劉 靜，王 英，王宏寬，倪迪安，馬 紅，王應祥

(1. 復旦大學 生命科學學院 植物科學研究所，上海 200433； 2. 上海應用技術學院生態(tài)技術與工程學院，上海 201418)

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番茄DNA復制因子RFC1在減數分裂重組中的功能研究

劉 靜1，#，王 英1，#，王宏寬1，倪迪安2，馬 紅1，王應祥1

(1. 復旦大學 生命科學學院 植物科學研究所，上海 200433； 2. 上海應用技術學院生態(tài)技術與工程學院，上海 201418)

減數分裂是真核生物有性生殖所必需，前期研究表明擬南芥DNA復制因子RFC1在減數分裂重組中具有重要作用，但其同源基因在其他物種中的減數分裂或其他功能還未有報道.為了檢驗番茄RFC1在減數分裂中的功能，我們建立了減數分裂特異RFC1RNAi轉基因番茄，發(fā)現(xiàn)其花粉活性顯著降低，而且減數分裂異常.利用DAPI染色觀察染色體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)RFC1RNAi減數分裂細胞在終變期和中期Ⅰ形成多價體，表明重組異常.DNA雙鏈斷裂指示蛋白γH2AX在RFC1RNAi粗線期染色體上分布的保留滯后，進一步支持RFC1RNAi中的重組異常.擬南芥和番茄分別屬于真雙子葉植物中的兩個不同大支，薔薇類和菊類，因此本文的結果也表明DNA合成基因RFC1在進化距離很遠的不同植物物種中的功能相對保守.

減數分裂； DNA復制因子； 番茄； 減數分裂特異性RNA干擾

減數分裂(meiosis)是有性生殖生物產生生殖細胞時，進行的染色體數目減半的細胞分裂活動，包括減數分裂 Ⅰ 和減數分裂 Ⅱ.減數分裂 Ⅱ 類似于有絲分裂，而減數分裂 Ⅰ 是減數分裂特異的方面，涉及到同源染色體之間的相互作用，包括配對、聯(lián)會、重組和分離[1-2].相對于其他幾個事件，重組是減數分裂過程中同源染色體相互作用中研究相對較多的.重組不僅保證了同源染色體之間的物理連接，對同源染色體后期的正確分離起到重要作用，還導致了父母染色體之間產生不同等位基因的新組合，從而大大提高了后代的遺傳多樣性.

減數分裂重組包括DNA的雙鏈斷裂、加工、合成和連接.迄今為止，以模式植物擬南芥為材料，運用正向和反向遺傳學方法已經克隆并分析了近90個具有減數分裂重要功能的基因[2]，但是DNA合成環(huán)節(jié)的基因還鮮有報道.通過對擬南芥雄性減數分裂細胞進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)減數分裂細胞表達一批DNA復制相關的基因[1，3].已有的研究表明，減數分裂重組中的DNA合成類似于有絲分裂的DNA復制，其過程高度保守[4-5].酵母有絲分裂DNA復制主要需要3種DNA聚合酶(Polα、Polε和Polδ)和3個相關復制因子(RFC、RPA和PCNA)[4].其中Polε主要負責前導鏈的合成；Polα則和Primase主要在后滯鏈啟動時負責合成短RNA-DNA片段，然后Polδ完成這些片段的延伸，形成Okazaki片段.最后再經過進一步對這些片段加工、切割和連接完成DNA復制.減數分裂重組中的DNA合成被假設是通過類似的過程而實現(xiàn)的，但相關基因功能的研究則較少.通過遺傳篩選酵母中減數分裂重組有缺陷的突變體，鑒定到一個Polδ缺失C末端4個氨基酸的特異突變體，該突變體有絲分裂正常，只影響了減數分裂重組[6].擬南芥和水稻中的RPA1也參與了減數分裂重組[7-8].最近的研究表明擬南芥POL2A(酵母Polε的同源基因)和RFC1都是減數分裂重組主要通路所必需[9-10].綜上所述，DNA復制相關基因在減數分裂重組中具有功能，但是這些基因在其他物種減數分裂中的功能還未有報道.

被子植物中約3/4為真雙子葉植物，而真雙子葉植物中最大的兩個分支是薔薇類和菊類.擬南芥是屬于薔薇類的十字花科成員；為了檢驗同源基因在進化上與擬南芥距離較遠的植物中的功能，本研究以菊類的茄科成員番茄(Solanumlycopersicum)為材料，采用減數分裂特異的基因沉默技術，分析番茄DNA復制因子RFC1在減數分裂中的功能.

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α，根瘤農桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101和pMeioDMC1載體(將35S啟動子由SlDMC1的啟動子替換后構建的RNAi載體)均為本實驗室保存；國內栽培種“黃頂紅”番茄由上海應用技術學院提供；PCR引物合成和測序由生工生物工程上海(股份)有限公司提供；植物總RNA提取試劑盒購于QIAGEN公司；PCR產物回收試劑盒、DNA片段割膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購于AXYGEN公司；高保真酶購于東洋紡公司；限制性內切酶，T4DNA連接酶，聚核苷酸激酶和SYBR試劑購于TaKaRa公司；胰蛋白胨，酵母提取物，牛肉提取物等購于Sigma公司；染色液4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI)購于Vector Laboratories；ZYP1和γH2AX抗體見文獻[9-10].

植物培養(yǎng)土配方：黑土40%，蛭石40%，珍珠巖20%；植物1/2MS培養(yǎng)基配方：MS粉2.2g/L，蔗糖10g/L，KOH調pH至5.8，加0.7%瓊脂粉，滅菌條件121℃，15min，降溫到約60℃時加抗生素25μg/mL；大腸桿菌LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，固體培養(yǎng)基加15g/L 瓊脂粉，滅菌條件121℃，15min，降溫到約60℃時倒板，選擇培養(yǎng)基含100μg/mL氨芐青霉素或50μg/mL 卡那霉素；農桿菌YEB培養(yǎng)基配方：牛肉提取物5g/L，酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO42mol/L，KOH調pH至7.4，選擇培養(yǎng)基含25μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素.

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)發(fā)生樹構建

使用MEAG 5中的muscle序列比對軟件對蛋白序列進行序列比對.接著使用FastTree軟件的極大似然(Maximum Likelihood)方法對比對好的序列構建進化樹，參數使用默認.進化樹構建好之后，使用MEGA 5打開和調整.

1.2.2 番茄RFC1干涉載體的構建和轉基因植物的獲取

設計減數分裂特異基因DMC1啟動子的番茄擴增引物(表1)，用番茄DMC1基因的啟動子替代RNAi載體上的35S啟動子[9-10].選取番茄RFC1基因cDNA保守區(qū)域，獲得插入有番茄RFC1基因cDNA片段的pMeioDMC1質粒.番茄轉基因植物采用農桿菌介導的子葉節(jié)轉化方法獲得[11].

1.2.3 番茄RNA提取及實時熒光定量PCR分析

用植物總RNA提取試劑盒分別提取野生型番茄和轉基因番茄的葉片和不同時期花藥總RNA，在檢測完總RNA的完整性、純度和濃度后，按照Promega反轉錄試劑盒方法獲得番茄的cDNA.之后，使用ABI實時熒光定量PCR儀器做熒光定量PCR分析，將獲得的番茄cDNA樣品每個重復3次，相對表達水平通過2-ΔΔCT方法分析[12]，使用標準方差計算3次重復的波動性，使用的內參為番茄EF1-alpha基因.另外實驗過程使用的引物是按照番茄RFC1基因的cDNA序列設計的前后兩對引物，內參引物按照番茄EF1-alpha基因的cDNA序列保守區(qū)域設計的，引物序列見表1.

表1 基因水平檢測引物

1.2.4 花粉活性的亞歷山大紅染色觀察

剪取番茄的花序，在室溫條件下用卡諾固定液(V冰醋酸∶V無水乙醇=1∶3)固定過夜[13].在解剖鏡下，用解剖針將花序中已經開裂的花剝去，留取花藥發(fā)黃且尚未開裂的花苞.將其浸入含有亞歷山大紅染液的離心管內[13]，在室溫下染色4h.用解剖針將花藥剖開，除去雜質后加入少量的亞歷山大紅染液，蓋上蓋玻片，輕輕用指尖壓片后，在白光下鏡檢拍照.用指甲油封玻片(-20℃預冷).

1.2.5 展片法觀察花粉母細胞減數分裂染色體形態(tài)

實驗采用的展片法主要參考文獻[13]，稍作改動如下：剪取番茄的花序，在室溫條件下用卡諾固定液固定過夜.在解剖鏡下，用解剖針將花序中已經開裂的花和發(fā)黃的花藥去掉，將剩余的花序用酶解液(0.3% cellulase+0.3% pectinase+0.5% cytohelicase)在37℃下酶解30min.用鑷子將花苞從酶解液中取出，用0.01mol/L檸檬酸緩沖液清洗花苞3次，將盛有花苞的離心管放入冰盒里.將離心管內的花苞用鑷子取出，解剖針將番茄的6個花藥剖出后，除去雜質，用尖頭鑷子夾碎花藥，從而將花粉母細胞釋放到水中.將載玻片置于45℃的熱臺上，待載玻片上只剩下一層水膜時，在水膜區(qū)滴加20 μL 60%冰醋酸，并使得減數分裂期細胞在載玻片上分布均勻.等待30s后，在溶液的正上方用移液器滴加100μL卡諾固定液(-20℃預冷)，在熱臺上等待載玻片上液體晾干.每張載玻片用移液槍頭滴加1滴DAPI染色液，蓋上蓋玻片，避光染色10min后，在顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.6 卡寶品紅染色觀察四分體

剪取番茄花序，在室溫下用卡諾固定液固定過夜.將番茄花序用雙蒸水沖洗2～3次后，剝去含黃色花藥的花，取番茄花序最外圍的1～2個花苞到載玻片上.在解剖鏡下用解剖針剝出花藥后，除去雜質，向載玻片上滴加10μL雙蒸水，用解剖針的針尖將花粉母細胞從藥室中擠出，并涂布在載玻片上.自然風干載玻片后，用20μL移液槍頭向載玻片滴加一滴卡寶品紅溶液(原液A：3g堿性品紅溶于100mL 70%酒精中；原液B：取原液A 10mL加入到90mL 5%石炭酸水溶液中；原液C：取原液B 55mL，加入6mL冰醋酸和6mL 福爾馬林：38%的甲醛.取C液10～20mL加45%冰醋酸80～90mL，再加山梨醇1.8g，配成10%～20%濃度的石炭酸品紅液).染色2～3min后，加上蓋玻片，在顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.7 免疫熒光

實驗采用的展片法主要參考文獻[13]，稍作改動如下：取處于減數分裂時期的番茄花序于加有1mL 2%多聚甲醛的離心管中，在-0.1MPa，室溫固定15min，當觀察花序完全沉到管底后，用0.01mol/L檸檬酸緩沖液將固定好的花序清洗3次，每次3min.然后除去帶發(fā)黃花藥的花，將一個處于減數分裂時期的番茄花藥轉移到載玻片上，滴加10μL雙蒸水于花藥上.用解剖針的針尖將花粉母細胞從藥室中擠出，除去雜質后，用尖頭鑷子將剩余混合物質夾碎，蓋上蓋玻片，玻棒輕輕敲打蓋玻片.將敲打后的玻片放入液氮中冷凍1min，取出玻片用雙面刀片迅速將蓋玻片挑開，自然風干.將載玻片分別用以下溶液處理：Wash buffer Ⅰ溶液(由1×PBS+1% Triton X-100配置成，在室溫條件下浸泡60min)、Block buffer(由1×PBS+5% BSA+0.1% Tween20+1mmol/L EDTA配置成，在37℃條件下孵育30min)、一抗(Block buffer稀釋一抗后，每張載玻片滴加200μL后用封口膜封片，4℃過夜，其中ZYP1稀釋比例為1∶200，H2Ax稀釋比例為1∶100)、Wash buffer Ⅱ(由1×PBS+0.1% Tween20配置成，在室溫下清洗3次，每次15min)、Block buffer(在室溫下孵育60min)、二抗(Block buffer稀釋二抗后，每張載玻片滴加200μL后用封口膜封片，在37℃下孵育60min，二抗稀釋比例為1∶400)、Wash buffer Ⅱ(在室溫下清洗3次，每次15min).用吸水紙吸干多余的水，在每張載玻片上滴加1滴DAPI染色液，避光染色10min，在顯微鏡(Zeiss Axio Imager A2)下觀察并拍照.

2 結果與分析

2.1 RFC1的生物信息學分析

為了分析番茄RFC1基因在進化過程中的保守性，使用MEGA v5.0軟件的ML方法，構建了不同物種RFC1的進化樹(圖1，見第626頁).從中可以看出，除了經過近期基因組重復的物種(如大豆Glycinemax，猴面花Mimulus； 高粱Sorghum)，大多數物種中RFC1為單拷貝基因，暗示了RFC1基因功能比較保守.其中番茄與擬南芥RFC1基因都屬于真雙子葉植物，而代表單子葉植物的禾本科則比較遠.這個模式表明RFC1基因在真核生物的進化歷史中基本保持單拷貝，暗示其功能是高度保守的.序列比對表明番茄和擬南芥RFC1氨基酸序列一致性和相似性分別為62%和74%.運用MUSCLE v3.6軟件對選取不同物種的RFC1蛋白序列比對分析，發(fā)現(xiàn)植物中RFC1蛋白都具有BRCT結構域(BRCA1 C Terminus(BRCT) domain)、ATPase結構域和RFC結構域(圖2，見第626頁).BRCT結構域在植物體內可解除DNA分子交聯(lián)，推測具有內切酶活性[14]；ATPase結構域是超基因家族含有的ATPase單元[15]，在細胞內途徑中的蛋白重構中起作用，通過水解ATP從而改變分子構象；而RFC結構域在體內對RFC1的功能很重要[16].此外，RFC1蛋白的C端有一個相對保守區(qū)域，擬南芥中研究表明該結構域可能與其在減數分裂中的功能有關[9].

2.2 番茄RFC1在花藥不同發(fā)育時期的表達模式分析

基因的表達模式和功能有一定的相關性，為了研究SlRFC1的功能，本研究首先分析了SlRFC1的表達模式.提取野生型番茄六期早期花藥、六期花藥、七期花藥和葉子4個組織RNA，在番茄RFC1基因前端和末端設計引物，利用定量PCR的方法檢測RFC1在不同組織內的表達量.如圖3所示，SlRFC1基因在檢測的4個組織中均有表達，表明該基因可能是一個組成型表達的基因，與擬南芥中的報道相似[9].此外，SlRFC1在花藥中表達明顯高于葉子中的表達量，且在第六期的花藥中表達最高，該時期花藥中包含正在進行減數分裂的花粉母細胞.

2.3 番茄RFC1RNAi載體的構建和轉基因植株獲得

小鼠和植物中的研究表明RFC1是一個有絲分裂周期必需的基因，功能缺失突變致死[4，9，17-18]，在擬南芥中有研究利用弱突變體和減數分裂特異的基因沉默技術分析了RFC1在減數分裂重組中的重要功能[9].擬南芥中采用的是編碼減數分裂特異重組酶DMC1基因的啟動子，該基因在真核生物中相對保守[19]，本研究克隆了番茄的DMC1基因的啟動子，并構建了含RFC1的RNAi載體.利用農桿菌侵染番茄愈傷組織方法，將該載體轉入番茄并獲得陽性轉基因植株.并利用定量PCR技術分析了RFC1在陽性植株RFC1RNAi-1、RFC1RNAi-2和RFC1RNAi-3花藥中的表達量.如圖4所示，在檢測的3個不同發(fā)育時期的花藥中，SlRFC1基因在3個不同的轉基因株系中的表達量顯著低于對照(P<0.01).說明轉基因陽性植株中目的基因的表達量確實得到降低.

2.4 番茄RFC1RNAi陽性植株的形態(tài)表型分析

本研究選擇了兩個代表性的RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3株系進行了詳細分析.觀察RFC1RNAi陽性番茄的營養(yǎng)生長，發(fā)現(xiàn)RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3植株的營養(yǎng)生長與野生型類似(圖5(a)，見第628頁)，具有健康的葉子、莖和旺盛的長勢，與擬南芥中的結果類似[9].這說明RFC1RNAi轉基因并沒有影響到體細胞中的DNA復制和其他過程，同時也暗示番茄的DMC1基因可能也是減數分裂細胞特異表達的基因.為了進一步研究RFC1RNAi植株的育性是否正常，運用亞歷山大紅染色檢測了對照和轉基因植物的花粉活性.如圖5(b)所示，野生型花粉粒大小均勻，均能染成紅色，表明花粉均有活力.相對之下，RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3只有少量的花粉可以染成紅色，大部分染成藍色，表明只有少量有活力的花粉(圖5(b)).為了進一步調查花粉育性下降的原因，本實驗首先運用卡寶品紅溶液染色減數分裂的直接產物四分體，發(fā)現(xiàn)野生型中能夠觀察到4個均勻的小孢子(圖5(c))，而轉基因植株中觀察到有多分體(多于4個小孢子)現(xiàn)象，且產生了極小的異常小孢子(圖5(c))，表明轉基因植物中的減數分裂過程存在異常.

2.5 番茄RFC1RNAi植株花粉母細胞的減數分裂染色體形態(tài)觀察

為了研究RFC1RNAi植株減數分裂在哪個時期出現(xiàn)異常，本實驗通過染色體展片并用DAPI染色觀察減數分裂過程中的染色體形態(tài).如圖6所示，野生型和RFC1RNAi植株的染色體形態(tài)從細線期到雙線期觀察不到明顯的異常.終變期野生型番茄中可以形成12個二價體，而RFC1RNAi植株中不能形成典型的二價體，有多于兩條染色體相互纏繞的現(xiàn)象(圖6(a))，該表型類似于擬南芥rfc1突變體中觀察到的多價體[9].中期Ⅰ時，野生型番茄中二價體在紡錘體的牽引下，并列排列在細胞的赤道板上(圖6(b))；而在RFC1RNAi減數分裂細胞中，部分染色體看似正常二價體，在紡錘體的牽引下排列在赤道板上(圖6(b))，但是其他染色體為多價體，則不能很好地排列在赤道板上，彼此間相互牽連；另外，RFC1RNAi減數分裂細胞中有單價體現(xiàn)象.這些結果表明番茄RFC1是正常同源二價體形成所必需.

2.6 番茄RFC1RNAi-3植株中聯(lián)會復合體中央元件ZYP1定位分析

擬南芥的研究表明，rfc1-2突變體中聯(lián)會局部異常，主要表現(xiàn)粗線期染色體局部觀察不到聯(lián)會中央元件ZYP1的信號[9].本研究運用ZYP1的抗體進行免疫熒光實驗，結果顯示野生型同源染色體在粗線期完全聯(lián)會，ZYP1的信號與染色體的完全重合(圖7).與野生型相比，RFC1RNAi-3植株該時期染色體上的ZYP1蛋白定位觀察不到明顯的異常(圖7)，表明番茄RFC1的功能降低可能沒有影響到同源染色體之間的聯(lián)會.由于RFC1RNAi植物中仍有部分RFC1蛋白的存在，也許剩余RFC1仍能提供維護聯(lián)會的功能.

2.7 番茄RFC1RNAi植株中γH2AX蛋白質的定位分析

番茄RFC1RNAi植株中多價體現(xiàn)象暗示著重組異常，擬南芥的研究表明RFC1突變影響了正常重組的修復進程[9，18].減數分裂重組起始于DNA雙鏈的斷裂(Double Strand Break， DSB)[20]，磷酸化的組蛋白變體γH2AX可以用來指示斷裂的DSB[21]，而且該蛋白高度保守，不同植物間的同源蛋白具有相通的抗原性.本實驗室前期研究制備了可以檢驗擬南芥γH2AX的多克隆抗體.本實驗利用免疫熒光技術觀察了γH2AX蛋白質在野生型和RFC1RNAi-3植株染色體上的分布情況.已有的研究表明，DSB一般在細線期或偶線期過渡時期形成，粗線期基本完全修復.如圖8(見第630頁)所示，偶線期時，野生型和RFC1RNAi-3中該蛋白的定位沒有顯著差異，說明RFC1RNAi-3中能夠形成正常的DSB，暗示了重組沒有受到明顯影響.粗線期時，由于DSB基本完全修復，野生型中γH2AX信號顯著降低(圖8)，而RFC1RNAi-3植株γH2AX信號繼續(xù)存在，其降低明顯滯后，暗示DSB的修復進程延遲了.

3 討 論

RFC1基因在多數真核生物中為單拷貝，序列也高度保守，但它在絕大部分物種中的功能還沒有被研究過.因為其在有絲分裂DNA復制中具有重要功能.酵母、植物和動物中，RFC復合體的亞基突變，經常會導致有絲分裂時期的細胞死亡，阻礙了研究這些基因在減數分裂中的功能[4，9，17-18，22].前期通過尋找弱突變材料，并結合減數分裂特異的基因沉默技術，在擬南芥中研究了RFC1和另外一個DNA聚合酶POL2A在減數分裂重組中的重要功能[9，15，20].番茄是茄科植物，和十字花科的擬南芥分別屬于真雙子葉兩個最大的分支，因此，分析RFC1在番茄減數分裂中的功能可以拓展對其功能保守性的認識.本研究利用和擬南芥一樣的減數分裂特異基因沉默技術，分析了番茄RFC1同源基因在減數分裂的功能.結果表明降低RFC1的表達，會影響植物的育性、產生多價體，及延遲了DSB的修復等，與擬南芥中rfc1突變體的表型相似，說明番茄和擬南芥RFC1基因在減數分裂中的功能相對保守.

但是，擬南芥中的研究表明突變體在粗線期有局部不能聯(lián)會的現(xiàn)象，其原因可能是由于有些干涉敏感性的交換途徑形成受阻.番茄中的ZYP1免疫熒光結果沒有看到類似的情況，其原因其一可能是該轉基因植物還保留了部分RFC1功能，定量PCR結果也證明轉基因植物中仍然有少量RFC1的轉錄.另外一個原因可能是番茄和擬南芥在本身染色體結構上有差異.番茄的減數分裂研究很少，目前存在很多疑問；比如，還不清楚番茄減數分裂細胞一次能夠形成多少個DSB，有多少個DSB最終形成了交換，番茄和擬南芥聯(lián)會的機制是否有異同等.最近研究表明，與擬南芥相比，模式單子葉植物水稻有其特異的聯(lián)會復合體元件，有些元件的功能有分化，如水稻的聯(lián)會復合體中央元件ZEP1的突變反而增加重組頻率[23].總之，本研究首次分析了番茄RFC1基因在減數分裂中的重要功能，進而表明該基因的功能在進化距離較遠的不同物種中依然非常保守.

致謝: 感謝福建農林大學張亮生教授在進化樹構建上給予的幫助.

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LIU Jing1，#， WANG Ying1，#， WANG Hongkuan1， NI’Di’an2， MA Hong1， WANG Yingxiang1

(1. Institute of Plant Biology， School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China；2.TheEcologicalTechniqueandEngineeringCollege，ShanghaiInstituteofTechnology，Shanghai201418，China)

Meiosis is essential for eukaryotic sexual reproduction. Previous study showed thatArabidopsisRFC1 is required for normal meiotic recombination， but the role of its homologs in other species has not been reported. To study the tomato RFC1 homologue in meiosis， theinvivofunction ofSlRFC1 was investigated by silencing theSlRFC1 gene using a meiosis-specific DMC1 promoter in transgenic RFC1RNAiplants. Phenotypic analysis found that RFC1RNAiplants have obviously reduce pollen viability and fertility， and are abnormal in meiosis. Comparison of chromosome morphology of WT and RFC1RNAimeiocytes using chromosome spread with DAPI staining showed that， unlike wild type diakinesis and metaphaseⅠmeiocytes with 12 bivalents(pairs of associated homologous chromosomes)， the RFC1RNAimeiocytes formed multivalents at similar stages， indicating non-homologous association. Immunolocalization of DNA double stranded break(DSB) marker γH2AX showed persistent signals in RFC1RNAipachytene chromosomes compared with WT， providing further evidence for abnormal recombination in RFC1RNAi. In conclusion， this is the first time that the tomato DNA replication factor RFC1 is shown to be required for meiotic recombination， using meiosis-specific gene silencing. SinceArabidopsisand tomato belong to two difference clades of Rosids and Asterids among eudicots， respectively， our results also reveal the RFC1 function in meiotic recombination is conserved in meiosis among evolutionarily different angiosperm species.

meiosis； DNA replication factor；Solanumlycopersicum； meiotic specific RNAi

0427-7104(2016)05-0623-09

2016-01-30

國家自然科學基金面上項目(31570314)；荷蘭Rijk Zwaan種業(yè)公司項目

劉 靜(1989—)，女，碩士研究生；#：同等貢獻；王應祥，男，研究員，通訊聯(lián)系人，E-mail：yx_wang@fudan.edu.cn.

Q 5

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