吳 瓊，劉錦銘

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血清miR-221表達(dá)水平對老年哮喘的診斷價值

吳 瓊，劉錦銘

目的 檢測老年哮喘患者的血清miR-221表達(dá)水平，并評價血清miR-221對老年哮喘的診斷價值。方法 選取我院109位老年哮喘患者(實驗組)和115位健康老年人(對照組)。采用RT-PCR檢測2組老年人血清miR-221表達(dá)水平，并對結(jié)果進(jìn)行ROC曲線繪制。Elisa法測定2組老年人血清白細(xì)胞介素(IL)-4和IL-12濃度，同時對2組老年人進(jìn)行肺功能檢測。最后應(yīng)用Spearman相關(guān)分析計算血清miR-221表達(dá)水平與血清細(xì)胞因子濃度和肺功能參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果 與對照組比較，實驗組患者血清miR-221表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ROC曲線繪制結(jié)果顯示，血清miR-221的診斷閾值為1.37。實驗組和對照組患者的血清IL-4濃度、血清IL-12濃度、FVC值、FEV1值和PEF值差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。用Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-221表達(dá)水平與血清IL-4濃度、血清IL-12濃度、FVC值、FEV1值和PEF值均存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 血清miR-221的表達(dá)水平可以作為老年哮喘病情判斷指標(biāo)，同時也為老年哮喘的臨床治療開辟了新思路。

老年哮喘；miR-221；白細(xì)胞介素-4；白細(xì)胞介素-12；肺功能；診斷

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一類老年人群體常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)、黏液分泌增多和氣道阻塞等癥狀[1-2]。近年來哮喘的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)逐年增加的趨勢[3]，因此，及時對哮喘做出正確診斷對改善老年患者的預(yù)后十分重要。雖然哮喘發(fā)病的根本原因目前尚不完全明晰，但大量的研究[4]均已表明，microRNA(miR)在哮喘發(fā)病中起到了十分重要的作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-145、miR-221等均與哮喘的發(fā)病進(jìn)程密切相關(guān)[5]。miR-221不僅在老年哮喘患者血清中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，同時哮喘小鼠模型也驗證了miR-221能夠促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-4的分泌[6]。因此，筆者推測血清miR-221是一種合適的老年哮喘診斷標(biāo)志物。相較于其他老年哮喘診斷方法，血清診斷具有簡便快捷、費用低廉的優(yōu)勢。本研究著重檢測老年哮喘患者血清miR-221的表達(dá)水平，并通過繪制ROC曲線獲得診斷閾值，最后應(yīng)用Spearman相關(guān)分析計算血清miR-221的表達(dá)水平及其與血清細(xì)胞因子濃度和肺功能參數(shù)的相關(guān)性，從而綜合評價血清miR-221的表達(dá)水平對老年哮喘的診斷應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實驗組共選取2013年8月至2015年12月在我院就診的老年哮喘患者109例，其中男性50例，女性59例，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會全國哮喘學(xué)術(shù)會議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊吣挲g60～77歲，平均(68.9±5.0)歲。對照組隨機(jī)選取在本院呼吸科門診體檢的115例無家族疾病史的健康老年人，其中男性54例，女性61例，年齡60～78歲，平均(69.2±4.9)歲。2組患者在年齡、性別、民族和居住地等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，2組老年本人或其子女簽署書面知情同意書。

1.2 血清采集 2組老年人分別于清晨空腹采集2 ml外周靜脈血于干燥試管內(nèi)，室溫100×g離心10 min后收集上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清miR-221表達(dá)水平檢測 2組老年人均取1 ml血清，應(yīng)用TRIZOL試劑盒(購自美國Invitrogen公司)提取血清總RNA。應(yīng)用TaqMan?MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國Fermentas公司)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用TaqMan?Gene Expression Assay試劑盒(購自美國Fermentas公司)對miR-221和內(nèi)參U6進(jìn)行實時定量PCR(RT-PCR) 擴(kuò)增。設(shè)定擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min后，94 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。miR-221的相對表達(dá)水平采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，即ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt，而ΔCt=miR-221Ct-U6 Ct。所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

基因名引物序列miR-221正向5'-AGCUACAUUGU-CUGCUGGGUUUC-3'反向5'-GAAACCCAGCAGACAAUGUAGCU-3'U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

1.4 血清細(xì)胞因子濃度檢測 2組老年人均取1 ml血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法定量檢測血清IL- 4、IL-12濃度，ELISA試劑盒均購自深圳晶美生物制品公司，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

1.5 肺功能檢測 采用日本美能AS-500便攜式肺功能儀，由肺功能室專人負(fù)責(zé)對2組老年人進(jìn)行肺功能檢測。檢測時要求受試者站直或坐直，保持頭部自然水平，夾上鼻夾，口唇包上緊口器，松解過緊的腰帶及衣物領(lǐng)口等，檢測過程中依據(jù)檢測情況決定檢測次數(shù)，并選擇最合適的數(shù)值進(jìn)行記錄。檢測的主要參數(shù)包括用力通氣量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)和最大呼吸峰流速(peak expiratory flow，PEF)值，需要注意的是肺活量受年齡、性別、身高、體表面積等的影響，正常人群為(100±20)%，<80%為減少。所有參數(shù)均以實測值占預(yù)計值的百分比表示，以預(yù)計值百分率作為指標(biāo)來判斷。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 本實驗應(yīng)用SPSS 19.0和GraphPad統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。根據(jù)檢測結(jié)果繪制ROC曲線，根據(jù)ROC曲線下面積和診斷閾值確定相對應(yīng)的敏感性和特異性。采用Spearman相關(guān)分析計算血清miR-221表達(dá)水平與血清細(xì)胞因子濃度和肺功能檢查參數(shù)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-221表達(dá)水平檢測RT-PCR檢測2組老年人血清miR-221表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示。實驗組血清miR-221表達(dá)水平為2.04±0.32，而對照組血清miR-221表達(dá)水平為1.00±0.19，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：與對照組比較aP<0.05圖1 對照組和實驗組老年人血清miR-221表達(dá)水平比較

2.2 繪制ROC曲線 根據(jù)血清miR-221檢測結(jié)果繪制ROC曲線，其曲線下面積為0.933，診斷閾值為1.37，敏感性為94.0%，特異性為85.2%。說明血清miR-221可以用作一種潛在的檢測標(biāo)志物用于診斷老年哮喘。見圖2。

圖2 血清miR-221表達(dá)水平的ROC曲線

2.3 血清IL-4、IL-12水平檢測 實驗組血清IL-4濃度為(124.89±35.25)ng/L，而對照組血清IL-4濃度為(51.32±19.03)ng/L，老年哮喘患者血清IL-4濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。實驗組血清IL-12濃度為(36.06±10.13)ng/L，而對照組血清IL-12濃度為(62.33±12.37)ng/L，老年哮喘患者血清IL-12濃度明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

注：與對照組比較aP<0.05。A為血清IL- 4濃度比較，B為血清IL-12濃度比較圖3 對照組和實驗組老年人血清細(xì)胞因子IL- 4、IL-12濃度比較

2.4 肺功能檢測 實驗組FVC為(72.39±25.76)%，而對照組FVC為 (102.83±17.93)%。相較于健康老年人，老年哮喘患者FVC出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。實驗組FEV1為(69.23±21.73)%，而對照組FEV1為(104.38±13.72)%。相較于對照組，老年哮喘患者FEV1出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。PEF為(69.31±22.18)%，而對照組PEF為(107.97±24.21)%，實驗組患者PEF明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 對照組和實驗組老年人肺功能參數(shù)比較(%，x±s)

注：FVC為用力通氣量，F(xiàn)EV1為第1秒用力呼氣量，PEF為最大呼吸峰流速；與對照組比較aP<0.01

2.5 Spearman相關(guān)分析 采用Spearman相關(guān)分析，血清miR-221表達(dá)水平與血清IL-4濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與血清IL-12濃度、FVC值、FEV1值和PEF值均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示老年哮喘患者血清miR-221的異常表達(dá)與其血清細(xì)胞因子的異常濃度和肺功能的受損情況存在相關(guān)性。見表3。

表3 血清miR-221表達(dá)水平與血清細(xì)胞因子和肺功能檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

注：FVC為用力通氣量，F(xiàn)EV1為第1秒用力呼氣量，PEF為最大呼吸峰流速，IL- 4為白細(xì)胞介素- 4，IL-12為白細(xì)胞介素-12

3 討論

老年哮喘患者的癥狀表現(xiàn)及體征差異較大，臨床診斷時比較容易出現(xiàn)誤診和漏診。在臨床實踐中，除肺功能檢查、痰液嗜酸粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞計數(shù)以外，血清中某些生物標(biāo)記物的異常變化亦可作為診斷老年哮喘的參考依據(jù)。與蛋白質(zhì)和mRNA相比，miRNA長度較短，因此患者的血清miRNA表達(dá)水平更容易被一些常規(guī)實驗技術(shù)如RT-PCR檢測到。

作為一種非編碼小分子RNA，miRNA能夠由不同細(xì)胞表達(dá)并分泌進(jìn)入外周血循環(huán)，其在血清中的異常表達(dá)常與癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病等多種人類疾病密切相關(guān)[7]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-221在乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]等疾病中均出現(xiàn)異常表達(dá)，被認(rèn)為可以作為這些癌癥的早期診斷標(biāo)記物。肥大細(xì)胞的數(shù)量在哮喘患者的氣道中明顯增加[11]，而miR-221與氣道肥大細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[6]。本研究對血清miR-221在老年哮喘患者和健康老年人中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測比較，結(jié)果顯示老年哮喘患者的血清miR-221出現(xiàn)異常高表達(dá)，這與以前在兒童哮喘中的研究結(jié)果相一致[12]。ROC曲線繪制結(jié)果提示血清miR-221因其高敏感性和特異性，可以用作老年哮喘的診斷標(biāo)志物之一。有研究[2]表明，Th1和Th2細(xì)胞亞群的免疫反應(yīng)失衡是哮喘發(fā)病的核心因素，Th1細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)顯著下降，而Th2細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)顯著上升。Thl主要分泌IL-12等Thl型細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫；Th2主要分泌IL-4等Th2型細(xì)胞因子，參與體液免疫。本研究發(fā)現(xiàn)老年哮喘患者的血清IL-4濃度顯著高于健康老年人，而血清IL-12濃度顯著低于健康老年人，這與以前在兒童哮喘研究中的結(jié)論相一致[13]。而肺功能檢測結(jié)果顯示，相較于健康老年人，老年哮喘患者的肺功能出現(xiàn)了顯著性損傷。此外，Spearman相關(guān)分析結(jié)果也提示血清miR-221表達(dá)水平的變化能在一定程度上反應(yīng)老年哮喘患者體內(nèi)免疫反應(yīng)的異常和肺功能受損情況，miR-221的異常表達(dá)可能也與Th1和Th2細(xì)胞亞群的失衡存在一定的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，血清miR-221診斷老年哮喘快速有效，具有較高的敏感性和特異性，優(yōu)勢非常明顯。本研究的結(jié)果不僅為老年哮喘的臨床診斷提供了新的方法和思路，同時也為老年哮喘的后期治療工作提供了實驗依據(jù)。但由于本研究時間較短，研究樣本量也較小，因而本研究的結(jié)果需要在將來的研究中得到進(jìn)一步的驗證。

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(本文編輯：王映紅)

Value of serum miR-221 expression in the diagnosis of senile asthma

Wu Qiong, Liu Jinming

(Medical College of Tongji University, Shanghai 200331, China)

Objective To investigate the expression levels of serum miR-221 in senile patients with asthma and evaluate its potential value in the diagnosis of senile asthma.Methods One hundred and nine senile patients with asthma (the experimental group) and 115 healthy senile people (the control group) were recruited for the study. The expression levels of serum miR-221 of the 2 groups were detected by RT-PCR, and the receiver operating characteristic (ROC) curve was subsequently obtained. The concentrations of serum IL-4 and IL-12 of the 2 groups were measured by ELISA, and pulmonary function test (PFT) was performed as well. Finally, Spearman method was performed for correlation analysis between serum miR-221 expression levels and serum cytokine concentrations or PFT parameters.Results Compared with that of the healthy senile people, the expression levels of serum miR-221 in the senile patients with asthma were significantly elevated, and statistical significance could be seen, when comparisons were made between them(P<0.05). The diagnostic cutoff value of serum miR-221, confirmed by the ROC curve, was 1.37. There was statistical significance in IL-4 concentrations, IL-12 concentrations, FVC, FEV1 and PEF between the senile patients with asthma and healthy senile people(P<0.05). Spearman correlation analysis indicated that there was significant correlation between serum miR-221 expression levels and serum IL-4 concentrations, serum IL-12 concentrations, FVC, FEV1 or PEF(allP<0.05).Conclusion The expression level of serum miR-221 could be used as an indicator for the seriousness of senile asthma, and at the same time, it might open up a new avenue for clinical treatment of senile asthma.

Senile asthma; miR-221; IL-4; IL-12; Pulmonary function; Diagnosis

200331 上海，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院(吳瓊)；上海市肺科醫(yī)院(劉錦銘)

劉錦銘，電子信箱：13761644303@163.com

R563.9

A [DOI] 10.3969/j.issn.1009-0754.2016.05.016

2016-01-28)