車穎潔，郝林*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

響應(yīng)面法優(yōu)化黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的工藝參數(shù)研究

車穎潔，郝林*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

以大豆黃漿水為原料，選用白地霉、扣囊擬內(nèi)孢霉、解脂假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母（2∶1∶1∶2）作為發(fā)酵菌株發(fā)酵黃漿水。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，對(duì)黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白（SCP）的工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明，影響SCP產(chǎn)量的因素大小順序?yàn)槌跏紁H、發(fā)酵時(shí)間、裝液量；最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為碳氮比5、初始pH 6、裝液量140 mL/250 mL、接種量6%、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時(shí)間42 h；經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的SCP產(chǎn)量達(dá)到3.28 g/100 mL。

黃漿水；單細(xì)胞蛋白；響應(yīng)面法；玉米淀粉水解糖

黃漿水是指從豆腐壓榨到成型的過(guò)程中，為了使豆腐獲得特定的含水量、彈性特征等，必須施加一定的壓力把內(nèi)部多余的水分通過(guò)布包排出，豆?jié){中的蛋白被凝固劑凝結(jié)成固體豆腐，豆腐與水分開(kāi)，分離出來(lái)的壓濾廢水[1]。黃漿水作為豆腐加工企業(yè)的副產(chǎn)品，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，含有蛋白質(zhì)、脂類、糖類、維生素、礦物質(zhì)、檸檬酸、維生素、色素、可溶性固形物等，其中生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）達(dá)7 400 mg/L，化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）達(dá)10 000 mg/L，總氮和氨氮（NH3-N）也較高，不能直接排放。目前企業(yè)主要采用生化處理方式，在曝氣池進(jìn)行降解有機(jī)物，投資大且效率低[2]。

單細(xì)胞蛋白（single cell protein，SCP）又稱微生物蛋白或菌體蛋白，是利用工業(yè)廢水、天然氣、農(nóng)副加工產(chǎn)品、石油烷烴類以及有機(jī)垃圾等作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母、細(xì)菌、微型菌、真菌等單細(xì)胞生物體，然后經(jīng)過(guò)凈化干燥處理后制成，是食品和飼料工業(yè)重要蛋白質(zhì)的來(lái)源，不僅可以作為飼料，還可以作為深加工的原料[3-4]。近年來(lái)，隨著利用農(nóng)副產(chǎn)品廢料可生產(chǎn)SCP的報(bào)道越來(lái)越多，成為人類關(guān)注的熱點(diǎn)。在飼料中SCP被作為一種重要的蛋白質(zhì)增補(bǔ)劑來(lái)代替常規(guī)蛋白質(zhì)。

本試驗(yàn)利用多種酵母及霉菌發(fā)酵黃漿水[5-7]。由于每種菌對(duì)生長(zhǎng)繁殖條件都有不同的要求，因此，必須研究適合于混合培養(yǎng)的發(fā)酵條件以達(dá)到充分利用廢水中有效物質(zhì)的目的，在發(fā)酵SCP的同時(shí)凈化廢水。該文通過(guò)對(duì)初始pH、碳氮比（C/N）、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、裝液量等影響發(fā)酵的主要因素進(jìn)行研究，從而使發(fā)酵工藝得到優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種與原料

白地霉（GeotrichumcandidumSH501）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；扣囊擬內(nèi)孢霉（Endomycopsis fiburigerCICC31258）、解脂假絲酵母（Candida lipolyticaCICC32457）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilisCICC31268）：均購(gòu)于中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院；

大豆黃漿水：取自豆制品加工企業(yè)；玉米粉：市售。

1.1.2試劑

糖化酶（100 000 U）、淀粉酶（10 000 U）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市科密歐試劑開(kāi)發(fā)中心；酒石酸鉀鈉：天津市登峰化學(xué)試劑廠。

1.1.3培養(yǎng)基

（1）麥芽糖培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、麥芽糖20 g、酵母膏5 g、瓊脂15 g、水1 000 mL，自然pH，在0.1 MPa、121℃條件下滅菌20 min。

（2）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 000 mL，煮沸30 min，雙層紗布過(guò)濾，濾液中加2%葡萄糖，補(bǔ)充水分，加2%瓊脂，自然pH，在0.075 MPa、115℃條件下滅菌30 min。

1.2儀器與設(shè)備

ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；5804R-臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BL-58A滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；水平型超凈工作臺(tái)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；BPH-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市光明醫(yī)療儀器廠；BPH-9000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：北京醫(yī)療設(shè)備廠；WB-200水浴鍋：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3方法

1.3.1單因素發(fā)酵條件的篩選

選取初始pH、碳氮比（C/N）、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、裝液量6個(gè)因素依次進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗(yàn)[8-12]。各因素的水平梯度設(shè)置分別為：初始pH值4、5、6、7、8；C/N 2.5（無(wú)外加碳源）、5、7、9、11；接種量（白地霉∶扣囊擬內(nèi)孢霉∶解脂假絲酵母∶產(chǎn)朊假絲酵母=2∶1∶1∶2）2%、4%、6%、8%、10%；發(fā)酵時(shí)間24 h、30 h、36 h、42 h、48 h，發(fā)酵溫度24℃、26℃、28℃、30℃、32℃；裝液量為80mL/250mL、100mL/250mL、120 mL/250 mL、140 mL/250 mL、160 mL/250 mL。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各個(gè)因素的最佳水平值，為響應(yīng)面試驗(yàn)提供依據(jù)，以便研究發(fā)酵的最佳條件。

1.3.2C/N比的調(diào)整方法

發(fā)酵液的C/N主要通過(guò)玉米粉水解糖[13-14]作為外加碳源進(jìn)行調(diào)整。玉米淀粉水解糖的制備方法為：準(zhǔn)確稱取100 g玉米粉于500 mL的燒杯中，加入200 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?；然后按照順序進(jìn)行糊化、液化、糖化等。首先進(jìn)行糊化，加入1 mL氯化鈣溶液以保證Ca2+含量，用5%的碳酸鈣調(diào)pH至6.2、在95℃水浴鍋中糊化15 min；然后進(jìn)行液化，加入1g活力為10 000 U的淀粉酶，在70℃水浴液化4～5 h，90℃滅活20 min，用碘液變褐為終點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)；最后糖化，在液化好的玉米粉水解液中加入1 g活力為100 000 U的糖化酶，在60℃水浴糖化8～9 h，后在80℃水浴滅活30 min，向無(wú)水乙醇中滴入糖化液1～2滴，若無(wú)白色沉淀則達(dá)到糖化終點(diǎn)。然后根據(jù)農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)用DNS法對(duì)水解糖中的還原糖進(jìn)行測(cè)定，利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算得到玉米淀粉水解液中的還原糖含量[15-17]。

1.3.3單細(xì)胞蛋白含量的測(cè)定

經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的黃漿水在臺(tái)式離心機(jī)中以4 000 r/min離心20 min，然后在70℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，即得SCP的質(zhì)量。

1.3.4響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件[17-22]

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)要求，對(duì)單因素試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出3個(gè)顯著因子（pH、時(shí)間、裝液量），以單細(xì)胞蛋白含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and levels of response surface methodology

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

將單因素試驗(yàn)結(jié)果匯總，以SCP的產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最佳發(fā)酵因素及其水平，為響應(yīng)面試驗(yàn)提供依據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Result of single factor experiment

根據(jù)表2可知，SCP產(chǎn)量隨著初始pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在初始pH為6時(shí)，達(dá)到最大；隨著C/N的逐漸增大，SCP產(chǎn)量逐漸減小，且在C/N為5時(shí)SCP產(chǎn)量最大；SCP產(chǎn)量隨著初始接種量的增大逐漸增大，在接種量為6%時(shí)達(dá)到最大，后逐漸減?。浑S著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，SCP產(chǎn)量逐漸增大，在42 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高，后逐漸減??；隨著發(fā)酵溫度的升高，SCP產(chǎn)量逐漸增大，在28℃時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高，之后逐漸減?。浑S著裝液量的增加，SCP產(chǎn)量逐漸增大，在140 mL/250 mL時(shí)達(dá)到最大，后開(kāi)始減小。因此，得到發(fā)酵條件為初始pH 6、C/N為5、接種量6%、溫度28℃、時(shí)間42 h、裝液量140 mL。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)是在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化的設(shè)計(jì)方案，采用極差分析對(duì)6組單因素水平進(jìn)行篩選，最終選用初始pH（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、裝液量（C）3個(gè)因素為主要考察因素，SCP產(chǎn)量（Y）為考察指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，按響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)SCP，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3　Designs and results of response surface methodology

表4　響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4　Variance analysis of response surface methodology

應(yīng)用Design Expert8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得出發(fā)酵工藝各因素變量的二次方程模型為：Y=3.06+ 0.34A+0.18B-0.099C-0.051AB+0.29AC+0.090BC-0.50A2-0.48B2-0.37C2。

由表4方差分析可知，模型失擬項(xiàng)不顯著（P=0.074 1＞0.05），說(shuō)明方程不失擬，回歸模型極顯著（P=0.001 1＜0.01），模型的相關(guān)系數(shù)R2為94.65%，說(shuō)明該模型能夠較好的擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此回歸方程給黃漿水的發(fā)酵提供了一個(gè)合適的模型。從方差分析中還可以看出方程的一次項(xiàng)中pH對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）、發(fā)酵溫度對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而A2、B2、C2均對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。這說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間、初始pH和裝液量這三個(gè)因素都是在發(fā)酵過(guò)程中需要主要控制的因素。模型AB交互項(xiàng)影響顯著，而B(niǎo)C、AC之間的交互作用均不顯著。

2.2.2黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)SCP的響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形能直觀地反映各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面圖及其等高線見(jiàn)圖1。

從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形觀察，各因素間有較為強(qiáng)的交互作用，發(fā)現(xiàn)其中曲線走勢(shì)越陡，其影響越顯著；曲線走勢(shì)越平滑，其影響越小。由圖1可知，三個(gè)響應(yīng)因素在選定的范圍內(nèi)都存在極值，其中AB交互作用顯著，BC、AC交互作用不顯著，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面得到優(yōu)化的結(jié)果為初始pH6.34、發(fā)酵時(shí)間43.03 h、裝液量140.36 mL/250 mL。

續(xù)表

圖1　初始pH、發(fā)酵時(shí)間、裝液量的交互作用對(duì)單細(xì)胞蛋白產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.1　Response surface plots and contour line of effects of interaction among initial pH,fermentation time and liquid volume on single cell protein production

2.3響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，通過(guò)優(yōu)化得知，初始pH為6.34，發(fā)酵時(shí)間為43.03 h、裝液量為140.36 mL/250 mL，經(jīng)過(guò)軟件分析得到的最佳SCP理論產(chǎn)量為3.32 g/100 mL。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，考慮實(shí)際操作性，在初始pH為6，發(fā)酵時(shí)間為42 h、裝液量為140 mL/250 mL條件下進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)3次的重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得SCP平均值為3.28 g/100 mL，與模型較吻合，說(shuō)明該模型可以較好地預(yù)測(cè)發(fā)酵情況，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

3　結(jié)論

我國(guó)豆制品種類豐富，年產(chǎn)量大，導(dǎo)致生產(chǎn)過(guò)程中的黃漿水產(chǎn)量很大，目前大采用的生化方式來(lái)處理，投資大且效果不理想。通過(guò)利用生物法發(fā)酵生產(chǎn)SCP以替代傳統(tǒng)的飼料，同時(shí)降低黃漿水中的COD、BOD等污染成分。本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法研究黃漿水發(fā)酵SCP的工藝，以求有效的解決廢水排放的問(wèn)題，提高資源利用率。

本試驗(yàn)通過(guò)初步對(duì)初始pH、C/N、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、裝液量等6個(gè)因素試驗(yàn)并進(jìn)行極差分析，經(jīng)過(guò)分析篩選得到3個(gè)顯著因子，分別為初始pH、發(fā)酵時(shí)間、裝液量。利用篩選出的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，最終得到發(fā)酵最佳工藝為：C/N為5、初始pH6、裝液量140 mL/250 mL、接種量6%、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時(shí)間42 h，最終經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)得到SCP最高產(chǎn)量為3.28 g/100 mL。

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Optimization of fermentation process of yellow slurry water for single cell protein production by response surface method

CHE Yingjie,HAO Lin*
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

Using yellow slurry water as raw material,Geotrichum candidum,Endomycopsis fiburiger,Candida lipolytica,andCandida utilis(2∶1∶1∶2) were selected as fermentation strains to ferment yellow slurry water.On the basis of single factor experiments,the fermentation process of yellow slurry water for single cell protein(SCP)production was studied by response surface experimental design method.The results showed that the factors affecting SCP production in order were:initial pH,fermentation time,liquid volume.The optimal extraction technology was C/N 5,initial pH 6,liquid volume 140 ml/250 ml,inoculum 6%,fermentation temperature 28℃and time 42 h.Under the optimized condition,the highest SCP production reached 3.28 g/100 ml.

yellow slurry water;single cell protein;response surface method;hydrolyzed corn starch

TQ920.9

0254-5071（2016）10-0091-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.020

2016-05-27

企業(yè)橫向聯(lián)合項(xiàng)目

車穎潔（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

郝林（1957-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。