張桂香，齊潔敏，王 闖，趙學(xué)東，莊新榮

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000

2.承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北 承德 067000）

PTENmRNA和hTERTmRNA與子宮內(nèi)膜樣腺癌生物學(xué)行為關(guān)系的探討

張桂香1，齊潔敏2，王 闖2，趙學(xué)東1，莊新榮1

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000

2.承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北 承德 067000）

目的：探討PTENmRNA、hTERTmRNA在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)及其與生物學(xué)行為的關(guān)系。方法：采用原位雜交法檢測(cè)50例子宮內(nèi)膜樣腺癌組織和50例正常子宮內(nèi)膜組織PTENmRNA、hTERTmRNA的表達(dá)情況，分析二者與子宮內(nèi)膜樣腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系。結(jié)果：PTENmRNA、hTERT-mRNA在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為30.0％和78.0％。PTENmRNA、hTERTmRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣癌的分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度均有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)論：PTENmRNA和hTERTmRNA與子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)PTENmRNA和hTERTmRNA可作為評(píng)估子宮內(nèi)膜樣腺癌惡性程度和預(yù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)。

子宮內(nèi)膜樣腺癌； PTENmRNA； hTERTmRNA； 原位雜交

本研究采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)了子宮內(nèi)膜樣腺癌組織PTENmRNA與hTERTmRNA的表達(dá)情況，并進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料：選擇2011年6月至2013年6月間經(jīng)病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜樣腺癌而入住承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的患者50例為研究對(duì)象，年齡39～69歲，平均年齡（51.6±2.8）歲，子宮內(nèi)膜癌手術(shù)－病理分期（按2009年FIGO標(biāo)準(zhǔn)）。取同時(shí)間段因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜50例做對(duì)照，平均年齡（52.3±2.9）歲，二者年齡差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝1.058，P＞0.05）。所有研究對(duì)象在術(shù)前均未接受放化療。

1.2 主要試劑：PTEN和hTERT原位雜交試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。AMRESCO生產(chǎn)的DEPC。DAB顯色劑購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。由河北省承德醫(yī)學(xué)院病理教研室提供PBS、蘇木素、伊紅、中性樹脂膠等。

1.3 原位雜交法（ISH）：①切片5μm厚，烤片60℃1h；石蠟切片常規(guī)脫蠟進(jìn)水；②30％過氧化氫處理10min以滅活內(nèi)源性酶；③滴3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃消化15min，暴露mRNA核酸片段；④用1％多聚甲醛后固定；⑤預(yù)雜交：滴加30l預(yù)雜交液，放入恒溫箱38℃，時(shí)間為3h；⑥雜交：滴加40l雜交液，恒溫箱37℃雜交過夜；⑦雜交后洗滌：2×SSC洗滌5min×2次，0.5×SSC洗滌15min，0.2×SSC洗滌15min。37℃水溫；⑧滴加封閉液：37℃孵育30min；⑨滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃，時(shí)間為 1h；滴加 SABC，37℃，時(shí)間為24min；滴加生物素化過氧化物酶，37℃，時(shí)間為20min；⑩DAB顯色，蘇木素復(fù)染，水洗，酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片，鏡下觀察。

表1 PTENmRNA、hTERTmRNA在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況

1.4 結(jié)果判定：取實(shí)驗(yàn)中滴加不含探針的雜交液者為陰性對(duì)照，以陽性切片做陽性對(duì)照。PTENmRNA陽性表達(dá)和hTERTmRNA陽性表達(dá)均主要定位于細(xì)胞漿，呈綜黃色顆粒狀。陽性表達(dá)等級(jí)采用陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分綜合確定。其中染色強(qiáng)度評(píng)分：無雜交信號(hào)，顏色與背景一致者為0分，淺黃色的弱陽性信號(hào)為1分，清晰可辨的棕黃色陽性信號(hào)為2分，顏色較深的棕黃色記為3分；陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：隨機(jī)選5個(gè)視野（×400倍），計(jì)數(shù)細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)分，陽性細(xì)胞數(shù)＜10％為0分，≥10％而＜25％為1分，≥25％而＜50％為2分，≥50％為3分。將二種評(píng)分之和作為等級(jí)判定結(jié)果：之和0分記為（－），1～2分記為（＋），3～4分記為（＋＋），5～6分記為（＋＋＋）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料描述采用例數(shù)和率，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTENmRNA和hTERTmRNA的表達(dá)情況：子宮內(nèi)膜腺癌組織PTENmRNA、hTERTmRNA的陽性率分別為30.0％和78.0％，與正常子宮內(nèi)膜組織比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 PTENmRNA和hTERTmRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系：子宮內(nèi)膜樣腺癌組織PTEN-mRNA和hTERTmRNA的表達(dá)與年齡無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與子宮內(nèi)膜腺癌的分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 PTENmRNA、hTERTmRNA陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系

3 討 論

（PTEN）具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN基因突變使其蛋白質(zhì)表達(dá)缺失，喪失抑制細(xì)胞增殖功能，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。Lacey等研究證實(shí)小鼠的PTEN基因失活會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生，并且發(fā)展成為子宮內(nèi)膜癌[1]。目前有研究發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白在多種惡性腫瘤中如Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌[2]、惡性膠質(zhì)瘤、喉癌、肝癌等惡性腫瘤中表達(dá)缺失。PTENmRNA是否與相應(yīng)的蛋白變化一致，本研究應(yīng)用原位雜交方法檢測(cè)了子宮內(nèi)膜樣腺癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中PTEN-mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示PTENmRNA陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿中，且較正常子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與PTEN蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌的表達(dá)缺失現(xiàn)象一致。而且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PTENmRNA與子宮內(nèi)膜樣腺癌的分化程度、FIGO分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示PTENmRNA低表達(dá)或缺失促進(jìn)了子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，以自身RNA為模板合成端粒，以維持端粒長(zhǎng)度，穩(wěn)定細(xì)胞染色體形態(tài)，從而逃避了因端?？s短引起的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞保持分裂增殖，獲得永生化的能力，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。hTERT是端粒酶活性的限速因子，它可以激活并上調(diào)端粒酶的活性。目前有研究發(fā)現(xiàn)，hTERT蛋白在胃癌[3]、肝癌、肺癌、腸癌等惡性腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá)。hTERTm-RNA是否與相應(yīng)的蛋白一樣在惡性腫瘤組織中明顯升高，本研究采用原位雜交方法檢測(cè)hTERTmRNA在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)，多為中、強(qiáng)陽性表達(dá)，并且表達(dá)率高達(dá)78.0％，且與分化程度、FIGO分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與hTERT蛋白在I型子宮內(nèi)膜癌中的高表達(dá)呈現(xiàn)高度一致性[5]。從而說明hTERTmRNA與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PTENmRNA在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的陽性表達(dá)率低于正常子宮內(nèi)膜組織，而hTERTmRNA在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中表達(dá)升高。而且兩者均與子宮內(nèi)膜樣腺癌的分化程度、FIGO分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，由此表明PTENmRNA、hTERTmRNA在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可作為子宮內(nèi)膜樣腺癌診斷及評(píng)估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物。

[1]lacey JV Jr，Mutter GL，Ronnett BM，et al.Pten expression in endometriosis biopsies as a marker of progression to endometriosis carcinoma[J].Cancer Res，2008，68（14)：6014～6020.

[2]張桂香，李春輝，齊潔敏，等.PTEN、P53及hTERN在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)[J].河北醫(yī)學(xué)，2013，19（12)：1787～1790.

[3]齊潔敏，高玉峰，任立群.老年人胃癌中PTEN和hTERT表達(dá)及兩者相關(guān)性[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2008，28（1)：79～80.

Investigating the Relationship of PTENmRNA and hTERTmRNA to the Biological Behavior in Endometrioid Adenocarcinoma

ZHANG Guixiang，et al

（The Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Hebei Chengde067000，China)

Objective：To investigate the expression of PTENmRNA and hTERTmRNA in endometrioid adenocarcinoma，and evaluate the relationship of their expression to the biological behavior of endometrioid adenocarcinoma.Methods：The expression of PTENmRNA and hTERTmRNA of the 50 patients with endometrioid adenocarcinoma and 50 patients with normal endometrium were observed by in situ hybridization，then evaluated their influence to the biological behavior of endometrioid adenocarcinoma.Results：The positive expression of PTENmRNA and hTERTmRNA were 30.0％and 78.0％respectively.The expression of PTENmRNA and hTERTmRNA were correlated with tumor differentiation，F(xiàn)IGO staging，lymphnode metastasis and muscular infiltration of endometrioid adenocarcinoma（P＜0.05).Conclusion：The expression of PTENmRNA and hTERTmRNA are related to the formation and development of endometrioid adenocarcinoma.Combined detection of PTENmRNA and hTERTmRNA expression can be used as an index to evaluate the malignant degree and prognosis of endometrioid adenocarcinoma.

Endometrioid adenocarcinoma； PTENmRNA； hTERTmRNA； In situ hybridization

1006－6233（2016)10－1604－04

A【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.10.009