牛巧麗，孫玉亮，努爾比亞木·麥麥提依明，趙 今

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院牙體牙髓科 新疆 烏魯木齊 830054）

HMME—PDT聯(lián)合氟制劑預防齲病的動物實驗研究

牛巧麗，孫玉亮，努爾比亞木·麥麥提依明，趙 今

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院牙體牙髓科 新疆 烏魯木齊 830054）

目的：在構(gòu)建齲病動物模型基礎(chǔ)上觀察HMME-PDT聯(lián)合氟制劑預防齲病的效果。方法：選取斷奶21d SPF-Wista大鼠80只，種植變形鏈球菌構(gòu)建致齲模型后分為蒸餾水、HMME-PDT、氟化鈉、以及HMME-PDT+氟化鈉組4組，連續(xù)8周給大鼠進行口腔處理，采集大鼠唾液培養(yǎng)，記錄變形鏈球菌水平及觀察實驗組大鼠口內(nèi)變形鏈球菌生長繁殖的影響并評估Keyes記分抑制齲損形成的效果。結(jié)果：與蒸餾水組相比，其余各組變形鏈球菌水平和齲齒Keyes記分均有不同程度的降低,其中HMME-PDT顯示對窩溝面齲和光滑面齲有較好的防治效果（P＜0.05)，但均低于氟化鈉組；HMME-PDT +氟化鈉組未見明顯的協(xié)同抑齲作用。結(jié)論：HMME-PDT能有效抑制口腔變鏈菌繁殖，降低齲齒的發(fā)生率。

齲??；HMME-PDT；動物模型；變形鏈球菌；氟制劑

齲病是在以細菌為主的多因素作用下牙體的慢性感染性疾病，其發(fā)病率高，在眾多口腔疾病中屈居首位，危害廣泛，嚴重影響人們的生活質(zhì)量，以此尋找到根源進行有效地預防就顯得尤為重要。光動力療法(photodynamic therapy,PDT)是利用特定波長的光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生光化學效應，抑制致病細菌，從而起到預防疾病的一種新型療法。它操作簡便，可有效治療細菌性疾病而不引起菌群的紊亂等優(yōu)勢備受國內(nèi)外學者廣泛的關(guān)注。本研究在構(gòu)建致齲動物模型的基礎(chǔ)上初步探討HMME介導的光動力療法對口腔內(nèi)主要致齲菌變形鏈球菌的殺傷效果，以及其對齲病發(fā)生發(fā)展過程的影響。

1　材料和方法

1.1主要儀器和試劑：電熱恒溫培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)箱、歐式圓形壓力蒸汽滅菌器、凈化工作臺、電子天平、振蕩器、光學顯微鏡、解剖顯微鏡；超薄型磨片、氨芐西林膠囊、頭孢拉定膠囊、皮羅卡品；紫脲酸銨指示劑、氟化鈉，半導體激光，40mg/L的HMME光敏劑。

1.2動物和飼料:SPF-SD大鼠80只；致齲飼料2 000#組成成分[1]。

1.3致齲菌選擇:變形鏈球菌(Streptococci mutans25175)國際標準株、牛心腦浸液瓊脂(BHI瓊脂)，輕唾瓊脂培養(yǎng)基(MS瓊脂)、桿菌肽、無菌脫纖維蛋白羊血。

1.4實驗分組:HMME-PDT組，HMME-PDT+NAF為實驗組；蒸餾水組為陰性對照組，NAF組陽性對照組。

1.5實驗方法:選取出生后21d 斷奶SPF-Wista大鼠80只，雄性，稱重，喂以致齲飼料2 000#和5%蔗糖水溶液，連續(xù)3d在1 000g飼料加氨芐西林1g，1 000g 5%蔗糖水溶液加頭孢拉定1g來抑制大鼠口內(nèi)內(nèi)源性變形鏈球菌，鼠齡24d時無菌下采集大鼠唾液培養(yǎng)檢測抑菌情況。連續(xù)4d于大鼠口腔內(nèi)接種變形鏈球菌（1ml/只)，在26～28d隨機抽取10只大鼠，標定，乙醚吸入麻醉下，采集唾液（100μl/只），稀釋涂平板，37℃厭氧培養(yǎng)，檢測細菌是否定植，并記錄菌落形成單位，觀察細菌生長情況。29d為洗脫期，對大鼠隨機分組，編號記錄體重。30d選擇波長532nm、功率34mw的半導體激光和40mg／L的HMME光敏劑，將80只大鼠隨機分為4組：照射時間90s的PDT組、PDT+NAF組、0.2%NAF陽性對照組、0.9%生理鹽水陰性對照組，每組20只大鼠。鼠齡30d按照實驗分組進行干預，實驗組局麻下，固定大鼠口腔牙齒涂布光敏劑孵育5min，照射后用消毒棉拭子在牙齒頜面上由同一實驗者按照順時針方向擦拭牙面一圈。將棉拭子按不同組別放入到5ml的離心管里，3 000r／min，震蕩2min，然后連續(xù)稀釋，取懸浮液涂布在TSA培養(yǎng)平板上37℃，恒溫厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。按以上方法處理大鼠1次/W，檢測結(jié)果，連續(xù)8w（該操作均有同一人進行操作）。鼠齡86d時，實驗分兩步采集樣本：①每組選取5只大鼠4%多聚甲醛液心臟灌注內(nèi)固定處死，取雙側(cè)下頜骨（連同建模牙及其牙周組織），甲醛固定，甲酸脫鈣，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制成通過頰舌向5um厚的組織切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠牙周組織的病理變化；②處死剩余各組大鼠、斷顱，將其頭顱置于高壓蒸汽鍋中，0.1kPa處理5min，去除軟組織，分離上下頜骨，用清水清洗干凈，室溫干燥保存。將干燥的頜骨置于0.4%紫脲酸銨染色液中浸泡12h，取出后用清水沖洗干凈，室溫干燥，棕色瓶保存。以實驗分組為單位拔除大鼠各個牙齒，制作磨片，在光學顯微鏡下，根據(jù)Keyes經(jīng)典評分方法評估大鼠磨牙患齲情況。

1.6統(tǒng)計處理:實驗數(shù)據(jù)采用SPSS15.0 統(tǒng)計軟件包進行單因素方差分析，比較計算各組數(shù)據(jù)F值，再進行多組樣本均數(shù)兩兩比較的SNK、Dunnett檢驗和LSD檢驗（檢驗水準a=0.05）。

2　結(jié)果

2.1大鼠的一般狀況和牙周組織情況：從實驗中1～62d大鼠的食物、水消耗量進行記錄，各組大鼠間未見明顯差異。大鼠的一般狀況良好，各組大鼠的體重均勻增加且無顯著差異（P＞0.05)（表1）；肉眼觀察大鼠口腔黏膜無潰瘍、糜爛，牙齦顏色、形態(tài)和質(zhì)地均正常，組織切片顯微鏡下觀察牙齦上皮和結(jié)締組織均無病理性改變，牙槽骨無破壞，說明HMME-PDT經(jīng)口腔局部應用在實驗周期內(nèi)的安全性。實驗結(jié)束后蒸餾水組大鼠不同牙面齲壞標本示意圖（圖1、2）。

表1　整個實驗過程中不同組大鼠體重隨時間的變化情況 （n=20,g）

2.2變形鏈球菌水平：與蒸餾水組相比，其余各組變形鏈球菌水平值與比均有不同程度的降低，只有氟化鈉組有統(tǒng)計學差異（P＜0.05)（表2）。

表2　不同組實驗結(jié)束時大鼠唾液中變形鏈球菌水平 (n=20,CFU／ml)

2.3大鼠磨牙齲損的Keyes評分：Keyes評分[1]是一種齲齒評分系統(tǒng)，始創(chuàng)建于1958，常應用于大鼠的致齲動物模型中，能有效，客觀的評估齲損信息，其科學性已被廣泛認可。它是單個牙面齲損范圍和以四種方式記錄探診深度來評估大鼠的齲損（累及釉質(zhì)E、牙本質(zhì)淺層DS、牙本質(zhì)中層DM、牙本質(zhì)深層DX），其中E級記分反映齲損累及廣度，DS、DM、DX級記分反映齲損累及的牙本質(zhì)深度，兩者共同反映了齲損的嚴重程度。

2.3.1光滑面齲Keyes記分：與蒸餾水組相比，①在E級記分中其余各組記分均有降低，且有明顯的統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，顯示出對預防大鼠釉質(zhì)齲發(fā)生有較好的防治作用；②在Ds記分中，只有HMME-PDT+氟化鈉組檢出，剩余組均未檢出。HMME-PDT+氟化鈉組的齲齒記分與蒸餾水組相比有所降低，但并無統(tǒng)計學差異（P＞0.05)，顯示HMMEPDT和氟化鈉兩者均有良好的預防深度齲損的效果，但兩者聯(lián)合應用時協(xié)同作用不明顯（表3）。

表3　不同組實驗結(jié)束大鼠磨牙標本中光滑面齲Keyes記分 (n=20)

2.3.2窩溝齲Keyes記分：與蒸餾水組相比，①在E級記分中，其余各組齲記分均有明顯降低，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；②在Ds、Dm級齲齒記分中，其余各組的齲記分與蒸餾水組相比有明顯減輕，且統(tǒng)計學差異顯著（P＜0.05)；③在Dx級齲齒記分中，HMME-PDT+氟化鈉組的齲記分與蒸餾水組比較有所降低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05)，氟化鈉組和HMME-PDT組均未檢出（表4）。

表4　不同組實驗結(jié)束大鼠磨牙標本中窩溝面齲Keyes記分 (n=20)

2.4實驗結(jié)束后蒸餾水組大鼠不同牙面齲壞標本示意圖：見圖1、2。

圖1　蒸餾水組大鼠磨牙標本（窩溝齲）

圖2　蒸餾水組大鼠磨牙標本（光滑面齲）

3　討論

齲病是一種內(nèi)源性的感染性疾病，是口腔的常見病和多發(fā)病，世界衛(wèi)生組織已將其與腫瘤和心血管疾病并列為人類三大重點防治疾病?，F(xiàn)有防齲方法均存在一定的局限性，例如洗必泰的存在耐藥性和過敏性、氟化物的長期使用產(chǎn)生慢性毒副性作用以及免疫防齲方法的不確定性，迄今尚無簡便可重復、效果明確、毒副作用輕微、易廣泛接受的防齲措施。因此，尋找安全、有效、經(jīng)濟的防齲方法迫在眉睫。

光動力療法(photodynamic therapy,PDT）是近年來發(fā)展起來的有較好應用前景的一種新型臨床治療方法。它是激光技術(shù)、光纖技術(shù)、光信息處理技術(shù)、生物光化學技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)等有機結(jié)合，利用一定波長的激光照射，使光敏劑受到激發(fā)，產(chǎn)生細胞毒素，導致細胞的死亡和組織破壞，達到治愈疾病的目的。由于其獨特的光學性能，在口腔領(lǐng)域受到人們越來越多的關(guān)注[2-4]。所有致齲菌都是正常狀態(tài)下存在的口腔常駐菌群，變形鏈球菌和乳酸桿菌具有較強的產(chǎn)酸和耐酸能力，是公認的致齲菌[5]，故將該菌作為本實驗的致齲菌。2010年國外學者在體外實驗的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)PDT對伴放線桿菌[6]、口腔生物膜致齲變形鏈球菌[7]和糞腸球菌[8]等多種細菌有明顯的殺傷作用，這就需要我們用致齲動物模型模擬口腔內(nèi)環(huán)境來進一步證實。還有研究表明光敏劑分子帶有正電荷，能迅速與細菌細胞結(jié)合并穿透胞膜進入細胞內(nèi)部，其與細菌細胞的結(jié)合能力遠強于與哺乳動物體內(nèi)細胞的結(jié)合能力，因此PDT表現(xiàn)出對組織表面或組織內(nèi)細菌的選擇性殺滅作用，而對正常組織細胞影響較小，可以重復進行多次治療[9-10]。國外研究也證實PDT對致齲菌具有直接的殺滅作用，對正常組織無明顯毒副作用而且不會產(chǎn)生細菌耐藥性[10]。本實驗中對于大鼠的一般情況觀察和大鼠口腔黏膜無潰瘍、糜爛，牙齦顏色、形態(tài)和質(zhì)地均正常，組織切片顯微鏡下觀察牙齦上皮和結(jié)締組織均無病理性改變，牙槽骨無破壞，也應證這一點。有學者們推斷光動力療法適合用于齲病的防治，臨床上可使用注射器等工具將光敏劑涂布于齲損部位，再進行光投照 ，來達到殺滅致齲微生物的目的[12]。此外，王冬青[11]等發(fā)現(xiàn)PDT不但在齲病預防和阻止齲病發(fā)展進程領(lǐng)域有較好的應用前景,而且能有效清除牙周病及種植體周圍疾病的病原菌，達到牙周的治療目的。

理想的光敏劑具有以下優(yōu)點：靶向性強，選擇性高，光毒性強、吸收光的波長長，在體內(nèi)快速消除，局部使用安全等特性。血啉單甲醚(HMME)是我國自主研發(fā)的一種新型光敏劑，其純度高(98%)、單態(tài)氧量子產(chǎn)率高、避光期短及組織選擇性好。HMME有多個特征吸收峰，其吸收峰(nm)：397(soret)、498、532、620等，實驗選擇了其特征吸收峰所處的53的半導體激光作為光源，因其具有體積小、激光輸出穩(wěn)定、壽命長、出光快、價格適中等優(yōu)勢，被廣泛應用于臨床治療中[13],實驗中我們以HMME為光敏劑，輸出功率為34mW，功率密度為0.14W／cm2，波長為532am的半導體激光器照射，結(jié)果顯示PDT對口腔內(nèi)致齲細菌有很強的殺菌效果，顯著高于對照組。還有金花[14]等學者研究發(fā)現(xiàn)HMME與細菌作用后，G+菌比G-菌更易于被HMME光動力殺滅，膜損傷是HMME致細菌光動力失活的主要機制，HMME選擇性地滯留于細菌細胞壁和細胞膜上，激光照射時產(chǎn)生單態(tài)氧和其它活性氧直接損傷細菌細胞壁及膜系統(tǒng)，導致細菌死亡。李敏[15]等發(fā)現(xiàn)研究40ng／L HMME-PDT組的大鼠磨牙面上的細菌數(shù)最少，明顯低于10ng／L、20ng／L HMMEPDT組，40ng／L HMME-PDT組表現(xiàn)出來的殺菌效果更為明顯，原因可能是因為光敏劑濃度大時，細菌能夠迅速地攝取光敏劑，在相同的光強度下，被激發(fā)的光敏劑產(chǎn)生的單態(tài)氧多，殺死的細菌數(shù)越多。

與傳統(tǒng)的防齲治療方法相比，HMME-PDT療法存在下列優(yōu)勢：①防齲操作可復制且簡單方便；②選擇性的殺滅口腔致齲細菌，局部使用安全性高；③口腔內(nèi)長時間使用不產(chǎn)生耐藥性，不會引起菌群紊亂，靈敏度高；國內(nèi)多數(shù)研究也有應證。但它也存在著潛在的不足，我們應嚴格掌握光敏劑的使用劑量、光照強度、時間等因素，控制產(chǎn)生的活性氧分子數(shù)量，才能更好的應用于臨床治療中。

綜上所述，從目前研究發(fā)現(xiàn)使用HMME-PDT不但達到了預防齲病的效果，而且其可以有效作用于致齲微生物而不產(chǎn)生耐藥性，局部使用安全不傷及正常牙周黏膜，在預防齲病方面顯露出獨特的優(yōu)勢。在不遠的將來，血卟啉單甲醚介導光動力療法將會成為齲病的預防的另一種新途徑。

[1]Keyes PH,Jordan HV.Periodontal lesions in the Syrian hamster-III finding related to an infections and transmissible component[J].Ach Oral Biol,1964,9∶377-400.

[2]Soukos NS,Goodson JM,Photodynamic therapy in the control of oral biofilms[J],Periodontol 2000,2011,55(1)∶143-166.

[3]Takasaki AA,Aoki A,Mizutani K,et a1.Appilcaiton of antimicrobial photodynamic therapy in periodontal and peri-implant diseases[J].Pe riodontol2000,2009,51(1)∶109-140.

[4]Cieplik F,Tabenski L,BuchaUa W,et a1.Antimicrobial photodynamic therapy for inactivation of biofilms formed byoral key pathogens[J]. Front Microbiol,2014,5∶405.

[5]葉一了,賈玉煥,黃文明,等.主要致齲微生物的Mela分析[J].中國組織工程研究,2015,79(34)∶5559-5565.

[6]Goulart RD,Bolean M,Paulino TD.et a1.Photodynamic Therapy in Planktonic and Biofilm Cuhures of Aggregatibaeter actinomycetemcomitans[J].Photomed Laser Surg,2010,28(Suppl1) ∶53-60.

[7]Zou ZH,Gao P,Yin HJ,et a1.Investigation of photodynamic therapy on streptococcus mutans of oral biofilm[J].Chin Opt Lett,2008,6(12)∶947-949.

[8]Fonseca MB,Tessare PO,Pallota RC.et a1.Photodynamic therapy for root canals infected with Enterococcus faeealis[J].Photomed Laser Surg,2008,26(3)∶209-213.

[9]Maisch T,Bosl C,Szeimies RM,et a1.Photodynamic effects of novel XF porphyrin derivatives on prokaryotic and eukaryotic cells [J]. Antimicrob Agents Chemother,2005,49 (4)∶1 542-1552.

[10]Liu PF,Zhu WH,Huang CM.Vaccines and photodynamic therapiesf or oral microbial-related diseases [J].Curr Drug Metab,2009,10(1)∶90-94.

[11]王冬青,王新林,孫正.牙周疾病的抗微生物光動力療法術(shù)[J].中華老年口腔醫(yī)學志,2015,13(4)∶244-248.

[12]吳維悅,侯本祥.不同光敏劑介導的光動力療法對變形鏈球菌殺傷作用的研究進展[J].北京口腔醫(yī)學2014,22(6)∶353-355.

[13]楊智,熊英,王雪,等.血卟啉單甲醚光動力治療[J].皮膚病與性病,2014,36(2)∶74-75.

[14]金花,趙宏霞,任雅清,等. 原子力顯微鏡觀測血卟啉單甲醚對細菌光動力殺傷作用[J].微生物學報2008,48(10)∶1378-1382.

[15]李敏,鄒朝暉,張蕾,等. 血卟啉單甲醚光動力療法對致齲變形鏈球菌及齲損表面形態(tài)的影響[J].天津醫(yī)藥,2011,39(4)∶364-366.

編輯/張惠娟

Animal experimental study of HMME - PDT combined with fluoride to prevent dental caries

NIU Qiao-li,SUN Yu-liang,Nuerbiyamu·maimaitiyiming,ZHAO Jin
(Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,Xinjiang,China)

Objective To observe the effect of hmme-pdt combined with fluoride to prevent dental caries in animal model, Based on the construction of dental caries. Methods Select 21d weaning SPF-Wista rats 80, the planting of Streptococcus mutans to construct cariogenic model is divided into distilled water, hmme-pdt, sodium fluoride, and hmme-pdt+sodium fluoride group 4 groups, continuous 8W to rats by oral treatment collected rat saliva culture, record deformation levels of Streptococcus and observe the experimental group rats in the mouth of the deformation of the streptococcal growth effects on the reproductive and assessment scores of Keyes inhibitory effect on the formation of dental caries. Results Compared with the distilled water group and other groups deformation streptococci levels and dental caries Keyes scores showed different degrees of reduced the hmme-pdt display of pit and fissure caries and smooth surface caries has better control effect (P＜0.05), but lower than that of the sodium fluoride group; hmme-pdt + sodium fluoride group has no obvious synergistic inhibitory effect on caries. Conclusion HMME-PDT can effectively inhibit oral Streptococcus mutans reproduction and reduction in the caries incidence. Key words: caries; HMME-PDT; animal model; Streptococcus mutans; fluoride

R781

A

1008-6455（2016）10-0002-04

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)科研項目資助（自然科學基金青年項目）(2013ZRQN31)

趙今,女,口腔醫(yī)學博士,主任醫(yī)師,教授,研究方向:牙體牙髓病病因及防治；E-mail：nql200702@sina.com

2016-05-25

2016-09-19