，不過其前提條件是未知酶的功能已經(jīng)被預(yù)測注釋，或者催化特定底物轉(zhuǎn)化的酶基因序列已經(jīng)公開報道。然而，針對某些特定的底物，僅僅基于催化類似反應(yīng)的酶的序列信息所挖掘得到的酶，往往無法催化目標(biāo)底物的轉(zhuǎn)化，或者雖能催化反應(yīng)卻不能達(dá)到預(yù)期的效果。如果能將基因挖掘和結(jié)構(gòu)分析等相關(guān)信息結(jié)合起來，將有望顯著提高基因挖掘的效率。

由于轉(zhuǎn)氨酶在有機合成領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用，近年來這類酶受到越來越多研究者的關(guān)注，然而大多數(shù)已報道的轉(zhuǎn)氨酶都是S-選擇性的，而R-選擇性的轉(zhuǎn)氨酶則非常少。德國Born scheuer等為了獲得R-選擇性的轉(zhuǎn)氨酶，首先對文獻(xiàn)報道的S-選擇性轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，找到可將S-選擇性轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)變?yōu)镽-選擇性轉(zhuǎn)氨酶所需要的突變位點和替代氨基酸，根據(jù)這些相關(guān)信息在基因數(shù)據(jù)庫中搜索已經(jīng)含有這些氨基酸突變位點的基因序列，將這些潛在的目標(biāo)酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)，并基于對目標(biāo)底物的催化效果進(jìn)行篩選，最終得到17個能催化合成一系列（R）-胺的R-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，產(chǎn)物的對映體過量值達(dá)到99%以上。

2.4計算介導(dǎo)的基因挖掘

在構(gòu)建非天然長鏈醇的生物合成途徑中，Siegel等提供了一種新的生物信息學(xué)和分子模擬相結(jié)合的功能酶基因組挖掘方法。通過這種計算介導(dǎo)的基因挖掘方法獲得的酶GEO175是常規(guī)篩選所得酶活力的75倍，該計算介導(dǎo)的基因組功能酶挖掘新方法如圖5所示，包括以下幾個步驟：①通過序列比對得到2082個酮異戊酸脫羧酶（KIVD）的同源酶（genomic enzyme orthologues，GEOs），剔除彼此同源性大于90%及真核來源的GEOs，以增加候選酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)概率；②用Rosetta Comparative Modeling同源建模，用TMalign算法進(jìn)一步篩選后共獲得239個GEOs，這239個序列間同源性約20%；③將這239個GEOs與C8底物進(jìn)行分子對接，顯示GEO175酶的界面能（interface energy）最低，即最有可能催化C8底物；④根據(jù)界面能及同源性高低，挑選10個GEOs進(jìn)行動力學(xué)表征，結(jié)果6個酶獲得了可溶蛋白，3個酶對酮酸具有可檢測的活性。

3　酶的分子改造策略

近年來，隨著現(xiàn)代生物科學(xué)尤其是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的快速發(fā)展，定向進(jìn)化與理性設(shè)計相結(jié)合的半理性分子設(shè)計方法陸續(xù)出現(xiàn)（圖6），例如對鄰近有限位點進(jìn)行組合隨機突變的CASTing方法、QSAR、外顯子改組等。大量計算方法如ProSAR、SCHEMA、Rosseta等的應(yīng)用，大大提高了突變體設(shè)計分析的效率和準(zhǔn)確性。同時，在突變體文庫的構(gòu)建方面也出現(xiàn)了迭代飽和突變、簡化密碼子表、基于簡并密碼子的限制性文庫方法等。這些技術(shù)在增加酶的底物多樣性和改變酶的各種性能方面已獲得許多成功應(yīng)用。

圖5　計算介導(dǎo)基因組功能酶挖掘流程

在酶的分子改造中最具代表性的案例之一，是糖尿病藥物西他列汀合成用酶的分子改造?；诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)，通過分子模擬和點飽和突變對節(jié)桿菌轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行重新設(shè)計，最終通過多輪特定環(huán)境下的定向進(jìn)化所獲得的突變酶有27個突變位點，具有較廣的底物適應(yīng)范圍、較高的活性和很強的環(huán)境耐受能力（反應(yīng)溫度45～50℃、50% DMSO、底物濃度200g/L），而傳統(tǒng)的定向進(jìn)化方法幾乎不可能得到具備如此多性能優(yōu)勢的酶。該酶替代了原有工藝中的貴金屬釕催化劑，解決了高壓生產(chǎn)過程的危險性和高成本等問題，使現(xiàn)有設(shè)備的生產(chǎn)能力提高56%，反應(yīng)產(chǎn)率提高10%～13%，廢物的產(chǎn)生量降低了19%。Merck和Codexis公司也因此獲得了2010年美國總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎。

圖6　酶的蛋白質(zhì)工程改造策略

另一典型案例是碳酸酐酶的分子改造。為了解決氣候變暖的問題，需要處理工業(yè)尾氣中的CO2，碳酸酐酶可顯著提高CO2的捕集效率，但其應(yīng)用仍受限于工業(yè)苛刻條件下酶的穩(wěn)定性。Alvizo等采用定向進(jìn)化技術(shù)，結(jié)合高通量篩選和ProSAR，分析識別有益突變點和飽和突變等策略，通過多輪突變獲得的突變體可以耐受極端高溫（107℃）和堿性條件（4.2 mol/L堿性胺溶劑、pH ＞10.0），比天然酶的穩(wěn)定性提高了4 000 000倍。在工業(yè)示范規(guī)模下，利用這一突變酶CO2的捕集效率提高了25倍。最近澳大利亞科學(xué)家通過理性設(shè)計改變碳酸酐酶Ⅱ表面的18個氨基酸殘基獲得高度耐鹽的酶變體，在高鹽條件下（＞3mol/L鈉鹽）其催化活性和解折疊溫度，比野生酶明顯增加。分子動力學(xué)計算表明，酶與鈉離子形成高度有序的鈉離子水化層，對酶在高鹽環(huán)境中的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用。這是首次通過改造普通酶而獲得極端酶的耐受性，類似的策略對于生物催化劑的耐受性改造具有參考意義。

圖7　環(huán)氧水解酶的催化反應(yīng)及產(chǎn)物釋放通道示意

筆者所在實驗室前期篩選獲得的巨大芽孢桿環(huán)氧水解酶BmEH，能催化苯基環(huán)氧底物制備β-阻斷劑等藥物的手性環(huán)氧中間體，但當(dāng)苯環(huán)上帶有大位阻取代基時，酶的催化活力則變得很低（＜1%），從而成為制約該酶產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的一大瓶頸問題。為了解決上述BmEH工業(yè)化應(yīng)用的難題，筆者所在實驗室首先解析了該酶與底物類似物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)3個位點存在底物類似物，其中Zone 2被確定為催化反應(yīng)位點，Zone 1為底物進(jìn)入通道，Zone 3為假定的釋放產(chǎn)物通道，但它在野生酶分子中被大位阻氨基酸（Met145，Phe128）所阻塞。通過將兩個關(guān)鍵的界面氨基酸突變?yōu)轶w積較小的丙氨酸，即拓展了Zone 3的產(chǎn)物通道，所得突變酶催化大位阻萘基底物的活力提高近900倍，從而證實了筆者提出的“產(chǎn)物釋放通道”假說（圖7）。在了解環(huán)氧水解酶底物進(jìn)入、催化反應(yīng)及產(chǎn)物釋放機理的基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步針對底物結(jié)合位點周圍的氨基酸設(shè)計了小巧的半飽和突變庫，并利用一系列臨床上有用的大位阻底物進(jìn)行活力篩選，最終達(dá)到每一種底物都能找到高活力突變體的目的（圖8）。最終，利用定點突變所獲得的環(huán)氧水解酶突變體，成功實現(xiàn)了一系列大位阻β-阻斷劑藥物環(huán)氧中間體的酶促水解拆分，并制備獲得了一系列洛爾類心血管藥物的關(guān)鍵手性中間體。這一成果受到《Synfacts》期刊特邀專家的亮點評述，指出作者通過活性中心兩個關(guān)鍵位點的微調(diào)，極大地拓展了酶的底物譜，建立了高效的環(huán)氧水解拆分反應(yīng)途徑。

圖8　環(huán)氧水解酶及其突變體的底物譜

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)由于過量使用有機磷農(nóng)藥給食品安全和環(huán)境凈化帶來很大挑戰(zhàn)。有機磷水解酶OPHC2是β-內(nèi)酰胺酶家族的一員，但是關(guān)于它在自然進(jìn)化過程中是如何獲得磷酸三酯水解活力的問題，目前尚未有任何報道。為了探索其所催化各種反應(yīng)之間的內(nèi)在進(jìn)化關(guān)系，筆者所在實驗室以食油假單胞菌中的有機磷水解酶PoOPH為研究對象，該酶具有很高的酯酶和內(nèi)酯酶活力，但僅有很低的磷酸三酯水解活力。通過多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，活性口袋周圍250位的組氨酸和263位的異亮氨酸在所有的有機磷水解酶中高度保守，因此筆者推測這兩個氨基酸對該類酶的催化活力和底物專一性具有關(guān)鍵作用?；诖耍P者構(gòu)建了這兩個位點的定點飽和突變庫，并分別考察了它們的酯酶、內(nèi)酯酶和磷酸三酯酶活力，結(jié)果表明：將這兩個位點的氨基酸突變?yōu)槠渌愋偷陌被峋鶗@著降低原有的酯酶和內(nèi)酯酶活力，而本來極低的磷酸三酯酶活力則獲得顯著的提升。特別值得一提的是，雙突變體H250I/I263W催化甲基對硫磷和乙基對氧磷的水解活力比野生酶分別提高了6962倍和106倍，而其原有的酯酶和內(nèi)酯酶活力卻顯著降低，酶的底物專一性發(fā)生了107倍的逆轉(zhuǎn)。

4　展 望

2015年7月，美通社在線發(fā)布《2014年全球工業(yè)酶行業(yè)研究報告及未來三年預(yù)測》。近年來，全球工業(yè)酶制劑市場規(guī)模逐年增加，年產(chǎn)值增長率為5%，2014年已達(dá)42.2億美元的規(guī)模。目前，全球工業(yè)酶市場基本上是寡頭壟斷。在2014年，諾維信作為工業(yè)用酶巨頭，占據(jù)了44%的市場份額；而杜邦公司和DSM分別占據(jù)20%和6%的市場份額。全球各地區(qū)需求呈現(xiàn)較大差異，歐洲和北美地區(qū)對工業(yè)酶的需求量最大，占據(jù)80%，而中國僅占9.4%。

在市場需求擴大和政策利好的雙重刺激下，2014年中國的工業(yè)酶制劑產(chǎn)量已達(dá)116.57萬噸并保持10%年產(chǎn)量增長趨勢，預(yù)計2017年產(chǎn)量將達(dá)到154.87噸。通過引進(jìn)國外先進(jìn)的設(shè)備、優(yōu)良的菌株以及新型酶制劑的開發(fā)，中國已開始進(jìn)入酶制劑工業(yè)的快速發(fā)展期。但在酶制劑研發(fā)的原始創(chuàng)新方面尚有一定差距，多數(shù)企業(yè)的自主開發(fā)能力還十分有限。

若能抓住當(dāng)今大數(shù)據(jù)、互聯(lián)網(wǎng)+的時代機遇，充分利用好全球共享共用的生物信息資源，掌握工業(yè)酶設(shè)計和改造的核心技術(shù)，并將之轉(zhuǎn)化為具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的工業(yè)酶實體資源，則可望從源頭上引領(lǐng)我國生物催化學(xué)科的快速崛起，推進(jìn)生物制造產(chǎn)業(yè)的高起點和跨越式發(fā)展。

10.3969/j.issn.1674-0319.2016.02.006