劉劍 張磊 王凱 惠浩 代鵬 海璐明 饒維 費(fèi)舟* (第四軍醫(yī)大學(xué): 西京醫(yī)院神經(jīng)外科, 藥學(xué)系藥物基因組學(xué)教研室，陜西 西安 7003)

GSI對(duì)機(jī)械性損傷的神經(jīng)元保護(hù)作用

劉劍1張磊1王凱1惠浩1代鵬2海璐明2饒維1費(fèi)舟1*
(第四軍醫(yī)大學(xué):1西京醫(yī)院神經(jīng)外科,2藥學(xué)系藥物基因組學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

目的探討γ-分泌酶抑制劑(GSI)對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷的保護(hù)作用。方法原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元，培養(yǎng)基中加入10 μmol/L GSI共同孵育24 h后，使用微量移液器槍頭做機(jī)械性劃傷。測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活力的變化；Hochest染色測(cè)定神經(jīng)元凋亡情況；Western blot方法檢測(cè)切冬酶-3(caspase-3)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果GSI預(yù)處理可抑制因細(xì)胞損傷引起的LDH的釋放，可降低損傷后Hochest陽性細(xì)胞的數(shù)量以及活化caspase-3的表達(dá)。結(jié)論GSI對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷有保護(hù)作用。

神經(jīng)元; 損傷; 凋亡

Notch信號(hào)通路是一條細(xì)胞間保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在大量的組織和器官的早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，對(duì)細(xì)胞的發(fā)育，生長(zhǎng)及凋亡起著重要的調(diào)控作用[1]。Notch受體的激活和作用需要由依賴早老素1的γ-分泌酶對(duì)其進(jìn)行酶解而釋放活化的胞內(nèi)域(Notch receptor intracellular domain, NICD)，NICD與相應(yīng)的分子結(jié)合后激活下游的信號(hào)分子而產(chǎn)生效應(yīng)[2]。γ-分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor, GSI)可以有效的抑制早老素1/γ-分泌酶的復(fù)合體，從而明顯的抑制Notch信號(hào)通路的活化[3]并增強(qiáng)干細(xì)胞的分化[4]。近年來的許多細(xì)胞層面Notch信號(hào)通路研究都使用了GSI[5,6]。目前對(duì)Notch信號(hào)通路在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用研究較少。因此，我們旨在探討抑制γ-分泌酶調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路與神經(jīng)元機(jī)械性損傷的關(guān)系，為創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)機(jī)制研究及其應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、材料

妊娠15～16 d昆明孕鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心)；多聚賴氨酸、GSI(Sigma公司)；神經(jīng)元培養(yǎng)基(Gibico)、B27、谷氨酰胺3 mg/l；青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml、乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成)；細(xì)胞凋亡Hochest 33258染色試劑盒、兔抗鼠激活型caspase-3一抗(Cell Signal公司)；兔抗鼠caspase-3一體(Cell Signal公司)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)抗兔二抗(Santa Cruz)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：15～16 d昆明孕鼠，脫頸處死。75%酒精浸泡消毒10 min，在超凈臺(tái)內(nèi)，無菌條件下打開腹腔，取出胚胎，解剖顯微鏡下剝出大腦，分離皮層，在顯微鏡下剝?nèi)テ拥哪X膜。用眼科剪將皮層剪碎，在胰酶中消化15 min，含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)中洗兩次，在添加有B27、谷氨酰胺，雙抗的神經(jīng)元培養(yǎng)液中吹打，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度，以1×109/L的密度接種于事先用多聚賴氨酸包被過夜的60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，置37℃的5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔3 d半量換液。

2.實(shí)驗(yàn)分組、藥物與損傷處理：培養(yǎng)6 d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組：正常培養(yǎng)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)組：按10 μmol/L的終濃度，向培養(yǎng)液中加入DMSO；GSI組：按10 μmol/L的終濃度，向培養(yǎng)液中加入GSI。24 h后，按照參考文獻(xiàn)對(duì)三組細(xì)胞用微量移液器吸頭做間隔5 mm的9×9橫豎劃傷[7]，以上每組設(shè)2個(gè)平行皿，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性測(cè)定：細(xì)胞受損后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，LDH從胞內(nèi)大量釋放，因而檢測(cè)LDH釋放量能夠定量評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷程度[8]。收集培養(yǎng)液，測(cè)定步驟按LDH試劑盒說明進(jìn)行(南京建成生物工程研究所)。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)340 nm波長(zhǎng)處的光密度(optical density, OD)值，并轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)DH活力。參照LDH試劑盒說明書操作，計(jì)算LDH泄漏率。LDH泄漏率=細(xì)胞外LDH活性/細(xì)胞總的LDH活性×100%。

4.Hochest 33258染色：培養(yǎng)至第7天，吸凈培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，立即用4%多聚甲醛固定30 min，磷酸緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)沖洗3 min×3次后，用hochest 33258染色液染色5 min，去除染色液用抗淬滅封片劑封片。置于熒光顯微鏡下拍照，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

5.Western blot：收集成熟的神經(jīng)元細(xì)胞，PBS漂洗一遍，加入細(xì)胞裂解液，1 m裂解液中加10 μl苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的比例充分裂解細(xì)胞，4℃，12 000 r/min離心30 min，保留上清，以二辛可寧酸(bicinchonininc acid, BCA)法測(cè)定總蛋白濃度。在上清液中加入10×的上樣緩沖液，煮沸5 min，-20℃貯存?zhèn)溆谩Ｊ榛蛩徕c聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)采用4%積層膠，10%分離膠，上樣量為10 μg。電泳結(jié)束后取出凝膠電轉(zhuǎn)移至同等大小的硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜置于封閉液(奶粉1 g溶解于20 ml的洗滌緩沖液(tris buffered saline with tween, TBST))1 h，用兔抗激活型caspase-3單克隆抗體(1 ∶500)，兔抗caspase-3單克隆抗體，4℃過夜，次日 TBST漂洗5 min×3次；HRP聯(lián)山羊抗兔IgG( 1 ∶10 000)，室溫處理1 h，TBST漂洗 5 min×3次，HRP顯色液中反應(yīng)至條帶清晰。

三、 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、細(xì)胞培養(yǎng)與劃傷模型

體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元在接種后2 h左右大部分已經(jīng)貼壁，接種初期細(xì)胞呈圓形，周邊光暈明顯。當(dāng)培養(yǎng)至5 d時(shí) ,神經(jīng)元胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核圓形居中央，神經(jīng)元大部分突起長(zhǎng)并有許多分叉，突起互相交織成網(wǎng)狀，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。第6天劃傷后即見劃傷區(qū)域神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完全消失，呈空白區(qū)，可見較多細(xì)胞碎屑，損傷區(qū)周圍細(xì)胞突起受損(圖1)。

二、LDH測(cè)定

對(duì)細(xì)胞劃傷后的LDH漏出進(jìn)行測(cè)定以研究GSI對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，結(jié)果顯示：GSI預(yù)處理組的LDH明顯低于劃傷組(P<0.05)，而DMSO組與劃傷組比較則沒有明顯區(qū)別(P>0.05)(圖2)。

三、Hochest 33258染色

使用Hochest 33258染色來檢測(cè)神經(jīng)元損傷后的凋亡水平。熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞核邊緣光滑、完整而且密度均一，核內(nèi)染色質(zhì)均勻淡染；凋亡細(xì)胞核固縮、核染色質(zhì)致密伴熒光染色增強(qiáng)，部分細(xì)胞內(nèi)可見細(xì)胞核碎裂及凋亡小體形成(圖3)。結(jié)果顯示：GSI預(yù)處理組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于損傷組(P<0.05)，DMSO組與劃傷組比較則沒有明顯區(qū)別(P>0.05, 圖4)。

四、Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)

Western-blotting方法分析caspase-3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示(圖5)：GSI預(yù)處理組活化的caspase-3蛋白明顯少于損傷組(P<0.05)，DMSO組與劃傷組比較則沒有明顯區(qū)別(P>0.05)。

圖1 培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元的形態(tài) (×10)

Fig 1 Morphology of mature neuron (×10)

Black arrow indicated the mechanical injury.

圖2 神經(jīng)元損傷后LDH測(cè)定

Fig 2 LDH detection after neuron injury

aP<0.05,vsinjury group and DMSO group.

圖3 神經(jīng)元損傷后的凋亡水平

Fig 3 Apoptosis level of neuron after injury

A: Injury group; B: DMSO group; C: GSI group.

圖4 Hochest 33258染色結(jié)果

Fig 4 The stain results of Hochest 33258

aP<0.05,vsinjury group and DMSO group.

圖5 Caspase-3蛋白表達(dá)水平

Fig 5 The expression level of caspase-3

A: The results of Western blot; B: The results of relative ratio.

aP<0.05,vsinjury group and DMSO group

討 論

Notch信號(hào)是調(diào)節(jié)細(xì)胞自我更新、分化的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。Notch信號(hào)的異常活化已被證明與包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[9]，但其在腦損傷中的研究卻相對(duì)較少。Notch受體能夠被Notch配體家族所激活。目前的研究表明，Notch信號(hào)通路的激活需要經(jīng)過三步酶切過程：首先在細(xì)胞內(nèi)，合成的受體蛋白單鏈前體分子被高爾基體內(nèi)的furin蛋白酶酶切，酶切位點(diǎn)在Notch跨膜區(qū)胞外端的Sl位點(diǎn)，酶切形成的胞外Notch結(jié)構(gòu)域(extracellular Notch domain, ECN)和Notch跨膜片段(Notch transmembrane fragment, NTM)通過Ca2+依賴的非共價(jià)鍵結(jié)合在一起，形成異二聚體形式的成熟Notch受體，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。當(dāng)配體與胞外區(qū)結(jié)合后，Notch受體在解離素-金屬蛋白酶家族的腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)換酶(tumor necrosis factor -α- convening enzyme, TACE)的作用下，于S2酶切位點(diǎn)發(fā)生第二次酶切，釋放部分胞外片段。γ-分泌酶(依賴早老素1)進(jìn)行組成性酶切過程，發(fā)生于S3酶切位點(diǎn)。經(jīng)過此步酶切過程，形成可溶性NICD并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。在核內(nèi)NICD與CSL(CSL是CBF-1, Su(H)和Lag的合稱，它們是Notch信號(hào)在核內(nèi)活化的轉(zhuǎn)錄因子，即CSL= CBF-1/Su(H)/Lag。CBF-1：C-啟動(dòng)子結(jié)合因子1(C-promoter binding factor-1), Su(H)：suppressor of hairles)蛋白結(jié)合，將原本“協(xié)同抑制復(fù)合物”轉(zhuǎn)換為“協(xié)同活化復(fù)合物”，并進(jìn)而與DNA形成多蛋白-DNA復(fù)合體，激活相關(guān)基因的表達(dá)[10]。GSI是一種γ-分泌酶抑制劑，它作用于早老素1分子而阻斷γ-分泌酶的作用，減少NICD的產(chǎn)生，下游信號(hào)分子由于缺少或減弱NICD的啟動(dòng)作用處于靜止或下調(diào)的狀態(tài)[3]。

本研究中采用的神經(jīng)元損傷模型用微量移液器塑料滴頭機(jī)械性劃傷，操作簡(jiǎn)易，較好模擬了腦損傷后神經(jīng)元損傷機(jī)制，利于觀察和研究神經(jīng)元損傷及其反應(yīng)[7]。LDH存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，細(xì)胞膜受損后被釋放到胞外。神經(jīng)系統(tǒng)損傷可見腦脊液中LDH水平升高，與損傷程度呈正相關(guān)，所以我們使用LDH水平衡量培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，而且結(jié)果證明GSI預(yù)處理確實(shí)減少了損傷造成的LDH漏出。

Caspase是細(xì)胞凋亡程序中一類關(guān)鍵的同源半胱氨酸蛋白酶。caspase家族作為特異的死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。其中caspase-3是caspase依賴性細(xì)胞凋亡途徑中的重要執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白酶在正常情況下存在于胞質(zhì)中，損傷等一些刺激因素作用下被激活，水解胞質(zhì)、胞核蛋白，破壞細(xì)胞骨架，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體，切斷凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞的聯(lián)系，關(guān)閉DNA的復(fù)制與修復(fù)，降解DNA，最后將細(xì)胞解體并包裹形成凋亡小體[11,12]。降低了caspase-3的活化和凋亡細(xì)胞的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)GSI預(yù)處理明顯抑制了caspase-3的活化，同時(shí)Hochest 33258染色結(jié)果也證明GSI預(yù)處理減少了凋亡細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例。

綜上所述，GSI可明顯減輕神經(jīng)元損傷后的LDH漏出，抑制損傷所引起的caspase-3的表達(dá)并且抑制損傷所造成的細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷起到保護(hù)作用。在下一步工作中，我們將對(duì)抑制Notch信號(hào)通路保護(hù)神經(jīng)元損傷這一現(xiàn)象的具體機(jī)制再做深入探討。

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ProtectionofGSIonmiceneuronwithmechanicalinjury

LIUJian1,ZHANGLei1,WANGKai1,HUIHao1,DAIPeng2,HAILuming2,RAOWei1,FEIZhou1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital;2DepartmentofPharmacogenomics,SchoolofPharmacy,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe role of gamma-secretase inhibitor (GSI) in mechanical-injured cortical neuron in vitro is investigated.MethodsGSI (10 μmol/L) pretreatment applied to cultured cortical neuron at 24 h before mechanical injury. Lactate dehydrogenase (LDH), Hochest staining and expression of caspase-3 were measured after injury.ResultsGSI pretreatment reduced the leakage of LDH and suppressed neuron apoptosis caused by mechanical injury.ConclusionGSI can protect the neuron against mechanical injury.

Neuron; Injury; Apoptosis

1671-2897(2016)15-201-04

·神經(jīng)損傷研究·

R 651.1

A

劉劍，碩士，E-mail: 534007233@qq.com

*通訊作者： 費(fèi)舟，教授、主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2014-08-10；

2015-01-20)