胡玲玲,湯德元,曾智勇,黃 濤,李 達(dá),韋冠東,龍冬梅
( 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)
豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型及鏈球菌混合感染的診斷
胡玲玲,湯德元*,曾智勇,黃 濤,李 達(dá),韋冠東,龍冬梅
( 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)
2016年3月貴州省某規(guī)模化豬場(chǎng)的保育豬相繼出現(xiàn)四肢無(wú)力,趴地不能站立,叫聲嘶啞,死亡率高。經(jīng)臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室診斷確診為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型和鏈球菌混合感染?,F(xiàn)將診斷結(jié)果報(bào)道如下:
該規(guī)模化豬場(chǎng)存欄豬1 000余頭,2016年3月中旬開(kāi)始在2~3月齡保育豬出現(xiàn)發(fā)病,呈叫聲嘶啞、體溫升高、眼緣腫大、四肢無(wú)力、趴地不能站立,并不斷出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;截止3月下旬共31頭豬發(fā)病,死亡18頭,另外13頭表現(xiàn)出相同的癥狀。
發(fā)病豬精神沉郁、食欲減退,消瘦,皮膚蒼白,叫聲嘶啞,體溫升高至40~41 ℃,四肢無(wú)力,走路搖晃,趴在地上不愿站立,外陰腫大,大腿內(nèi)側(cè)及腹部皮膚出現(xiàn)針尖狀出血點(diǎn)。發(fā)病特點(diǎn)為:發(fā)病急、病程短、死亡率高。初步懷疑為病毒性疾病和細(xì)菌性疾病混合感染。
無(wú)菌剖檢病死豬的病理變化為:剖檢腹腔可見(jiàn)腸道嚴(yán)重充氣(圖1),腸系膜淋巴結(jié)部分腫大及充血,肝臟邊緣梗死(圖2),脾臟有大量瘀斑、邊緣呈鋸齒狀(圖3),胃底黏膜有出血、潰瘍?cè)睿▓D4)、心臟包膜有積液,肺部可見(jiàn)大量嚴(yán)重壞死病、嚴(yán)重充血、淤血(圖5),腸道黏膜出、充血現(xiàn)象明顯(圖6),膀胱黏膜有針尖大的出血點(diǎn)。
圖1 腸道充氣
圖2 肝臟邊緣梗死
圖3 脾臟邊緣鋸齒狀
圖4 胃黏膜潰瘍?cè)?
圖5 肺部可見(jiàn)明顯充血、壞死
圖6 腸道出血
4.1 細(xì)菌分離鑒定
4.1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)
無(wú)菌條件下將病豬的血液、肺臟和肝分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基上,于37 ℃條件下需氧/厭氧培養(yǎng)24~72 h觀察。結(jié)果培養(yǎng)基在需氧和厭氧環(huán)境下均有菌落生成長(zhǎng),判定分離菌為兼性厭氧菌。細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)貧瘠,培養(yǎng)24 h后有針尖大小的單個(gè)菌落出現(xiàn)。然后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng),同時(shí)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行涂片、革蘭氏染色后經(jīng)1 000倍油鏡鏡檢有大量藍(lán)紫色圓形、雙球形或短鏈狀革蘭陽(yáng)性球菌(圖7)。
圖7 10x100倍油鏡下可見(jiàn)單個(gè)或成鏈狀的球菌
4.1.2 生化鑒定
用杭州百思生物技術(shù)有限公司的BS7009球菌生化試劑盒檢測(cè),結(jié)果表明:厭氧條件下培養(yǎng)的細(xì)菌對(duì)葡萄糖、蔗糖、果糖、覃糖、麥芽糖、甘露糖、蜜二糖、山梨醇以及N-乙酰葡胺試驗(yàn)呈陽(yáng)性;木糖醇及硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陰性;需氧條件下培養(yǎng)的細(xì)菌對(duì)蔗糖、蜜二糖、果糖試驗(yàn)呈陽(yáng)性;麥芽糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、木糖醇、山梨醇、覃糖、N-乙酰葡胺及硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陰性;鑒定結(jié)果符合鏈球菌的生化特性。
表1 擴(kuò)增目的片段的引物
4.2??病毒核酸檢測(cè)
4.2.1 病料處理及DNA/RNA的提取
將送檢的死豬解剖分離各個(gè)器官,分別將心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及淋巴結(jié)進(jìn)行取樣研磨,反復(fù)凍融3次,再用勻漿器進(jìn)行勻漿收集其勻漿液,再取其血液,10 000 r/min離心10 min取其上清液進(jìn)行DNA/RNA的提取,嚴(yán)格按照TaKaRa MinBEST Vira1 RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0說(shuō)明書(shū)一步法提取DNA/RNA。
4.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
根 據(jù)GenBank中 登 錄 的PRV gB(AF257079)、PRVgE(JX417716)、PCV2 ORF2(NC_005148)、CSFV C(AY805221)、PRRSV ORF6(NC_001961)、PPV NS1(NC_001718) 和 SIV M(GU086140)等 基 因 序 列, 應(yīng) 用DNAStar、O1igo、MPprimer各設(shè)計(jì)了1對(duì)引物,用于擴(kuò)增目的基因片段,引物均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。
4.2.3 PCR/RT-PCR反應(yīng)
對(duì)提取的核酸分別進(jìn)行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV和SIV的病原檢測(cè),各反應(yīng)體系及條件如下:CSFV、PRRSV和PCV2反應(yīng)體系:2×1 Step Buffer 12.5 μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μL,上下游引物各1 μL,RNA模板2 μL,RNase Free H2O 7.5 μL, 總 體 積25 μL。反應(yīng)程序50 ℃ 40 min;94 ℃5 min;94 ℃30 s,56 ℃30 s,72 ℃30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PRV反應(yīng)體系: 2×GC Buffer 12.5 μL,dNTPs (10 mmo1/L) 1.0 μL,上下游引物各1.0 μL,模板各2.0 μL, Taq DNA聚 合 酶 1.0 μL,RNase Free H2O 6.5 μL,總體積25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min;94 ℃ 1 min; 58 ℃ 1 min;72 ℃ 45 s; 35個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。PPV和SIV反應(yīng)體系: 2×1 step buffer 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板3 μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μL,RNase Free H20 6.5 μL,總體積25 μL。PPV反應(yīng)程序95 ℃5 min;95 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。SIV反應(yīng)程序50 ℃40 min;95 ℃5 min;95 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s,35個(gè) 循 環(huán);72 ℃10 min。
圖8 PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
4.2.4 PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
各取5 μL PCR/RT-PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖8所示:
如圖8所示檢測(cè)出豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型特異性病原核酸陽(yáng)性條帶,測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符,確診為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型感染。
根據(jù)臨床典型癥狀,結(jié)合流行特點(diǎn)、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離鑒定以病毒及PCR/RT-PCR檢測(cè),確診該豬場(chǎng)豬發(fā)病原因?yàn)樨i瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型和鏈球菌混合感染引起的發(fā)病死亡。
隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化、集約化的不斷發(fā)展及治療豬病手段的不斷進(jìn)步,隨之而來(lái)的疾病的種類(lèi)也產(chǎn)生了變化,由以往的單一病原致病發(fā)展到多種病原混合感染和繼發(fā)感染。雖然藥物治療手段和效果越來(lái)越好,但隨之豬病的復(fù)雜程度及其危害也與日俱增。這對(duì)我們獸醫(yī)工作人員是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)。CSFV和PRRSV是病毒性疫病的重要病原,CSFV、PRRSV能夠損傷機(jī)體的免疫系統(tǒng),降低豬群對(duì)外界環(huán)境的抵抗力,使得豬群發(fā)生疾病時(shí)多種病原混合感染和繼發(fā)感染的情況越來(lái)越普遍,由于這些病毒給機(jī)體造成相似臨床癥狀,導(dǎo)致疾病的診斷十分困難,難以及時(shí)給予相應(yīng)的防治。目前在臨床上多見(jiàn)CSFV與其他病毒或細(xì)菌的混合感染使病情復(fù)雜,臨床上或不呈現(xiàn)典型癥狀,增大了臨床診斷的難度,同時(shí)也增大了豬群的發(fā)病率和死亡率,應(yīng)引起重視。
鏈球菌病是由鏈球菌感染引起的,我國(guó)部分省區(qū)時(shí)有發(fā)生。鏈球菌不僅可以侵入血液循環(huán)系統(tǒng),而且可以穿過(guò)血腦屏障和胎盤(pán)屏障導(dǎo)致腦膜炎及母畜流產(chǎn)。在健康豬的體內(nèi)、血液循環(huán)系統(tǒng)、肝臟、腎臟、脾臟、腦脊液等器官和體腔內(nèi)是無(wú)病原體存在的,只有與外界相通的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等有大量的微生物存在,當(dāng)豬所在環(huán)境條件差,如夏季溫度過(guò)高,濕度大,通風(fēng)不暢;冬天寒冷潮濕,溫差大;飼養(yǎng)管理不善,沒(méi)有規(guī)范的消毒措施,沒(méi)有嚴(yán)格的免疫程序,缺乏保健措施;以及飼料營(yíng)養(yǎng)不平衡,有發(fā)霉變質(zhì)現(xiàn)象等,使豬機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài),特異性、非特異性免疫反應(yīng)就會(huì)受到抑制,機(jī)體防御屏障被打破,從而容易受到病原體侵入,疾病進(jìn)入潛伏期或者表現(xiàn)出臨床癥狀,如果沒(méi)有及時(shí)改善不利因素同時(shí)做出對(duì)病情的診斷和治療,病原體會(huì)大量增殖,進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),到達(dá)各臟器并造成損傷。
建議豬場(chǎng)做好環(huán)境衛(wèi)生消毒工作,首先對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行隔離飼養(yǎng);對(duì)檢測(cè)有PCV2感染的豬進(jìn)行淘汰;對(duì)病死豬進(jìn)行深埋或焚燒處理;對(duì)污染的圈舍和四周環(huán)境用2%的燒堿液進(jìn)行嚴(yán)格消毒。針對(duì)該規(guī)?;i場(chǎng)出現(xiàn)PCV2的感染嚴(yán)重并出現(xiàn)仔豬死亡現(xiàn)象,該規(guī)?;i場(chǎng)健康豬應(yīng)緊急接種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗。待疫情穩(wěn)定1個(gè)月后,對(duì)豬場(chǎng)內(nèi)所有豬進(jìn)行豬瘟和豬藍(lán)耳病的常規(guī)免疫。
2016-09-08)
貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目資助(黔科合J字[2013]2110號(hào));貴州省2014年農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目資助(黔科合NY字[2014]3055號(hào))
胡玲玲(1993-),女,碩士研究生,主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)的科研學(xué)習(xí)
*通訊作者:湯德元(1964-),男,教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E-mail:tdyuan@163.com