閆瑢玓 方慧 遲莉

燈盞花乙素對(duì)肝星狀細(xì)胞及TGF-β1/Smad信號(hào)通路的作用評(píng)價(jià)

閆瑢玓 方慧 遲莉

目的 觀察燈盞花乙素(scutellarin)對(duì)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smad信號(hào)通路的影響,探討scutellarin抗肝纖維化的機(jī)制。方法 建立TGF-β1誘導(dǎo)的HSC LX-2模型,CCK-8法檢測(cè)scutellarin對(duì)細(xì)胞增殖的作用,化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)scutellarin對(duì)Caspase3/7活性的影響,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞上清液Ⅰ型前膠原的含量,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞Smad2和Smad3磷酸化水平。結(jié)果

燈盞花乙素; 肝星狀細(xì)胞; TGF-β1/Smad信號(hào)通路

肝纖維化是指在各種致病因子作用下,肝星形細(xì)胞(hepatic Stellate cell,HSC)被活化并增殖,分泌出大量的膠原纖維,過(guò)度沉積于肝臟的病理過(guò)程,它不是一個(gè)獨(dú)立的疾病,而是許多慢性肝臟疾病的共同階段。肝纖維化屬于可逆的階段,肝纖維化階段的治療非常重要[1]。燈盞花乙素(scutellarin,scu)又名野黃芩苷,是從燈盞花中提取的一種黃酮類成分,具有廣泛的生物學(xué)活性。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)燈盞花乙素對(duì)多種器官纖維化[2-3]有治療作用,可以減輕CCl4和豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型的纖維化程度[4-5],但其抗肝纖維化的作用機(jī)制研究較少。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)是促進(jìn)HSC增殖和膠原纖維分泌作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一[6]。本研究擬在人肝星形細(xì)胞系LX-2細(xì)胞上觀察燈盞花乙素對(duì)肝星形細(xì)胞生物學(xué)活性及TGF-β1信號(hào)通路的影響,初步探討燈盞花乙素治療肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑和器材

燈盞花乙素,成都貝斯特試劑有限公司,純度≥98%,批號(hào):150615;LX-2細(xì)胞,Scott L. Friedman教授贈(zèng)送[7];胎牛血清(fetal bovin serum, FBS),GIBCO公司,批號(hào):1616496;DMEM高糖培養(yǎng)基,Hyclone,批號(hào):NAC1363;Cell Counting Kit-8 (CCK-8)試劑盒,日本同仁化學(xué)研究所,批號(hào): GX612;Caspase-Glo?3/7檢測(cè)試劑盒,普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司,批號(hào):0000116968;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1,Peprotech Inc,批號(hào):100-21;Procollagen Type I C-peptide(PIP)EIA試劑盒,Takara Bio Inc,批號(hào):AK1801;PathScan?Phospho-Smad2 (Ser465/467)Sandwich ELISA Kit,Cell Signaling Technology,Inc,批號(hào):0015;PathScan?Phospho-Smad3(Ser423/425)Sandwich ELISA Kit,Cell Signaling Technology,Inc,批號(hào):0028。

十萬(wàn)分之一電子天平,OHAUS,型號(hào):AP2500;酶標(biāo)儀,美國(guó)BIO-RAD公司,型號(hào):MODEL 6800;倒置熒光顯微鏡,西安測(cè)維光電技術(shù)有限公司,型號(hào): LWD300-38LT1;Ensipire?多功能酶標(biāo)儀, PerkinElmer,型號(hào):2300;二氧化碳培養(yǎng)箱,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,型號(hào):371。

1.2 CCK-8法檢測(cè)燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響[8]

分別在正常狀態(tài)和TGF-β1刺激下觀察燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響。將LX-2細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24小時(shí)后,加入燈盞花乙素,TGF-β1刺激的組別同時(shí)加入2 pg/L的TGF-β1,培養(yǎng)24小時(shí),加入CCK-8 20 μL,培養(yǎng)0.5小時(shí),采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值。

1.3 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞Caspase3/7活力的影響

將LX-2細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,接種于96孔板中,培養(yǎng)24小時(shí)后,加入燈盞花乙素,再分別培養(yǎng)10小時(shí)和22小時(shí),加入檢測(cè)試劑,每孔100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí),用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光值。

1.4 ELISA法檢測(cè)燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞Ⅰ型前膠原分泌的影響[9]

將LX-2細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24小時(shí),加入2 pg/L的TGF-β1和燈盞花乙素,再培養(yǎng)48小時(shí),采用ELISA法檢測(cè)上清中Pro-collagenⅠ的影響。

1.5 ELISA法檢測(cè)燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞TGF-β1信號(hào)通路Smad2、Smad3磷酸化水平的影響

將1.5×105個(gè)LX-2細(xì)胞接種于12孔板中,培養(yǎng)24小時(shí)后,換為無(wú)血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24小時(shí),加入燈盞花乙素培養(yǎng)2小時(shí),加入2 ng/mL TGF-β1, 30分鐘后,將上清吸出,用PBS沖洗細(xì)胞1次,加入細(xì)胞裂解液,在冰上孵育5分鐘,將細(xì)胞刮下來(lái),超聲2次,3000 rpm,離心10分鐘,將上清取出,每孔加100 μL稀釋后的細(xì)胞裂解液到酶標(biāo)板中,之后按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,對(duì)各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。如方差齊,用GraphPad Prism軟件進(jìn)行單因素方差分析,Dunnet-t檢驗(yàn);如果方差不齊,進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后,再進(jìn)行方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響

1、10、100 μmol/L 3個(gè)濃度的燈盞花乙素作用24小時(shí)對(duì)正常LX-2細(xì)胞活力無(wú)明顯影響;2 pg/L TGF-β1作用24小時(shí)可明顯誘導(dǎo)HSC的增殖,10 μmol/L和100 μmol/L燈盞花乙素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖有抑制作用,提示燈盞花素有抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖的作用。見(jiàn)表1。

2.2 燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞Caspase3/7活力的影響

燈盞花乙素作用12小時(shí)和24小時(shí),只有100 μmol/L的燈盞乙素能提高LX-2細(xì)胞的Caspase3/7活力,表明只有高濃度的燈盞花素可在一定程度上誘導(dǎo)HSC的凋亡,燈盞花乙素對(duì)HSC增殖的抑制作用并非全部通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而實(shí)現(xiàn)。見(jiàn)表1。

表1 燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞增殖、Caspase3/7水平的影響(n=3,±s)

表1 燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞增殖、Caspase3/7水平的影響(n=3,±s)

注:與0 μmol/L比較,aP＜0.05。

Caspase3/7活力TGF-β1(-)組別燈盞花乙素濃度(μmol/L)細(xì)胞活力(OD450) 0.40±0.010.47±0.06 1 0.44±0.070.56±0.12 100.35±0.070.72±0.07 1000.32±0.030.91±0.04 TGF-β1(+)00.88±0.104.29±0.50 1 0.79±0.044.78±0.68 100.54±0.05a5.04±0.80 1000.45±0.02a7.49±1.02 0 a

2.3 燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞Ⅰ型前膠原分泌的影響

燈盞花乙素對(duì)正常HSC分泌Ⅰ型前膠原沒(méi)有影響;TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞后,細(xì)胞分泌Ⅰ型前膠原顯著增多,1、10、100 μmol/L 3個(gè)濃度的燈盞花乙素都抑制了Ⅰ型前膠原的分泌,提示燈盞花乙素具有抑制星形細(xì)胞分泌膠原的能力。見(jiàn)表2。

表2 燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞上清Pro-collagen TypeⅠC-peptide的影響(n=3,±s)

表2 燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞上清Pro-collagen TypeⅠC-peptide的影響(n=3,±s)

注:與0 μmol/L比較,aP＜0.05。

組別燈盞花乙素濃度(μmol/L)Ⅰ型前膠原(pg/L) TGF-β1(-)345.00±111.00 1 369.70±154.80 10251.00±44.31 100166.30±22.03 TGF-β1(+)01460.00±118.00 1 1052.00±138.50a10702.00±90.74a100474.30±102.00 0 a

2.4 燈盞花乙素對(duì)LX-2細(xì)胞TGF-β1下游信號(hào)通路分子p-Smad2和p-Smad3水平的影響

TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞后,TGF-β1信號(hào)通路Smad2和Smad3磷酸化水平顯著提高,燈盞花乙素10和100 μmol/L不同程度上抑制了2個(gè)分子磷酸化的程度,提示燈盞花乙素可以抑制TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)分子,燈盞花乙素對(duì)星形細(xì)胞增殖和膠原分泌的抑制作用可能是通過(guò)抑制TGF-β1信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。見(jiàn)表3。

表3 燈盞花乙素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞p-Smad2、p-Smad3的影響(n=3,±s)

表3 燈盞花乙素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞p-Smad2、p-Smad3的影響(n=3,±s)

注:與Control比較,aP＜0.05;與TGF-β1比較,bP＜0.05。

組別濃度(μmol/L) p-Smad2 (OD450) p-Smad3 (OD450) Control/0.42±0.030.11±0.02 TGF-β1/1.20±0.20a1.37±0.32a燈盞花乙素11.09±0.261.04±0.19 100.67±0.16a0.70±0.08 1000.54±0.10b0.42±0.02b

3 討論

燈盞花又名燈盞細(xì)辛,為云南地方性中草藥,具有散寒解表、活血舒筋、止痛消積等功效,以燈盞花乙素為主要成分的燈盞花注射液在臨床治療腦血管疾病取得了很好的效果[10-12]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)燈盞花乙素在抗器官纖維化方面有一定作用。燈盞花乙素抗心肌間質(zhì)纖維化的機(jī)制之一是能夠抑制TGF-β1信號(hào)通路[13],筆者推測(cè)燈盞花乙素可能也是通過(guò)作用于TGF-β1信號(hào)通路而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

肝臟TGF-β1由肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌[14-15],被認(rèn)為是在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子[16-17],它不但能促使肝星形細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞,而且是促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌膠原纖維作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子[18],能刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成并抑制基質(zhì)的降解[19]。正常情況下,TGF-β1是失活的狀態(tài),一旦激活,TGF-β1就會(huì)和細(xì)胞膜表面的TGF-β受體結(jié)合,形成二聚體,轉(zhuǎn)入膜內(nèi),引起Smads家族轉(zhuǎn)導(dǎo)子主要是Smad2和Smad3的磷酸化,之后和Smad4結(jié)合,轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[20-21]。Smads被認(rèn)為是TGF-β1介導(dǎo)膠原合成、促進(jìn)纖維化的關(guān)鍵通路。

筆者檢測(cè)了燈盞花乙素對(duì)肝星形細(xì)胞的作用及對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)因子的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明燈盞花乙素能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖,降低細(xì)胞活力,抑制Smad 2和Smad3的磷酸化,從而抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路,這可能是燈盞花乙素抗肝纖維化的作用機(jī)制之一。

總之,燈盞花乙素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星形細(xì)胞增殖,呈劑量依賴性的抑制Smad2/3磷酸化,從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程。筆者的研究探討了燈盞花乙素抗肝纖維化可能的作用機(jī)制。

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Effect of scutellarin on TGF-β1/Smad signaling pathway in hepatic stellate cell

YAN Rong-di,FANG Hui,CHI Li.Department of Occupational Disease,the Second Affiliated Hospital of Shandong University of Chinese Medicine,Jinan 250001,China

CHI Li,E-mail:13911824903@163.com

Objective To observe the effect of scutellarin on signaling pathway in hepatic stellate cells(HSC)and transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1),to explore the mechanisms of antihepatic fibrosis.Methods Experiments were conducted by human HSC cells line.Transforming growth factor-β1(TGF-β1)was used to induce HSC model.The inhibitory effect of scutellarin on LX-2 cells was observed.Chemiluminescence measurement was used to measure the activity of caspase3/7 in LX-2 cells. ELISA was used to detect the content of pro-collagenⅠin LX-2 supernatant.The expressions of Phospho-

Scutellarin; Hepatic stellate cell; TGF-β1/Smad signaling pathway

R285

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.008

2016-01-21)

(本文編輯:韓虹娟)

2015年首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)(15ZM08)

250001 濟(jì)南,山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院職業(yè)病科(閆瑢玓);首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)系[方慧(本科生)、遲莉]

閆瑢玓(1978-),女,碩士,主治醫(yī)師。研究方向:職業(yè)性疾病和中毒性疾病的診治。E-mail: kellycat813@163.com

遲莉(1980-),女,博士,講師。研究方向:肝臟疾病的文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究。E-mail:13911824903@ 163.com

scutellarin能抑制HSC增殖,增強(qiáng)細(xì)胞Caspase3/7活力,抑制Ⅰ型前膠原分泌,降低LX-2細(xì)胞Smad2和Smad3磷酸化水平。結(jié)論 抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路可能是scutellarin抗肝纖維化的作用機(jī)制。

Smad2 and Phospho-Smad3 were measured by ELISA.Results Scutellarin could Inhibit LX-2 cells proliferation,pro-collagen,Ⅰsecretion,and phosphorylation of Smad2,Smad3 expressions.Scutellarin could improve the activities of caspase3/7.Conclusion The mechanism of scutellarin to anti hepatic fibrosis may be the inhibition of TGF-beta 1/Smad signaling pathway