楊志軍 白妙春 陳中燦 戴宜武 徐如祥 (北京軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100700)

USPIO標(biāo)記大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞體外磁共振成像研究

楊志軍 白妙春 陳中燦 戴宜武 徐如祥*
(北京軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100700)

目的應(yīng)用磁共振成像技術(shù)(MRI)觀察超小超順磁性氧化鐵(USPIO)欣諾(Sinerem)標(biāo)記后的大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞體外成像情況。方法分離大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)誘導(dǎo)成神經(jīng)干細(xì)胞。以200 μg/ml的濃度105個(gè)細(xì)胞用不同的自旋回波序列T1WI、T2WI與T2*WI在2%的瓊脂糖凝膠中模擬在體環(huán)境分別行4.7T掃描確定最佳的掃描序列。將不同濃度(0、25、50、100、200、500 μg/ml)Sinerem和干細(xì)胞共孵育培養(yǎng)過(guò)夜標(biāo)記后置于2%的瓊脂糖凝膠中，以自旋回波序列T2*WI磁共振干細(xì)胞成像；并在磁共振下觀察不同數(shù)量細(xì)胞200 μg/ml Sinerem標(biāo)記細(xì)胞(101個(gè)，102個(gè)，103個(gè)，104個(gè)，105個(gè))的信號(hào)情況。觀察細(xì)胞在濃度200 μg/ml(106個(gè))標(biāo)記時(shí)經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)的信號(hào)變化。結(jié)果MRI掃描結(jié)果提示序列T2*WI掃描的敏感性最強(qiáng)。不同濃度的Sinerem標(biāo)記細(xì)胞的磁共振信號(hào)強(qiáng)度不同，隨著Sinerem濃度的升高M(jìn)RI信號(hào)呈降低趨勢(shì)，濃度為500 μg/ml時(shí)信號(hào)強(qiáng)度最低，肉眼觀察可看到濃度100 μg/ml以上標(biāo)記細(xì)胞的MRI的信號(hào)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照樣品，可進(jìn)行區(qū)分。標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量達(dá)103個(gè)及以上時(shí)在磁共振下其信號(hào)變化能被觀察到。106個(gè)標(biāo)記細(xì)胞的信號(hào)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，4 w時(shí)仍能在磁共振下顯示可區(qū)分的低信號(hào)。結(jié)論利用Sinerem標(biāo)記的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞體外可在MRI下呈現(xiàn)可視區(qū)別的低信號(hào)影，T2*WI序列是最敏感的序列；信號(hào)強(qiáng)度的高低可用于評(píng)估標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量。Sinerem標(biāo)記的細(xì)胞可用于磁共振下進(jìn)行長(zhǎng)期的示蹤。

神經(jīng)干細(xì)胞; 骨髓基質(zhì)細(xì)胞; 核磁共振成像; 超小超順磁性氧化鐵; 欣諾

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)可以向神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSCs)、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化[1]，為了與來(lái)源神經(jīng)組織的NSCs相區(qū)別，將此種由骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的NSCs稱(chēng)為骨髓基質(zhì)細(xì)胞源NSCs(bone marrow stromal cells derived from neural stem cells, BMSCs-D-NSCs)。由于BMSCs容易獲取、可在體外大量擴(kuò)增并在一定條件下能誘導(dǎo)成神經(jīng)干細(xì)胞，因此成為NSCs的重要來(lái)源隨著影像學(xué)的發(fā)展，MRI活體示蹤技術(shù)逐漸應(yīng)用到干細(xì)胞移植領(lǐng)域。超小超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO)欣諾(sinerem )是一類(lèi)新型的納米級(jí)的超順磁性氧化鐵微粒，是臨床上被批準(zhǔn)使用的新型MRI造影劑[2,3]。由于其自身特殊的磁性，可在磁場(chǎng)作用下與周?chē)M織進(jìn)行不同的成像，如果用其標(biāo)記干細(xì)胞，就可以進(jìn)行影像學(xué)的無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。本文體外模擬活體組織微環(huán)境，對(duì)其在磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)下的敏感性、成像情況等進(jìn)行了研究和評(píng)價(jià)，為下一步體內(nèi)的真正應(yīng)用建立基本的參數(shù)和探討最佳的掃描方法。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠，體重180～220 g 。經(jīng)檢疫符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間飼養(yǎng)于北京軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房?jī)?nèi)。

二、主要試劑和儀器

神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(專(zhuān)利號(hào)：02134314.4)，北京軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室自行配制；堿性成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)，Sigma公司；維甲酸(retinoic acid, RA)，Sigma公司；胎牛血清，杭州四季青；多聚賴氨酸(polylysine, PLL)，Sigma公司；Sinerem，法國(guó)geurbet公司；白血病抑止因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)，Sigma公司；瓊脂糖(agarose)，Promega公司；Brucker 4.7T超導(dǎo)核磁共振成像系統(tǒng)，美國(guó)；透射電子顯微鏡(JEOM2100SX)，日本。

三、大鼠BMSCs的分離及BMSCs-D-NSCs方向的誘導(dǎo)

用10%的水合氯醛(0.4 ml/100 g)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉， 12號(hào)注射針穿透骨皮質(zhì)至骨髓腔，以濃度為500 U/ml肝素濕化處理注射器并力抽吸骨髓，所獲骨髓用Hank's液稀釋?zhuān)?xì)胞懸液按1 ∶2比例加入到分離液(percoll, Sigma)中進(jìn)行2 500 rpm×15 min密度梯度離心，離心后小心吸取富含有核細(xì)胞的界面層,，以2 ml雙蒸水(4℃)吹打細(xì)胞約1 min以破壞紅細(xì)胞，再加入培養(yǎng)基終止紅細(xì)胞溶解，800 rpm離心5 min，去上清，沉淀物即含BMSCs，加相同神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并加胎牛血清(1%終濃度)接種于24孔培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中。于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)2～3 d換液一次。以0.25%胰酶消化細(xì)胞。2～3次傳代后，收集細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×106/ml備用。

四、BMSCs-D-NSCs的Sinerem體外標(biāo)記

首先將Sinerem (20 mg/ml)和PLL(1.5 mg/ml)加入到無(wú)血清的NSCs培養(yǎng)基中，使兩者的濃度分別為400 μg/ml和1.5 μg /ml，在振蕩器上室溫孵育60 min，然后加入等體積誘導(dǎo)后的細(xì)胞懸液中，二者在細(xì)胞懸液中的終濃度分別為200 μg/ml和0.75 μg/ml，在37℃、5%CO2條件下孵育16 h，去除培養(yǎng)基，用Hank's液洗滌2次以洗去游離的SE和PLL，靜置備用。

五、體外瓊脂糖凝膠的配制、細(xì)胞的磁共振掃描

六、不同MR序列掃描敏感性實(shí)驗(yàn)

將200 μg/ml Sinerem標(biāo)記24 h后的105個(gè)細(xì)胞置于20 μl的瓊脂糖凝膠中，共6孔，分別行SE T1WI、T2WI和GRE序列T2*WI成像，分析信號(hào)變化。掃描方法：SE T1WI:TR 500 ms，TE 15 ms；SE T2WI：TR 4 000 ms，TE 100 ms；T2*WI：TR 300 ms，TE 20 ms。頭線圈，層厚3 mm，矩陣256×160，視野6 cm×6 cm～8 cm×8 cm。信號(hào)分析：分別測(cè)量感興趣區(qū)信號(hào)，信號(hào)改變以下列公式計(jì)算：ΔSI=[(SIL-SIU)/ SIU]×100% (ΔSI為信號(hào)變化率，SIL為標(biāo)記細(xì)胞信號(hào)，SIU為未標(biāo)記細(xì)胞信號(hào))。

七、不同濃度Sinerem標(biāo)記BMSCs-D-NSCs的體外MR掃描成像

按上述方法分別將106個(gè)不同濃度Sinerem(0 μg/ml，25 μg/ml，50 μg/ml，100 μg/ml，200 μg/ml，500 μg/ml)標(biāo)記的BMSCs-D-NSCs置于2%瓊脂糖(60℃懸浮，室溫凝固)中，行4.7T核磁共振T2*WI序列掃描，觀察成像情況。

八、不同數(shù)量標(biāo)記細(xì)胞的MRI掃描成像

將1 μl 200 μg/ml濃度Sinerem標(biāo)記的不同數(shù)量的細(xì)胞(101、102、103、104、105及106個(gè)細(xì)胞/μl)，置于凝膠中，按上述方法行4.7T核磁共振掃描。

九、標(biāo)記細(xì)胞不同時(shí)相的掃描

為了確定Sinerem標(biāo)記細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)信號(hào)的變化情況，將106個(gè)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行定期(1 d、1 w、2 w、3 w及4 w)體外成像檢測(cè)，觀察MRI成像的改變。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 制備的濃度為2%的瓊脂糖凝膠

Fig 1 The preparation of 2% agarose gel

The gel density and thickness are equal. The diameter is about 5 cm and the thickness is 0.7 cm. The arrow indicates the hole for the cells.

圖2 凝膠中加入標(biāo)記細(xì)胞后的圖像

Fig 2 The picture of agarose gel grafted with labeled cells

The cells in the hole showed light yellow.

圖3 不同序列掃描的信號(hào)變化率比較

Fig 3 Comparison of signal change with different scanning sequences

1: T1WI; 2: T2WI; 3: T2*WI. The signal changes of T2WI and T2*WI were more significant than those of T1WI. And T2*WI signal change was the most.

圖4 不同濃度鐵標(biāo)記細(xì)胞MR掃描凝膠圖

Fig 4 MR Scanning of cells labeled with different Sinerem concentration

1～6 indicates 0～500 μg/ml Sinerem concentration respectively; the signal decrease was accompanying with the Sinerem concentration decrease. Arrow represents 200 μg/ml Sinerem labeling.

圖5 不同數(shù)量細(xì)胞MR掃描凝膠圖

Fig 5 MR scanning of labeled different number cells

1～6 holes represent cell number from 10～106, respectively. The low signal area begins from the third hole and become larger with the cells number increasing.

圖6 106個(gè)細(xì)胞不同時(shí)相掃描結(jié)果

Fig 6 MR scanning of labeled 106cells at different time points

1～5 holes represent the scanning time points from 1 d～4 w, respectively. The signal becomes higher, but the low signal area still can be distinguished.

結(jié) 果

一、凝膠中標(biāo)記細(xì)胞的MRI成像敏感性檢測(cè)結(jié)果

2%瓊脂糖凝膠制作后，呈均勻的乳白色凝膠(圖1)。加入細(xì)胞后呈棕黃色(圖2)。其中的標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)T1WI、T2WI和T2*WI三組序列掃描后所得的核磁共振成像信號(hào)變化率分別為-30.22±0.23、-92.31±0.79和-94.42±0.58。單因素方差統(tǒng)計(jì)方法分析結(jié)果顯示：各組間的變化率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=304.5，P=0.000 )，GRE序列的T2*WI信號(hào)變化最明顯(圖3)。提示T2*WI序列掃描時(shí)最敏感。

二、不同濃度鐵標(biāo)記后的掃描結(jié)果

體外經(jīng)MRI掃描，可見(jiàn)信號(hào)強(qiáng)度由高到低，與Sinerem的濃度(從左至右，從上至下增高)成負(fù)相關(guān)，濃度為200 ug/ml及其以上時(shí)，能清楚顯示低信號(hào)區(qū)(圖4)。

三、不同數(shù)量標(biāo)記細(xì)胞的MRI掃描結(jié)果

由凝膠中掃描圖見(jiàn)信號(hào)隨細(xì)胞數(shù)量的增加而降低，能觀察到的最低細(xì)胞量為103個(gè)，大于該數(shù)量時(shí)也能觀察到。103以上時(shí)可明顯呈低信號(hào) (圖5)。

四、標(biāo)記細(xì)胞不同時(shí)相的掃描結(jié)果

掃描凝膠可見(jiàn)從左到右隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞MRI信號(hào)逐漸增強(qiáng)，信號(hào)區(qū)暗區(qū)逐漸減少，雖然提示鐵量隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少，但至4 w時(shí)所呈低信號(hào)像仍能與周?chē)z相區(qū)別 (圖6)。

討 論

干細(xì)胞具有治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛能[4]。靜脈注射或直接移植干細(xì)胞后需要細(xì)胞的連續(xù)成像以示蹤目標(biāo)區(qū)的細(xì)胞。MRI是臨床應(yīng)用和生物醫(yī)學(xué)研究中的重要方法，具有高組織分辨率、空間分辨率、無(wú)游離輻射、非侵襲性和通用性等特點(diǎn)，故在活體細(xì)胞尤其是干細(xì)胞的示蹤監(jiān)測(cè)中前景較好。

與釓類(lèi)MRI對(duì)比劑二乙二胺五醋酸釓(gadolinium-DTPA, Gd-DTPA)相比，超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)更為安全，臨床應(yīng)用最多的是菲立磁(ferumoxides)，其平均直徑為80納米，核心氧化鐵直徑為20納米[5]。SPIO由于顆粒較大，很容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞識(shí)別并吞噬，在血管的停留時(shí)間不長(zhǎng)，一般主要被肝脾的網(wǎng)狀細(xì)胞攝入，用于肝脾造影，不能用于全身，有很大的局限性。USPIO最大直徑小于30 納米[6]。目前常見(jiàn)的有Guerbet公司AMI-227(Sinerem)和Nycomed公司的FeO-BPA 兩種制劑，前者平均直徑20納米，核心直徑4～6納米，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)獲準(zhǔn)使用。USPIO因其顆粒小，影響了吞噬細(xì)胞對(duì)它的攝取，使其在血管中停留的時(shí)間較長(zhǎng)。因而可以通過(guò)毛細(xì)血管壁，更廣泛的分布與血池及組織中，用于全身造影[7,8]。

由于磁共振對(duì)比劑是一種用于動(dòng)物或人體組織檢測(cè)病變的試劑，屬于藥物一類(lèi)，因此，對(duì)其要求比較高。所需材料要求具有生物與組織相容性，無(wú)毒，在特定時(shí)間內(nèi)能夠排除體外[9]。鐵元素本身是人身體所必需的一類(lèi)物質(zhì)，基于這一考慮，氧化鐵既具有超順磁性，又不會(huì)對(duì)身體造成大的傷害，是作為磁共振對(duì)比劑的較佳選擇。裸氧化鐵粒子不能直接用于磁共振造影，外面必須包覆一層具有組織相容性，可降解的物質(zhì)，這種物質(zhì)的一個(gè)作用是具有特異性，另一個(gè)重要作用是對(duì)氧化鐵納米粒子的分散。葡聚糖(dextran)屬于高聚物，可降解，親水，具有生物和組織相容性。用葡聚糖對(duì)氧化鐵納米粒子進(jìn)行分散屬于上面加入分散劑，即我們選用葡聚糖作為有機(jī)高聚物分散劑[10]。

干細(xì)胞磁標(biāo)記后其MRI信號(hào)發(fā)生改變是MRI活體示蹤的基礎(chǔ)，而MRI信號(hào)的改變受對(duì)比劑種類(lèi)、標(biāo)記效率、細(xì)胞數(shù)量等的影響。超順磁性氧化鐵由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，即使在較弱的磁場(chǎng)中也可產(chǎn)生較大的磁性，外磁場(chǎng)撤消后磁性也迅速消失，即所謂超順磁性[11]。超順磁性氧化鐵顆粒分布于組織后，呈不均勻分布，造成局部磁場(chǎng)的不均勻，從而加速了質(zhì)子去相位的T2弛豫，使組織信號(hào)降低，而對(duì)T1影響較小。本文主要探討了體外Sinerem標(biāo)記的BMSCs-D-NSCs在磁共振下的成像特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2%瓊脂糖凝膠是一種簡(jiǎn)便易行的組織模擬方法，MRI三種掃描序列掃描都能檢測(cè)到信號(hào)的變化，但以T2*WI序列最為敏感。不同濃度鐵標(biāo)記細(xì)胞后的掃描結(jié)果提示Sinerem的濃度為200 μg/ml時(shí)及以上時(shí)，能清楚顯示低信號(hào)區(qū)，說(shuō)明了200 μg/ml是一個(gè)比較合適的標(biāo)記濃度。通過(guò)不同數(shù)量鐵標(biāo)記細(xì)胞的MRI掃描，發(fā)現(xiàn)能觀察到的最少細(xì)胞數(shù)為103個(gè)，且標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量和MRI掃描信號(hào)呈一定的相關(guān)性，可以用MRI信號(hào)的強(qiáng)弱初步反映標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量。標(biāo)記細(xì)胞中信號(hào)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，說(shuō)明Sinerem標(biāo)記后細(xì)胞中的鐵含量隨細(xì)胞分裂、代謝等逐漸減少。本文證實(shí)在體外情況下，Sinerem標(biāo)記BMSCs-D-NSCs可以行MRI掃描進(jìn)行示蹤和定位。

1Tanna T, Sachan V. Mesenchymal stem cells: potential in treatment of neurodegenerative diseases [J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2014, 9(6): 513-521.

2Eamegdool SS, Weible MW 2nd, Pham BT, et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticle prelabelling of human neural precursorcells [J]. Biomaterials, 2014, 35(21): 5549-5564.

3Cromer Berman SM, Kshitiz, Wang CJ, et al. Cell motility of neural stem cells is reduced after SPIO-labeling, which is mitigated after exocytosis [J]. Magn Reson Med, 2013, 69(1): 255-262.

4Thorek DL, Chen AK, Czupryna J, et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticle probes for molecular imaging [J]. Ann Biomed Eng, 2006, 34(1): 23-38.

5祝劍虹, 王漢東, 樊友武, 等. 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞靶向治療的新領(lǐng)域 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2015, 14(5):471-473.

6Wu EX, Tang H, Jensen JH. Applications of ultrasmall superparamagnetic iron oxide contrast agents in the MR study of animal models [J]. NMR Biomed, 2004, 17(7): 478-483.

7Anzai Y. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: nodal metastases and beyond [J]. Top Magn Reson Imaging, 2004, 15(2): 103-111.

8Saksena MA, Saokar A, Harisinghani MG. Lymphotropic nanoparticle enhanced MR imaging (LNMRI) technique for lymph node imaging [J]. Eur J Radiol, 2006, 58(3): 367-374.

9Dodd CH, Hsa HC, Chu WJ, et a1. Normal T-cell response and in vivo magnetic resonance imaging of T cells loaded with HIV transactivator-peptide-derived superparamagnetic nanoparticles [J]. J Immunol Methods, 2001, 256(1-2): 89-105.

10Tanimoto A, Kuribayashi S. Application of superparamagnetic iron oxide to imaging of hepatocellular carcinoma [J]. Eur J Radiol, 2006, 58(2): 200-216.

11Delikatny EJ, Poptani H. MR techniques for in vivo molecular and cellular imaging [J]. Radiol Clin North Am, 2005, 43(1): 205-220.

ExperimentalstudyonUSPIOlabelingofratBMSCs-D-NSCswithMRIinvitro

YANGZhijun,BAIMiaochun,CHENZhongcan,DAIYiwu,XURuxiang

DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,Beijing100700, China

ObjectiveTo observe magnetic resonance imaging (MRI) of rat bone marrow stromal cells derived from neural stem cells (BMSCs-D-NSCs) labeled by Sinerem in vitro and evaluate the feasibility of MRI tracking of labeled NSCs.MethodsThe bone marrow stromal cells (BMSCs) were isolated and induced into BMSCs-D-NSCs in vitro. A total of 105 cells labeled with 200 μg/ml Sinerem were immerged in 2% gel and scanned by different spin-echo sequence (SE) T1WI,T2WI and T2*WI respectively to determine the best scanning sequence with 4.7T MRI system. A total of 106 cells labeled with different concentration (0, 25, 50, 100, 200, 500 μg/ml) were scanned in 2% gel by T2*WI sequence. Different number (101,102,103,104,105) of BMSs-D-NSCs labeled with 200 μg/ml Sinerem were scanned to determine the threshold of cell quantity. In the end, the signal change of 200 μg/ml Sinerem labeled cells was observed at different time points.ResultsMRI result indicated that T2*WI was the most sensitive sequence. The MRI signal intensity of Sinerem labeled cells with different concentration was various, which decreased progressively with the increasing of Sinerem concentration. The signal intensity was lowest when the concentration was 500 μg/ml. The MRI signal intensity of more than 100 μg/ml Sinerem labeling cells was much lower than control sample and could be distinguished. The MRI signal change could be observed when the cell number was 103 or more. The signal intensity of 106 labeled cells was increasing with the time extending, which could still be displayed as different low signal for 4 w.ConclusionSinerem labeled BMSCs-D-NSCs in vitro appeared visually low signal area. The best sensitive sequence was T2*WI. The level of signal can be applied for evaluating cell numbers. Sinerem labeled cells can be tracked for a long time.

Neural stem cells; Bone marrow stromal cells; Magnetic resonance imaging; Ultrasmall superparamagnetic iron oxide; Sinerem

1671-2897(2016)15-226-04

·論著·

R 329.28

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271316)

楊志軍，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：zhijunyangfmmu@163.com

*通訊作者：徐如祥，教授，E-mail： zjxuruxiang@163.com

2015-04-22；

2015-05-13)