黃昂 閆偉偉 張紀(jì)元 王福生 鄒正升

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·論 著·

慢性乙型肝炎患者CD14highCD16+單核細(xì)胞表達(dá)特點(diǎn)研究

黃昂 閆偉偉 張紀(jì)元 王福生 鄒正升

目的 探討慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率、功能特點(diǎn)以及與疾病進(jìn)程之間的關(guān)系。方法 利用熒光抗體標(biāo)記結(jié)合多色流式技術(shù)，檢測(cè)CHB患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率及表面TLR2分子的表達(dá)，用LPS刺激及細(xì)胞內(nèi)染色方法檢測(cè)CHB患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。結(jié)果 CHB患者外周血的CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率明顯高于健康對(duì)照；CHB患者CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率與ALT呈負(fù)相關(guān)(R=0.739,P<0.01)，與HBV DNA載量成正相關(guān)(R=-0.283,P=0.008)；CHB患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞上TLR2的表達(dá)高于其他兩個(gè)亞群；免疫活化CHB患者外周血在LPS刺激后，CD14highCD16+單核細(xì)胞亞群分泌IL-6的能力均高于CD14highCD16-和CD14lowCD16+單核細(xì)胞亞群。結(jié)論 CD14highCD16+單核細(xì)胞可能在清除肝炎病毒及肝臟免疫損傷中起重要作用。

慢性乙型肝炎；CD16；Toll樣受體2；單核細(xì)胞

HBV感染慢性化機(jī)制復(fù)雜，特異性T細(xì)胞損傷是HBV持續(xù)性感染的重要特征。越來(lái)越多的證據(jù)表明，固有免疫在病毒持續(xù)性感染過(guò)程中同樣扮演重要角色。HBV慢性感染時(shí)，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能均存在障礙[1]。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在炎癥情況下，是由循環(huán)血液中的單核細(xì)胞發(fā)育而來(lái)。成熟單核細(xì)胞均表達(dá)CD14分子，源于骨髓中的髓系干細(xì)胞，根據(jù)表面分子CD16的表達(dá)情況，可分為兩大亞群，即經(jīng)典單核細(xì)胞(CD16-)和非經(jīng)典的單核細(xì)胞(CD16+)[2]。既往認(rèn)為CD16+單核細(xì)胞是單一型亞群，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CD14+CD16+單核細(xì)胞是一群異質(zhì)性的細(xì)胞，根據(jù)CD14表達(dá)的高低，又可繼續(xù)分為表型和功能均不同的兩個(gè)亞群，即CD14highCD16+(又稱CD14++CD16+)和CD14lowCD16+(又稱CD14dimCD16+)單核細(xì)胞[3]。其中CD14highCD16+單核細(xì)胞，表達(dá)更高水平的CD163與HLA-DR[4-5]，目前認(rèn)為可能與疾病進(jìn)程密切相關(guān)。本研究采用多色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞的表達(dá)，以探討慢性HBV感染中CD14highCD16+單核細(xì)胞的表達(dá)特點(diǎn)及臨床相關(guān)性。

資料和方法

一、病例選擇

解放軍第三〇二醫(yī)院收治的臨床確診慢性乙型肝炎(CHB)患者86例，男61例，女25例，年齡18～55歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》。入組前6個(gè)月內(nèi)未經(jīng)任何抗病毒及免疫抑制劑治療，入院前1個(gè)月內(nèi)未行保肝降酶治療，排除合并細(xì)菌感染、其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病或其他重大疾病等。健康對(duì)照18例，均為健康獻(xiàn)血者。進(jìn)一步將CHB患者分為免疫耐受期22例(HBV DNA>107IU/mL，ALT/AST正常)和免疫清除期64例(HBV DNA 陽(yáng)性，但一般低于免疫耐受期，ALT/AST持續(xù)或間歇升高，肝組織學(xué)有壞死炎癥等表現(xiàn))。

二、主要試劑與儀器

熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體CD14-APC、CD16-FITC、TLR2-PE、IL-6-PE及相應(yīng)同型對(duì)照和BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。流式洗滌液為含0.5%BSA、0.1%NaN3的PBS。肝功能由日本Olympus生化分析儀檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)血清中的HBV DNA，均由解放軍第三○二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心完成。

三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)

新鮮肝素抗凝全血100 μL加入熒光單抗20 μL，并設(shè)置同型對(duì)照，混勻；室溫避光孵育30 min；加紅細(xì)胞裂解液，震蕩后置之于離心機(jī)中，離心半徑10 cm，1 500 r/min，離心5 min，棄上清液，加入2 mL PBS洗滌一次；1%多聚甲醛200 μL重懸固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

四、全血刺激及細(xì)胞內(nèi)因子染色

取新鮮肝素鈉抗凝血300 μL，加680 μL含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，再加5 ng/μL LPS 20 μL，震蕩混勻。封口并扎孔，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1 h后分別加蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Monensin阻斷，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)5 h后取出。PBS洗滌重懸后，加CD14-APC、CD16-FITC各10 μL，震蕩后避光20 min。加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，震蕩，室溫避光3 min。PBS洗滌后1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入300 μL破膜劑，室溫避光放置20 min，然后加1 mL破膜洗液，震蕩后1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入IL-6-PE 10 μL，震蕩后避光20 min。加1 mL破膜洗液，震蕩后1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入1%多聚甲醛200 μL固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、外周血中CD14highCD16+單核細(xì)胞數(shù)量及頻率

免疫清除期患者的外周血單核細(xì)胞絕對(duì)值為(0.55±0.17)×109/L，高于免疫耐受期患者(0.43±0.11)×109/L和健康對(duì)照(0.45±0.14)×109/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而免疫耐受期患者與健康對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。全血經(jīng)多色熒光抗體染色后，由流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)紅細(xì)胞裂解后外周血細(xì)胞群體分布清晰，通過(guò)光散射性質(zhì)設(shè)定單核細(xì)胞區(qū)(以橢圓圈定，圖1A)；單核細(xì)胞通過(guò)CD14和CD16分子表達(dá)強(qiáng)度分為CD14highCD16-、CD14highCD16+與CD14lowCD16+三個(gè)亞群(圖1B)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，免疫清除期患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞(9.23±4.39)%明顯高于健康對(duì)照組(4.79±1.56)%和免疫耐受患者(4.50±1.64)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而健康對(duì)照組與免疫耐受患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、CHB患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞與血清生化學(xué)、病毒學(xué)之間的關(guān)系

在CHB患者中，外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率(以CD14highCD16+單核細(xì)胞占總單核細(xì)胞百分比表示)與血清ALT水平均成正相關(guān)(R=0.739,P<0.01)(圖2A)。CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率與CHB患者血清HBV DNA取對(duì)數(shù)后成負(fù)相關(guān)(R=-0.283,P=0.008)(圖2B)。ALT和病毒載量均是CHB患者重要的臨床指標(biāo)，CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率與這些臨床指標(biāo)都有著較好的相關(guān)性，說(shuō)明CD14highCD16+單核細(xì)胞與CHB患者的疾病進(jìn)程密切相關(guān)。

注：A. 外周血單核細(xì)胞圈門策略；B. 健康對(duì)照組、免疫耐受患者和免疫清除患者的單核細(xì)胞各亞群頻率典型圖

圖2 CHB患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞胞頻率與ALT水平和HBV DNA載量之間的相關(guān)性

三、免疫清除患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞表面TLR2分子的表達(dá)

通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)免疫清除患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞TLR2的表達(dá)，以平均熒光強(qiáng)度表示外周血單核細(xì)胞各亞群表面TLR2分子的表達(dá)強(qiáng)度。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫清除患者外周血CD14highCD16-、CD14highCD16+和CD14lowCD16+單核細(xì)胞TLR2的平均熒光強(qiáng)度分別為25.93±12.01、33.12±15.04和23.60±9.62。CD14highCD16+單核細(xì)胞亞群TLR2的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于其余兩個(gè)亞群(均P<0.01)。

四、免疫清除患者外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞分泌IL-6的特點(diǎn)

進(jìn)一步采用細(xì)胞內(nèi)因子染色方法，觀察15例ALT明顯升高(ALT>100 U/L)的免疫清除患者用LPS刺激后單核細(xì)胞各亞群分泌細(xì)胞因子功能的差異。免疫清除患者的CD14highCD16-、CD14highCD16+和CD14lowCD16+單核細(xì)胞亞群IL-6的平均熒光強(qiáng)度分別為200.28±126.55、230.39±134.48和94.30±63.77。CD14highCD16+單核細(xì)胞亞群分泌IL-6能力明顯高于CD14highCD16-亞群(P<0.05)和CD14lowCD16+單核細(xì)胞亞群(P<0.01)。

討 論

機(jī)體對(duì)HBV感染后的免疫應(yīng)答包括固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。固有免疫是抗感染的第一道防線，參與固有免疫的細(xì)胞有多種。單核細(xì)胞是重要的固有免疫細(xì)胞，通過(guò)分泌數(shù)量眾多的細(xì)胞因子，以主動(dòng)和協(xié)同作用的方式招募炎性細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)MHCⅡ分子給T細(xì)胞提呈抗原，引起后者的活化和增殖。單核細(xì)胞是一群異質(zhì)性的細(xì)胞，主要由三部分組成，即CD14highCD16-、 CD14highCD16+和CD14lowCD16+，其中CD14highCD16+單核細(xì)胞可能與結(jié)核、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的進(jìn)程有關(guān)[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者，特別是免疫清除患者，外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞的頻率及絕對(duì)值均顯著升高，提示CD14highCD16+單核細(xì)胞與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

對(duì)CHB患者外周血中的CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率與患者的血清ALT和HBV DNA水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞頻率與ALT呈正相關(guān)，而與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)。這提示CD14highCD16+單核細(xì)胞的升高可能有利于限制HBV復(fù)制，與HCV中的結(jié)果相一致[3]，但不同于HIV中的結(jié)果[4]。而CD14highCD16+單核細(xì)胞與ALT呈正相關(guān)，提示其有可能在促進(jìn)肝臟炎性反應(yīng)中發(fā)揮著一定的作用。

固有免疫的觸發(fā)以感知外來(lái)病原的存在為前提。病原體顯示的抗原統(tǒng)稱為病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)。PAMP由參與固有免疫的模式識(shí)別受體(pattern recognizingreceptor, PRR)所識(shí)別，PRR中的Toll樣受體是目前研究的熱點(diǎn)，而單核細(xì)胞主要表達(dá)TLR2，TLR2的識(shí)別譜廣、生物學(xué)作用廣泛，主要包括抵抗感染，引發(fā)炎性反應(yīng)和促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的成熟，啟動(dòng)固有性免疫應(yīng)答，并在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要的調(diào)節(jié)作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫清除患者中，相對(duì)于其他亞群，CD14highCD16+單核細(xì)胞亞群高表達(dá)TLR2。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用LPS刺激CHB患者的外周血后，CD14highCD16+單核細(xì)胞亞群IL-6的表達(dá)水平明顯高于CD14highCD16-亞群和CD14lowCD16+單核細(xì)胞亞群。既往研究已經(jīng)證實(shí)[9]，HBV核衣殼的核心抗原成分通過(guò)其富含精氨酸的片段與人巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜上的硫酸乙酰肝素成分結(jié)合后，可以激活TLR2信號(hào)通路，使NF-kappaB活化，導(dǎo)致IL-6等的分泌。因而在CHB時(shí)，外周血CD14highCD16+單核細(xì)胞TLR2表達(dá)上調(diào)，可能是CD14highCD16+單核細(xì)胞分泌高水平的IL-6的機(jī)制。Bezemer等[10]的研究也證實(shí)，IL-6可以上調(diào)單核細(xì)胞TLR2的表達(dá)。IL-6既是免疫調(diào)節(jié)因子又是炎介質(zhì)，能促進(jìn)肝臟合成急性期蛋白，激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化，在清除肝炎病毒及免疫損傷中起重要作用。以上結(jié)果提示，通過(guò)TLR2和IL-6之間表達(dá)的相互促進(jìn)效應(yīng)，CD14highCD16+單核細(xì)胞可能在CHB的發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。

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(本文編輯：錢燕)

Characterization and significance of CD14highCD16+monocytes in chronic hepatitis B patients

HUANGAng,YANWei-wei,ZHANGJi-yuan,WANGFu-sheng,ZOUZheng-sheng.

CenterofNon-infectiousLiverDiseases,PLA302Hospital,Beijing100039,ChinaCorrespondingauthor:ZOUZheng-sheng,Email:zszou302@163.com

Objective To investigate the expression characteristics of CD14highCD16+monocytes and its relationship with disease progression in patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection. Methods Immunofluorescent staining and flow cytometry assay were used to measure the frequency of CD14highCD16+monocytes and its expression of toll-like receptor 2 (TLR2) from CHB patients. Interleukin-6 (IL-6) production in CD14highCD16+monocytes stimulated with lipopolysaccharide (LPS) was also measured in CHB group. Results Frequency of CD14highCD16+monocytes in peripheral blood of CHB patients was significantly higher than those in health controls and CHB patients in immune tolerant phase. Proportions of circulating CD14highCD16+monocytes were positively correlated with serum alanine transaminase levels (R=0.739,P<0.01), while negatively correlated with HBV DNA loads (R=-0.283,P=0.008). CD14highCD16+monocytes showed increased expression of TLR2 compared with other subpopulations. After LPS stimulation, CD14highCD16+monocytes produced significantly more IL-6 than that in CD14highCD16-and CD14lowCD16+monocytes. Conclusion CD14highCD16+monocytes might play an important role in the pathogenesis of HBV-induced liver injury.

Chronic hepatitis B; CD16; TLR2; Monocytes

軍隊(duì)醫(yī)學(xué)科技青年培育計(jì)劃(15QNP084)

100039 北京 解放軍第三○二醫(yī)院非感染性肝病診療與研究中心(黃昂，閆偉偉，鄒正升)，感染性疾病診療與研究中心(張紀(jì)元，王福生)

鄒正升，Email：zszou302@163.com

2016-06-29)