王炳杰，胡延偉，趙葉芳，張仕東

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院 肛腸外科1， 普外科2、4，婦產(chǎn)科3，邢臺 054001)

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谷氨酰胺聯(lián)合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植在大鼠腸缺血再灌注損傷中的作用

王炳杰1，胡延偉2，趙葉芳3，張仕東4

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院 肛腸外科1， 普外科2、4，婦產(chǎn)科3，邢臺 054001)

目的 探討谷氨酰胺聯(lián)合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植在大鼠腸缺血再灌注損傷中作用。方法 體外復(fù)蘇并培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植前備用，觀察CM-DiI熒光標(biāo)記后臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的去向。80只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組，缺血再灌注損傷組，谷氨酰胺組，MSCs移植組及聯(lián)合組每組各15只。對照組采用生理鹽水灌腸，損傷組采用TNB (S乙醇稀釋)灌腸，在TNBS建模后1 h，谷氨酰胺組于尾靜脈輸入谷氨酰胺0.45 g/kg、MSCs移植組于尾靜脈輸入1 × 1010/L臍血間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，聯(lián)合組尾靜脈輸入谷氨酰胺0 .45 g/kg + 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞懸液1 × 1010/L。通過ELISA法檢測各組大鼠血清中腸脂肪酸結(jié)合蛋白(IFABP)、白介素-6(IL-6)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量；各組于再灌注1 h、3 h后檢測腸組織含水率；通過RT-PCR、Western blot觀察大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞caspase-3、NF-kB、Bcl-2在谷氨酰胺聯(lián)合MSCs移植后的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 通過熒光示蹤法觀察到移植的MSCs細(xì)胞分布于腸粘膜淋巴組織內(nèi)和腺上皮細(xì)胞間，表明MSCs可能參與了腸缺血再灌注損傷的修復(fù)過程。各組大鼠血清中SOD、IFABP、IL-6的含量變化比較，損傷組血清中IFABP、IL-6的含量較對照組顯著增加，而谷氨酰胺組，MSCs移植組及聯(lián)合組與之比較，則顯著減少，聯(lián)合組減少更為明顯，損傷組血清中SOD的含量較對照組顯著減少，而谷氨酰胺組，MSCs移植組及聯(lián)合組與之比較，則顯著增高，聯(lián)合組增高更為明顯(P<0.05)。再灌注1 h和3 h，損傷組腸組織含水率均明顯高于對照組；與損傷組相比，谷氨酰胺組、MSCs移植組及聯(lián)合組腸組織含水率值均顯著降低，聯(lián)合組降低更為明顯，而谷氨酰胺組、MSCs移植組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，損傷組腸黏膜上皮細(xì)胞caspase-3、NF-kB的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，而谷氨酰胺組、MSCs移植組及聯(lián)合組與之比較，caspase-3、NF-kB的mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，谷氨酰胺組及MSCs移植組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但兩組與聯(lián)合組比較，差異明顯(P<0.05)。結(jié)論 谷氨酰胺組及MSCs移植后，明顯減輕了大鼠腸缺血再灌注損傷程度，其可能通過抑制caspase-3、NF-kB表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2表達(dá)減輕腸黏膜缺血再灌注損傷。

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞；谷氨酰胺；移植；大鼠；腸道損傷

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IR)是多種原因誘發(fā)的器官缺血時引起原有結(jié)構(gòu)破壞，當(dāng)恢復(fù)血液供應(yīng)時細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)遭到損傷并出現(xiàn)功能障礙，使損傷加重的現(xiàn)象[1，2]。小腸是IR最常累及的器官，在臨床上是無法避免的病理生理過程，腸系膜動脈取栓術(shù)后、溶栓術(shù)后、出血性休克、小腸移植術(shù)后常會繼發(fā)性發(fā)生，有很高的死亡率，且預(yù)后很差[3]。腸IR與其他器官的IR損傷不同，其不僅有氧自由基的生成、免疫細(xì)胞應(yīng)答、炎癥因子釋放的過程[4]，還有缺血缺氧所致的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞屏障功能受破壞，進(jìn)而引起細(xì)菌移位，導(dǎo)致全身性的免疫應(yīng)答和多器官功能障礙[5，6]。

谷氨酰胺(glutamine, Gln)對腸上皮細(xì)胞正常作用的發(fā)揮起重要作用，是抗氧化防御系統(tǒng)中重要物質(zhì)谷胱甘肽和核苷酸等合成的前體，在抗氧化應(yīng)激中對機(jī)體起到保護(hù)作用[7]。既往研究表明，Gln能夠減輕IR損傷，起到保護(hù)性作用[8]。

IR損傷目前還沒有確切的治療手段，國際研究熱點集中在干細(xì)胞移植治療[9]。干細(xì)胞有臍血和骨髓兩種來源[10]，因自體移植需抽取自體骨髓來進(jìn)行分離以及培養(yǎng)周期較長，并且得到的數(shù)目較少，活性不高，定向遷移以及促進(jìn)再生的能力均下降，且病人及家屬較難接受，所以臨床實施有一定的困難[11]。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells, HUMSCs)從臍血中分離得到，相比于祖細(xì)胞更加原始，增殖分化能力更強(qiáng)，無論是在體內(nèi)還是體外均能多方向分化[12]，是目前在腦損傷、腸IR損傷等多種疾病在內(nèi)的治療中常用的理想細(xì)胞[13-14]。HUMSCs免疫原性極低，一般情況下不會引起免疫反應(yīng)或者是移植物抗宿主病，因此受到臨床工作者的青睞，有望成為理想的取材細(xì)胞。本研究聯(lián)合應(yīng)用Gln和HUMSCs，觀察其對IR的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗于2013年3月～2015年10月在河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心完成，實驗動物使用許可證號：【SYXK(冀)2011-0005】。80只SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：【SCXK(冀)2011-0004】。實驗中對動物的處置符合動物倫理學(xué)要求。CM-DiI(美國Invitrogen公司)；谷氨酰胺粉末，純度99%(美國 Sigma 公司)；細(xì)胞裂解液和BCA法定量試劑(碧云天生物技術(shù)公司)；PVDF膜(Millipore公司)；anti-NF-kB antibody(Santa Cruz公司)；anti-β-actin(福州中彬金橋公司)；IFABP檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；總RNA提取試劑TRIzol(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；Soniprep150型超聲波發(fā)生器(上海寧商超聲儀有限公司)；酶聯(lián)免疫試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外復(fù)蘇并培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞：將凍存管從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解凍，注意避免凍存管頂部沾水而受污染。將細(xì)胞加入有培養(yǎng)基的離心管中，1 500 r/min 離心5 min，去掉上清液，接種到新的培養(yǎng)基皿中，置入體積分?jǐn)?shù)為0.05 的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3 d半量換液1次，7～10 d傳代 1 次。繼續(xù)觀察，待貼壁細(xì)胞融合完全后對其進(jìn)行消化并進(jìn)行傳代，將第2代的細(xì)胞分別接種到2個6孔板上，調(diào)整細(xì)胞密度使其滿足1×105孔，當(dāng)再次融合達(dá)80%時，向其中添加誘導(dǎo)劑。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.2 大鼠建模及其實驗分組： 參加實驗80只，進(jìn)入結(jié)果分析75只，中途死亡及其脫落5只。將其75只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組，缺血再灌注損傷組，谷氨酰胺組，MSCs移植組及聯(lián)合組每組各15只。對照組采用生理鹽水灌腸，損傷組采用TNB (S乙醇稀釋)灌腸，在TNBS建模后1h，谷氨酰胺組于尾靜脈輸入谷氨酰胺0.45 g/kg、MSCs移植組于尾靜脈輸入1×1010/L 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，聯(lián)合組尾靜脈輸入谷氨酰胺0 .45 g/kg+臍血間充質(zhì)干細(xì)胞懸液1×1010/L。

1.2.3 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞示蹤：利用CM-DiI與HUMSCs結(jié)合而將其標(biāo)記，使其在顯微鏡下觀察時能夠表現(xiàn)出紅色的熒光而進(jìn)行跟蹤。將等量的CM-DiI與DMSO進(jìn)行混合并充分溶解后制成原液，隨后從中抽取2 μL放到干凈的Ep管中，添加DPBS液1 mL制成2 μg/mL的工作液。向上述已制備好的HUMSCs中添加PBS進(jìn)行濃度的調(diào)整，使其滿足1 mg/mL，并從中抽取50 μL添加到干凈的Ep管中，向其中添加等量的上述配好的工作液，放在培養(yǎng)箱中溫育5 min，隨后將其放在4℃條件下靜置15 min，畢后用PBS進(jìn)行沖洗。將其放在離心機(jī)中，調(diào)整參數(shù)進(jìn)行離心，2 h后將其取出丟棄上層液體，用槍頭對下層留下的沉淀進(jìn)行反復(fù)吹打，隨后將其進(jìn)行接種及培養(yǎng)。并從中取出少量的細(xì)胞行細(xì)胞爬片，監(jiān)測細(xì)胞的變化，6 h后將其置于熒光顯微鏡下對CM-DiI標(biāo)記的HUMSCs的進(jìn)行觀察，對結(jié)果進(jìn)行拍照。4周后將大鼠處死，同時取腸組織立即以O(shè)CT包埋，冰凍切片，直接熒光顯微鏡下觀察，記錄和分析CM-DiI熒光分布情況。

1.2.4 ELISA法檢測IFABP、IL-6、SOD的含量： 將大鼠麻醉后處死，截取腸管約1 000 mg，將腸系膜以及內(nèi)含物分離，用生理鹽水對其進(jìn)行沖洗，隨后放在-80℃條件下進(jìn)行保存。在4℃條件下將300 mg的腸組織用生理鹽水進(jìn)行沖洗，隨后用濾紙將其表面的水分吸干，將9倍于組織塊的生理鹽水視為勻漿介質(zhì)。調(diào)整Soniprep150超聲波發(fā)生器的參數(shù)為振幅14 μm，時間30 s，使細(xì)胞充分破裂。將組織勻漿中的10%放在低溫離心機(jī)中，調(diào)整其參數(shù)，進(jìn)行離心，將上清液取出并保留。采用ELISA方法測定血清中IFABP、IL-6、SOD的含量。

1.2.5 各組于再灌注1 h、3 h后檢測腸組織含水率： 將大鼠處死后進(jìn)行消毒并剖開腹部取回盲瓣以上腸管3 cm，將其內(nèi)的內(nèi)容物以及附于表面的腸系膜丟棄，用生理鹽水進(jìn)行反復(fù)沖洗。用吸水紙將附于表面的水分吸取干凈，隨后將其放在電子分析天平上稱量其濕重(W)，將其放在80℃的恒溫干燥箱中進(jìn)行烘干，對其進(jìn)行反復(fù)稱重直至重量不再變化，再次進(jìn)行稱重，得到干重(D)，根據(jù)公式[(W - D)/W] × 100%，計算含水率。

1.2.6 通過RT-PCRt檢測caspase-3、NF-kB、Bcl-2 mRNA的表達(dá)：對總RNA進(jìn)行提取并轉(zhuǎn)錄。β-actin 上游引物:5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游引物:5’-TCAGGAGGAGCAATGATCT TG-3’；Casepase-3上游引物：5’-AGATACCGGTGGAGG CTGACT-3’，下游引物：5’-TCTTTCGTGAGCATGG ACACA-3’； NF-kB的上游引物：5’-GCATTCTGAC CTTGCCTATC-3’,下游引物：5’-ATCCTTCCCAAA CTCCACC-3’；Bcl-2 上游引物:5’-CGCTGGGAG AACAGGGTA-3′，下游引物:5’-GGGCTGGGAGG AGAAGAT-3′。加入SYBR Green RCR Master Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1μL，DEPC H2O 8.2 μL，將上述物質(zhì)進(jìn)行混合，隨后進(jìn)行離心，行PCR反應(yīng)。畢后行溶解曲線分析，根據(jù)結(jié)果來確定該反應(yīng)是否特異。應(yīng)用軟件分析得到的結(jié)果。

圖1A：首次換液后可見部分細(xì)胞已貼壁；圖1B：第3代MSCs細(xì)胞； 圖1C：第6代MSCs細(xì)胞圖1 MSCs細(xì)胞的形態(tài)觀察(×100)Fig. 1A. After the first change of medium, some cells were adherent to the glass surface. Fig. 1B: The 3rd generation of MSCs cells; Figure 1C: The 6th generation of MSCs cellsFig.1 Morphological observation of the MSCs

1.2.7 Western blot檢測caspase-3、NF-kB、Bcl-2 蛋白的表達(dá)：將大鼠麻醉后，迅速取出包含損傷區(qū)域在內(nèi)的腸組織約10 mm，對其中的總蛋白參照說明書進(jìn)行提取，隨后對蛋白樣品濃度進(jìn)行檢測。清洗玻璃板，進(jìn)行灌膠上樣，并進(jìn)行電泳，將蛋白采用印跡法取 50 μg 總蛋白于 10% 聚丙烯酰胺凝膠中電泳。取纖維膜用半干式電印跡將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，37℃溫育2 h，加入一抗后過夜，次日洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，重復(fù)進(jìn)行上述溫育及洗膜處理，用顯色劑進(jìn)行顯色。重復(fù)以上操作步驟3次。用Quantity One 處理系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果的處理。

2 結(jié)果

2.1 MSCs細(xì)胞的形態(tài)觀察

剛接種完畢后對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)其形態(tài)不一，差異性較大。進(jìn)行首次換液后將未貼壁的細(xì)胞及雜質(zhì)去除后可見到部分細(xì)胞已貼壁，但形態(tài)仍不規(guī)則(圖1A)。4 d后再次換液可見有小的細(xì)胞集落形成，7 d后再次觀察可見集落明顯增大，并且呈方向性排列，10～12 d后細(xì)胞融合度良好，可以進(jìn)行傳代。傳代后生長速度明顯增快，且形態(tài)逐漸趨于一致。第3代時細(xì)胞胞質(zhì)色變淺，核較清晰，胞體以紡錘形和梭形為主，周圍可見數(shù)量不等的突起，突起間相互交織，細(xì)胞排列較紊亂，極性不明顯(圖1B)。至第6代時，細(xì)胞的形態(tài)比較無明顯變化，但胞體變長變大，形態(tài)更加均一，呈方向性排列，極性較一致(圖1C)。

2.2 CM-Dil標(biāo)記的HUMSCs形態(tài)觀察

HUMSCs能否于腸IR損傷中發(fā)揮作用的前提是其能否有效的表達(dá)于腸組織中，為了對其進(jìn)行證明，我們用活細(xì)胞染色劑CM-DiI對其進(jìn)行染色。將活細(xì)胞染色劑CM-DiI與HUMSCs共同放置6h后利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CM-DiI標(biāo)記后的HUMSCs細(xì)胞均發(fā)出紅色熒光(圖2A)。將CM-DiI標(biāo)記的HUMSCs細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植入腸IR大鼠后，用熒光顯微鏡在大鼠腸粘膜的淋巴以及上皮細(xì)胞的冰凍切片中可以見到大量的HUMSCs分布，且向損傷區(qū)遷移(圖2B)，提示其可能參與腸IR損傷的修復(fù)過程。

2.3 ELISA法檢測IFABP、IL-6、SOD的含量

對各組中IFABP、IL-6以及SOD含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，損傷組血清中IFABP以及IL-6的含量較對照組明顯增加，而谷氨酰胺組、MSCs移植組以及聯(lián)合組兩者的含量則明顯減少，且聯(lián)合組減少更為顯著(P<0.05)；對各組中SOD含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，損傷組較對照組明顯減少，而其他三組較其則顯著增高，且聯(lián)合組增高更顯著(P<0.05)。見表1。2.4 再灌注1 h、3 h后腸組織含水率的檢測結(jié)果

Tab.1 The changes of supernatant IFABP, IL-6, and SOD in the intestinal tissue of various groups

組別Groups人腸脂肪酸結(jié)合蛋白(IFABP)(ng/L)白介素-6(IL-6)(ng/L)超氧化物歧化酶(SOD)(ng/L)對照組Control1223.04±76.54a1380.48±131.32a134.09±27.05a損傷組Injury1302.23±136.13b1535.68±104.56b116.88±25.93b谷氨酰胺組Glutamine1033.04±126.24c976.57±114.60c234.66±24.12cMSCs組MSCs1016.17±105.13d957.83±105.06d249.58±23.20d聯(lián)合組Combination636.78±35.40305.98±29.69420.53±23.20

注：abcdP<0.05。 Note.abcdP<0.05.

Tab.2 Comparison of the water content in the intestinal tissue of the groups

組別Groups腸組織含水率(%)Watercontentintheintestinaltissue1h3h對照組Control41.52±2.18a45.41±2.24a損傷組Injury84.46±2.66b89.26±2.08b谷氨酰胺組Glutamone64.94±2.11c62.53±2.80cMSCs組MSCs64.68±2.20d62.42±2.67d聯(lián)合組Combination43.42±2.5645.13±2.23

注：abcdP<0.05。Note.abcdP<0.05。

IR損傷后不同時間點對各組含水率進(jìn)行比較：損傷組中腸組織的含水率較對照組明顯升高，且顯著高于其他三組，與聯(lián)合組相比差異最為顯著(均P<0.05)；而谷氨酰胺與MSCs組進(jìn)行比較無意義(P>0.05)。見表2。

2.5 Caspase-3、NF-kB、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

經(jīng)PT-PCR對各組mRNA進(jìn)行測定可知，與對照組相比，損傷組的腸粘膜上皮細(xì)胞中caspase-3及NF-kB的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，而Bcl-2的mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)；而谷氨酰胺、MSCs以及聯(lián)合組與之相比較，caspase-3、NF-kB明顯下調(diào)，Bcl-2明顯上調(diào)，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。如圖3。

2.6 Caspase-3、NF-kB、Bcl-2 蛋白的表達(dá)

對蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，損傷組中caspase-3的表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)；而谷氨酰胺、MSCs以及聯(lián)合組與之相比較，caspase-3明顯下調(diào)，Bcl-2明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。對各組間總NF-kB進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步對各組磷酸化的NF-kB表達(dá)水平進(jìn)行比較，得到與casepase-3一致的結(jié)果，即損傷組中磷酸化的NF-kB表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)；而谷氨酰胺、MSCs以及聯(lián)合組與之相比較，磷酸化的NF-kB明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖2A：腸粘膜淋巴組織CM-Dil標(biāo)記的MSCs；圖2B：上皮細(xì)胞CM-Dil標(biāo)記的MSCs圖2 CM-DiI標(biāo)記的MSCs(×200)Fig. 2A: CM-Dil-labeled MSCs in the intestinal lymphoid tissue; Fig. 2B: The epithelial cell CM-Dil-labeled MSCsFig.2 The CM-DiI labeled MSCs

圖3 各組Caspase-3、NF-kB、Bcl-2 mRNA表達(dá)Fig.3 Expression of caspase-3, NF-kB, and Bcl-2 mRNA in each group

圖4 各組caspase-3、NF-kB、Bcl-2 蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of caspase-3, NF-kB, and Bcl-2 protein in each group

圖5 各組NF-kB的表達(dá)情況Fig.5 The expression of NF-κB in each group

3 討論

大量研究表明，腸道可能是對缺血缺氧最敏感的器官之一，在腸絞窄、腹部外傷及腸系膜血管缺血性疾病等情況下，小腸出現(xiàn)不同程度的缺血性損傷，當(dāng)恢復(fù)血流時，其損傷進(jìn)一步加重[15-18]。因此，研究IR的機(jī)制以及如何對其進(jìn)行預(yù)防有重要意義。牛瓊等[19]研究表明，在IR中Gln能夠保護(hù)腸粘膜，但是否和抗氧化應(yīng)激以及抗炎相關(guān)，未見報道。

近年來，人們對腸IR損傷的機(jī)制有了更加深入的了解，如氧自由基、促炎細(xì)胞介質(zhì)、黃嘌呤氧化酶的釋放等機(jī)制均參與腸IR損傷[20]。小腸絨毛中含有大量的活性氧簇相關(guān)的酶，當(dāng)IR時能夠激活腺嘌呤-次黃嘌呤途徑，增加氧自由基的產(chǎn)生。SOD是氧自由基的去除劑能夠反映機(jī)體對其的去除能力。而IL-6被認(rèn)為是IR的主要致病因子。本研究通過對SOD及IL-6進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，機(jī)體損傷后SOD表達(dá)減少，而IL-6表達(dá)增加，與以往研究一致[21]。IFABP亦是腸IR損傷的指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，損傷組IFABP表達(dá)量明顯增加，與既往[22]的研究結(jié)論相同。

細(xì)胞凋亡是IR過程中的關(guān)鍵一環(huán)。通過對腸組織中凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測，能夠反映大鼠IR損傷后腸道的變化情況。其通過激活casepase最終誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。Bcl-2是抗凋亡因子中的一員[23，24]。而NF-kB能夠上體炎癥及免疫因子的表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致臟器的損傷[25]。本研究通過對其進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，IR后casepase以及NF-kB表達(dá)增加，而Bcl-2減少。

總之，通過本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腸IR損傷后進(jìn)行谷氨酰胺聯(lián)合HUMSCs移植，能夠改善損傷，對腸道起到保護(hù)性作用。其可能的機(jī)制是減少casepase-3、NF-kB并促進(jìn)Bcl-2表達(dá)來實現(xiàn)。

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Effects of glutamine in combination with umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation on intestinal ischemia reperfusion injury in rats

WANG Bing-jie1, HU Yan-wei2, ZHAO Ye-fang3, ZHANG Shi-dong4

(1.Department of Anorectal Surgery, 2,4. Department of General Surgery,3. Department of Obstetrics and Gynecology, Hebei Medical University Xingtai City People’s Hospital, Xingtai Hebei 054001, China)

Objective To investigate the effect of glutamine in combination with umbilical cord blood mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Umbilical cord blood mesenchymal stem cells were isolated, and were labeled with CM-DiI fluorescent dye. Eighty Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, ischemia reperfusion injury group, glutamine group, MSCs transplantation group and combined group with 15 rats in each group. The control group received saline enema. The injury group was treated with TNBS (ethanol dilution) enema. The glutamine group at 1 h after TNBS received intravenous injection of 0.45 g/kg glutamine. The rats of MSCs transplantation group had tail vein injection of 1 ×1010/L umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension, and the combined group received intravenous injection of glutamine 0.45 g/kg and 1×1010/L umbilical cord blood mesenchymal stem cell suspension. ELISA was used to detect the midgut fatty acid binding protein (iFABP), interleukin 6 (IL-6), and superoxide dismutase (SOD) content in the rat serum. The water content of intestinal tissue was detected at 1 h and 3 h after reperfusion in each group. The expressions of NF-kB, Bcl-2 and caspase-3 mRNA and proteins in the rat intestinal epithelial cells after treated with glutamine in combination with MSCs were detected by RT-PCR and Western blot assays. Results The fluorescent tracer method revealed that the transplanted MSCs cells were distributed in the intestinal mucosal lymphoid tissues and glandular epithelial cells, indicating that MSCs might be involved in the repair process of intestinal ischemia-reperfusion injury. The content of serum IFABP and IL-6 in the injured group was significantly higher than that in the control group, while significantly reduced in the glutamine group, MSCs transplantation group and combined group, with the most obvious in the combined group. The content of SOD in the injury group was significantly lower than that in the control group, and significantly increased than that in the glutamine group, MSCs transplantation group, with the most striking in the combined group (P<0.05 for all). The water content of intestinal tissue in the injury group at 1 and 3 hours after reperfusion was significantly higher than that in the control group, significantly lower in the glutamine group, MSCs transplantation group and the combined group, with the most decreased in the combination group, and there was no significant difference between the glutamine group and MSCs transplantation group (P>0.05). Compared with the control group, the caspase-3 and NF-kB mRNA and protein expressions in the intestinal mucosal epithelial cells of the injury group were significantly increased, and the expressions of Bcl-2 mRNA and protein were significantly reduced (P<0.05), the expressions of caspase-3 and NF-kB mRNA and protein were significantly reduced in the glutamine group, MSCs transplantation group and combined group. The expressions of Bcl-2 mRNA and protein were significantly increased (P<0.05), while no significant difference was shown between the glutamine group and MSCs transplantation group (P>0.05), but there was a significant difference between these two groups and the combined group (P<0.05). Conclusions After treated with glutamine and MSCs transplantation, the degree of intestinal ischemia reperfusion injury is obviously reduced in rats. It may be mediated through inhibiting the expression of caspase-3 and NF-kB and promoting the expression of Bcl-2.

Umbilical cord blood mesenchymal stem cells; Glutamine; Transplantation; Rat; Intestinal ischemia reperfusion injury; Rat

王炳杰(1978-)，主治醫(yī)師，研究方向：普外，肛腸。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0025-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.006

2016-06-15