王亞倩，石 超，霍克克

(復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

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結(jié)核分枝桿菌ClpX與人UBC9蛋白的相互作用抑制宿主細胞增殖

王亞倩，石 超，霍克克

(復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

ClpX是原核生物中高度保守的基因，其編碼絲氨酸蛋白酶ClpXP的ATP結(jié)合亞基，具有底物識別及ATP水解活性.ClpX參與調(diào)控細胞周期與應激反應，且為多種病原微生物致病所必需，但目前相關(guān)研究仍非常有限.為了探索結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)ClpX在感染宿主細胞過程中的作用機制，本文首先通過酵母雙雜交技術(shù)在人類淋巴細胞cDNA文庫中篩選得到了一個新的與結(jié)核ClpX相互作用的蛋白UBC9，并利用GST pull-down和Co-IP技術(shù)證實了這兩個蛋白在體外和體內(nèi)相互作用的特異性.將ClpX轉(zhuǎn)染HEK293T細胞過表達，RNA干擾與回復實驗進一步證實了ClpX蛋白能夠通過與UBC9的相互作用抑制宿主細胞的增殖.

結(jié)核分枝桿菌； ClpX； UBC9； 蛋白質(zhì)相互作用； 細胞增殖

結(jié)核病(Tuberculosis)，作為全世界最致命的疾病之一，嚴重威脅人類健康.世界衛(wèi)生組織(WHO)最新數(shù)據(jù)顯示，僅2013年就有超過900萬人發(fā)病，其中150萬人死亡.結(jié)核病因結(jié)核分枝桿菌(以下簡稱結(jié)核桿菌)感染發(fā)生，據(jù)估算，全球現(xiàn)有超過6億人感染結(jié)核桿菌，其中約10%最終發(fā)展為結(jié)核病[1].結(jié)核桿菌與宿主免疫系統(tǒng)間的交互最終決定感染者發(fā)病與否：一方面，結(jié)核桿菌通過減緩生長速度，降低物質(zhì)和能量需求，以藏匿于宿主體內(nèi)；或作用于宿主，減弱甚至抑制宿主細胞對它的殺傷.另一方面，宿主也激發(fā)免疫機制反作用于結(jié)核桿菌，譬如通過溶酶體殺滅、凋亡感染了結(jié)核桿菌的細胞，或呈遞結(jié)核桿菌抗原特異性的T細胞，促進機體對結(jié)核桿菌的特異性清除[2].

蛋白酶對于結(jié)核桿菌的致病性和對巨噬細胞中的脅迫耐受有著至關(guān)重要的作用[3].結(jié)核桿菌ClpX(ClpX， Rv2457c)屬于AAA+ATP酶家族，具有底物識別以及ATP水解活性，可特異性地識別并解聚或重塑靶蛋白；也可與具蛋白水解酶活性的ClpP結(jié)合形成ClpXP異源二聚體，特異性地降解目的蛋白[4-7].ClpX是結(jié)核桿菌存活與致病所必需，感染宿主后，ClpX下調(diào)自身細胞分裂蛋白FtsZ的活性，參與調(diào)控結(jié)核桿菌自身的細胞分裂[8]].此外，作為細胞膜組分[9-11]，ClpX也可能參與結(jié)核桿菌與宿主的免疫互作，有潛力成為評定結(jié)核桿菌毒力的優(yōu)良靶標.

我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌來源的ClpX具有抑制宿主細胞增殖的能力，并且利用酵母雙雜交技術(shù)，在人cDNA文庫中篩選到一個能與ClpX直接相互作用的蛋白——UBC9(UBE2I，NM_003345.4，GI：342307071).在本文中，我們將借助分子和細胞生物學方法，嘗試評估ClpX對細胞增殖的影響，并探討其作用于宿主的遺傳調(diào)控機理.

1 材料與方法

1.1 材料

SfiⅠ限制性內(nèi)切酶、dNTP Mix購自TaKaRa公司.FastPfu和Taq酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司.Ligation High Kit購自TOYOBO公司.Agarose為Biowest公司產(chǎn)品.TRYPTONE，YEAST EXTRACT購自O(shè)xoid公司.Bacto-Agar、Yeast Nitrogen Base購自BD公司.氨基酸混合物Dropout、鮭魚精ssDNA購自北京博大泰克公司.X-gal、Triton X-100，HEPES，Nodient P-40，IPTG，Tween-20均購自于Amresco公司.氨基-1，2，4-三唑(3-AT)、PEG3350、鼠抗Myc、Flag、GST、6His的單克隆抗體和巰基乙醇，以及FACS流式細胞術(shù)染色試劑碘化丙錠(PI)均購自Sigma & Aldrich公司.

GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)和酵母雙雜交人淋巴細胞cDNA文庫購自Clontech公司.質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司.酵母質(zhì)粒抽提試劑盒、細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清和胰酶Trypsin-EDTA(0.25%)購自上海索萊寶生物科技有限公司.Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司.一次性細胞培養(yǎng)皿購自Corning.PVDF膜、化學發(fā)光底物檢測試劑(ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate， Cat. No. WBKLS0100)均購自Millipore公司.厚濾紙購自Biorad公司.蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail tables， complete EDTA-free)購自Roche.Protein G beads購自GE公司.Glutathione Sepharose 4B購自于Pharmacia Biotech公司.鼠抗GAPDH的單克隆抗體購自Abmart公司.HRP交聯(lián)的兔抗鼠二抗購自Rockland公司.X光片為Kodak公司產(chǎn)品.蛋白預染分子量標準為Thermo Scientific公司產(chǎn)品.雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒是Promega公司產(chǎn)品.其他實驗所用試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.表1為實驗中所用引物列表.

表1 實驗所用引物

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK293T細胞在DMEM+10% FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng).每隔2～3d換一次新鮮培養(yǎng)液.當細胞的鋪滿率達到70%以上后，用0.25%胰酶消化，傳代繼續(xù)培養(yǎng).

細胞的瞬時轉(zhuǎn)染：細胞計數(shù)后接種于細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)18～24h.當細胞的鋪滿率達到70%后，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，37℃，5% CO2培養(yǎng)24～72h收細胞.

1.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

該實驗每一實驗組均設(shè)置3個重復，同時設(shè)置對照組，每個樣品檢測細胞數(shù)目約為10000個.為防止實驗時產(chǎn)生大量的細胞碎片，所有細胞經(jīng)0.25%胰酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，離心收集細胞，用PBS(1.38mmol/L NaCl，0.027mmol/L KCl，0.01mmol/L Na2HPO4，0.018mmol/L KH2PO4，pH 7.4)清洗一遍，加入預冷的70%乙醇固定細胞，用0.1% FCS的PBS洗滌3次，用1mL含20μg/mL PI的PBS重懸細胞，室溫避光放置20min，500目(28μm)篩過濾至流式管中，標記，流式細胞儀(BD FACS Calibur)檢測細胞DNA情況，F(xiàn)lowjo 7.6軟件分析細胞周期.

1.4 酵母雙雜交實驗

構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-ClpX并轉(zhuǎn)化入酵母受體菌AH109，經(jīng)對酵母轉(zhuǎn)化子檢測無自激活反應后，將其制備成酵母轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞.用化學轉(zhuǎn)化方法將pACT2-淋巴細胞cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已含有誘餌質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細胞，涂布SD-Leu-Trp-His+5 mM 3AT(SD-3)平板，30℃培養(yǎng)2～3d，用無菌絨布對SD-3平板上長出的轉(zhuǎn)化子進行影印清除后，繼續(xù)培養(yǎng)至陽性菌落長出.將陽性菌落分別轉(zhuǎn)接到SD-Leu-Trp(SD-2)和SD-Leu-Trp-His-Ade(SD-4)平板上進行培養(yǎng)，以檢測HIS3和ADE2報告基因是否被激活.同時將陽性菌落接種于后濾紙上，液氮冷凍處理后將濾紙放入含有X-Gal的Z Buffer中檢測LacZ報告基因的激活情況.挑取能同時激活HIS3、ADE2和LacZ3個報告基因的陽性菌落，抽提酵母陽性克隆質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴增，對陽性克隆質(zhì)粒DNA測序及BLAST分析.最后將篩選到的陽性克隆質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細胞，再次檢測對上述3個報告基因的激活情況，以確認兩者的蛋白相互作用.

1.5 GST pull-down體外結(jié)合實驗

構(gòu)建pGEX-5x-1-UBC9和pET-28a-ClpX表達載體，分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)以表達GST-UBC9以及6His-ClpX融合蛋白.同時轉(zhuǎn)化pGEX-5x-1和pET-28a空載體作為陰性對照.

GST pull-down：將結(jié)合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B懸浮于500μL NETN(100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl pH 7.0，0.5% Nonidet P-40，1mmol/L PMSF)緩沖液中，加入50μL純化的6His-ClpX融合蛋白，于4℃結(jié)合4～8h.離心后沉淀用500μL buffer H(20mmol/L Tris-HCl pH 7.7，50mmol/L KCl，20% Glycerol，0.1% Nonidet P-40，0.007%β-巰基乙醇)洗滌3次.在沉淀中加入20μL 1×SDS蛋白上樣緩沖液，在沸水浴中變性5min，離心后取上清作SDS-PAGE凝膠電泳.以mouse Anti-His的單克隆抗體進行Western blot檢測.

1.6 體內(nèi)結(jié)合實驗(Co-IP)

將pCMV-Myc-ClpX和pEF-Flag-UBC9兩個重組質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中.轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，加入1mL細胞裂解液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCL，1% NP-40，1mmol/L DTT，5mmol/L EDTA，使用前加入蛋白酶抑制劑)，4℃裂解1h，從中預留10μL加入2×蛋白電泳上樣緩沖液作為陽性對照，其余細胞裂解液平均分成2份，其中1份樣品中加入Myc標簽抗體1μg，另1份樣品中加入mouse IgG 1μg作為陰性對照，將兩個樣品同時在4℃水平搖床上低速搖動過夜，次日向每個樣品中各加入20μL protein G瓊脂糖凝珠，4℃水平搖床上低速搖動6～8h，離心后吸去上清，用細胞裂解液洗滌瓊脂糖凝珠抗原抗體復合物3次，吸干珠子上方的水層后，加入20μL 1×蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5min，離心后對上清用Flag抗體進行Western blot檢測.

1.7 細胞增殖檢測

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，轉(zhuǎn)染18h后充分消化細胞，稀釋后種入96孔板內(nèi).使用與酶標儀匹配的96孔板按照每孔1000個細胞(培液100μL)計算細胞總量，并按照測量天數(shù)作為所分細胞孔數(shù)的倍數(shù)，每組設(shè)3個重復.待3h左右細胞基本貼壁后每孔加入10μL MTT顯色劑(5mg/mL)進行顯色反應，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h后，吸出培養(yǎng)基，在每孔中加入100μL DMSO，振蕩混合10min，使藍紫色沉淀充分溶解，在490nm測定吸光值，以確定細胞實際的起始密度，作為生長相對零點.按照同樣的方法每隔24h測量一次，連續(xù)測定3～4d.等所有數(shù)據(jù)收集后，用Excel繪出圖表.

1.8 螢光素酶信號檢測

Luciferase報告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)活性的一種報告系統(tǒng)，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法.本實驗所用的Luciferase報告基因質(zhì)粒中含有5個拷貝的NF-κB(Nuclear Factor κB)應答元件，可與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子相互作用而激活螢光素酶報告基因luc2P的轉(zhuǎn)錄，通過測定螢光素酶的表達量來檢測對應轉(zhuǎn)錄因子的活性.

接種細胞至24孔板培養(yǎng)過夜，將3種質(zhì)粒按照一定的比例共轉(zhuǎn)染細胞(目的基因質(zhì)粒或空載體對照質(zhì)粒，600ng；Luciferase報告基因質(zhì)粒，100ng；Renilla質(zhì)粒，10ng)，37℃，5% CO2，繼續(xù)培養(yǎng)24～48h后，用PBS洗滌1次，每孔加100μL 1×PLB細胞裂解液，室溫振蕩裂解15min后把裂解液吸入1.5mL的離心管中，離心取上清.

Luciferase檢測分析：按照Promega公司Dual Luciferase reporter assay system操作手冊進行操作，用Promega公司的發(fā)光檢測儀上機檢測；每個檢測孔(96孔板)內(nèi)加入20μL細胞裂解液上清，先在每孔添加100μL LARⅡ測定Firefly Luciferase活性，再添加100μL Stop&Glo試劑，以測定Renilla Luciferase活性.每個樣品做3個重復孔，用Excel軟件繪制柱形圖，分析實驗結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 ClpX抑制宿主細胞增殖

為了檢測ClpX對宿主細胞增殖的影響，我們將pCMV-Myc-ClpX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞使其進行過表達，并利用MTT法檢測細胞的生長速率.結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pCMV-Myc空質(zhì)粒的陰性對照相比，過表達ClpX會顯著減緩細胞的增殖(圖1(a)).經(jīng)過24，48和72h培養(yǎng)后，過表達ClpX的HEK293T細胞數(shù)量分別只有對照組的96.0%(P=3.0×10-2)，92.3%(P=3.5×10-4)和85.2%(P=5.7×10-6).

我們隨后對該組細胞進行了流式細胞儀檢測，以觀察ClpX對細胞周期的影響.結(jié)果表明，與對照相比，在過表達ClpX的HEK293T細胞中，處于G2期細胞的比例由10.57%上升至14.35%(P=3.7×10-2)，見圖1(b)，提示ClpX的表達會導致HEK293T細胞G2期阻滯，并可能因此抑制細胞增殖.

2.2 ClpX與人UBC9間存在直接相互作用

為探索結(jié)核分枝桿菌在感染宿主并激活免疫反應的過程中，作為病原體的蛋白酶亞基ClpX是否有可能通過與宿主蛋白間的直接相互作用而行使激活免疫系統(tǒng)的分子功能.我們采用酵母雙雜交技術(shù)，以ClpX為誘餌蛋白(bait)篩選人類免疫淋巴細胞文庫，以期獲得人類細胞中能夠與ClpX直接相互作用的蛋白.通過酵母雙雜交文庫篩選獲得2個陽性克隆，經(jīng)BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)均編碼同一蛋白，人UBC9.經(jīng)過進一步的回轉(zhuǎn)驗證實驗，結(jié)果顯示構(gòu)建在酵母雙雜交獵物(prey)載體pGADT7上的UBC9與構(gòu)建在誘餌載體pGBKT7上的ClpX共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109后能有效激活報告中全部3個報告基因ADE2、HIS3和LacZ，且并未檢測到UBC9存在自激活效應，證實ClpX與UBC9這兩個蛋白之間存在直接的物理相互作用(圖2(b)).

為了進一步檢驗ClpX與UBC9兩者間的相互作用，我們進行了體外GST pull-down實驗，并證實經(jīng)原核表達的6His-ClpX與GST-UBC9融合蛋白間在體外也能發(fā)生直接的相互作用(圖2(b)).同時，為了檢驗這兩個蛋白在宿主細胞內(nèi)是否存在相互作用，我們又在HEK293T細胞內(nèi)進行了免疫共沉淀實驗.結(jié)果顯示利用Anti-Myc抗體能夠共沉淀Flag-UBC9，使其可被Anti-Flag抗體檢測(圖2(c)).以上這些結(jié)果均證實了ClpX與UBC9蛋白之間存在直接的物理相互作用，ClpX也因此有可能通過UBC9調(diào)控人類細胞.

2.3 ClpX下調(diào)內(nèi)源性UBC9蛋白表達

我們在進行上述Co-IP實驗中意外發(fā)現(xiàn)，相較于單獨過表達UBC9，同時過表達ClpX和UBC9時，UBC9過表達水平顯著下調(diào)(圖3).結(jié)合ClpX編碼蛋白水解酶這一信息，我們推測ClpX能夠通過物理結(jié)合UBC9并下調(diào)其蛋白表達.為了驗證這一假設(shè)，我們分別在轉(zhuǎn)染了pCMV-Myc-ClpX(過表達ClpX)和pCMV-Myc空載體(空白對照)的HEK293T細胞中，使用Western blot檢測細胞內(nèi)源性UBC9的表達量，實驗結(jié)果如圖3所示：過表達ClpX后，細胞內(nèi)源性UBC9表達量顯著下調(diào)，從而驗證了我們的推測.

2.4 ClpX通過UBC9調(diào)控細胞增殖

作為細胞中唯一參與SUMO化(SUMOylation)的泛素接合酶E2，UBC9在SUMO化修飾介導的細胞通路中行使重要功能，參與調(diào)控細胞生長，腫瘤發(fā)生等生物過程.為了檢測ClpX是否也能通過下調(diào)UBC9的蛋白表達抑制細胞增殖，我們使用人工合成的shRNA沉默細胞內(nèi)源性UBC9的蛋白.在HEK293T細胞中，sh205，sh317兩條識別不同靶序列的shRNA被證明能夠有效地下調(diào)內(nèi)源性UBC9的表達(圖4(a)，見第592頁).且我們發(fā)現(xiàn)沉默UBC9和過表達ClpX的HEK293T細胞表現(xiàn)相同，細胞增殖被顯著抑制，并表現(xiàn)出明顯的G2期阻滯(圖4(b)～(d)).此外，在過表達ClpX的HEK293T細胞中，如果同時過表達UBC9能夠顯著逆轉(zhuǎn)因ClpX過表達引起的細胞增殖抑制現(xiàn)象(圖4(e)).這些結(jié)果均提示ClpX調(diào)控細胞增殖依賴與UBC9的相互作用.

2.5 過表達結(jié)核桿菌ClpX增強NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性

結(jié)核桿菌感染能夠激活宿主的免疫系統(tǒng)，Toll樣受體(TLRs)介導最初的細胞免疫激活反應，發(fā)揮殺傷最初侵入的結(jié)核桿菌的功能.TLRs能夠激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，因此調(diào)控細胞內(nèi)免疫反應依賴的一系列免疫調(diào)節(jié)因子(如IL8、IL-1β、TNF-α、Bcl-2等)的表達，最終殺滅侵入體內(nèi)的結(jié)核桿菌[2，12-13].在以上工作中我們發(fā)現(xiàn)了ClpX與UBC9在細胞內(nèi)存在特異性相互作用，并且ClpX可抑制宿主細胞UBC9的表達，并因此抑制宿主細胞的增殖.已知UBC9作為SUMO化修飾的關(guān)鍵酶之一，能通過參與SUMO化過程而可逆的調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子進出細胞核的行為及轉(zhuǎn)錄活性.為探究結(jié)核桿菌ClpX蛋白進入細胞后宿主的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子能否響應，我們采用雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測了過表達ClpX后HEK293T細胞中內(nèi)源性NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性.結(jié)果顯示，相較于轉(zhuǎn)染了pCMV-Myc空載體的對照組細胞，轉(zhuǎn)染了pCMV-Myc-ClpX(過表達ClpX)的實驗組中NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性顯著增強(圖5).

3 討 論

病原微生物與宿主細胞間復雜的相互作用是感染性疾病發(fā)生的基礎(chǔ).感染發(fā)生后，微生物及宿主細胞的多種信號傳導途徑以及基因表達譜常會發(fā)生巨大變異，從而激活細胞內(nèi)的一系列免疫應答反應，引起細胞增殖、分化、炎癥、凋亡等生物過程的異常，進而引發(fā)疾病[13].而病原微生物的分泌蛋白及細胞表面組分在這一過程中起著至關(guān)重要的作用.質(zhì)譜分析顯示，結(jié)核桿菌H37Rv的ClpX蛋白存在于膜蛋白碎片和全細胞裂解液[9-11]，這提示，作為結(jié)核桿菌細胞膜組分的ClpX可能在侵染宿主細胞、與宿主的免疫互作以及在宿主細胞中長期潛伏和持留的過程中產(chǎn)生影響.

ClpX在原核生物中高度保守，除經(jīng)典的模式生物大腸桿菌(Escherichiacoli)外，傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)等致病菌中均存在高度保守的ClpX(identity>60%).尤其在約151～225位的氨基酸殘基，AAA+(ATPases Associated with a wide variety of cellular Activities)功能結(jié)構(gòu)域所處的位置，一致性超過75%(圖6)，蛋白結(jié)構(gòu)的高度相似性暗示結(jié)核桿菌與近源種間的ClpX分子功能具有保守性.研究表明，在大腸桿菌中過量表達結(jié)核桿菌的ClpX會抑制宿主菌的生長速度[3]，此外，在結(jié)核桿菌自身體內(nèi)過量表達ClpX也會延遲菌體的生長和分裂[8].本文的研究發(fā)現(xiàn)了ClpX能夠直接結(jié)合人源UBC9進而下調(diào)其蛋白表達水平，這直接阻滯了宿主的細胞周期并表現(xiàn)為細胞增殖緩慢.

UBC9是細胞內(nèi)介導蛋白質(zhì)泛素化降解的接合酶(E2)之一，可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解而調(diào)控細胞內(nèi)的多種生物學過程.UBC9也是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一個能參與SUMO化修飾的E2，因此在SUMO化修飾介導的細胞通路中行使著重要功能.大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中UBC9表達量升高，如果人為抑制UBC9的表達就能抑制腫瘤細胞的增殖[14-15].SUMO化修飾能可逆的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子進出細胞核的行為及轉(zhuǎn)錄活性，全局調(diào)控細胞蛋白質(zhì)組，從而控制細胞周期、基因表達及DNA合成等最基礎(chǔ)的生命活動[16].因此，我們推測結(jié)核桿菌ClpX下調(diào)UBC9對宿主細胞的影響并不僅限于抑制細胞增殖，還應調(diào)控其他基礎(chǔ)的細胞功能，影響多種細胞內(nèi)的信號通路.NF-κB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號通路在宿主對多種病原微生物感染所激發(fā)的免疫應答反應(包括先天性免疫和獲得性免疫)中都具有重要作用[13].PARP1、PIAS-gamma和UBC9共同參與的SUMO化修飾可以調(diào)節(jié)NEMO亞基(IKKγ， NF-κB必需的調(diào)節(jié)亞基)的進出核反應[17]，因此UBC9表達量的變化勢必會影響到NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性及其所調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導通路的進程.

本研究證實了結(jié)核桿菌ClpX可與人源UBC9蛋白發(fā)生直接的物理相互作用，激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性.由于被激活的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子可上調(diào)下游編碼基因的表達量，包括一系列趨化因子(Chemokine)、細胞因子(cytokines， CK)、粘附分子(Adhesion Molecules， AMs)、促進炎癥反應(inflammatory)的酶類、凋亡抑制因子(inhibitors of apoptosis)等，因此這些成分可以促進宿主被病原體感染的部位產(chǎn)生炎癥，使吞噬細胞呈遞至感染部位，對病原體進行吞噬[13]，同時，NF-κB的激活在多種細胞中都可以阻斷TNF誘導的細胞凋亡[18-19].病原體在最初入侵宿主細胞時對宿主細胞產(chǎn)生的先天性免疫反應的調(diào)節(jié)在建立早期的感染、長期的持留和潛伏中都起重要作用[20].因此，結(jié)核桿菌ClpX可能是一種保守的毒力因子，通過與UBC9的蛋白相互作用，調(diào)控SUMO化修飾所參與的相關(guān)信號通路.其中包括激活宿主NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性從而激發(fā)宿主的先天性免疫應答反應，實現(xiàn)對宿主的侵染以及在巨噬細胞中的持留.本文對于結(jié)核桿菌ClpX所引起的宿主表型與功能的變異，以及宿主響應ClpX表達的相關(guān)信號通路的研究結(jié)果，為進一步深入研究結(jié)核桿菌及其近源的病原微生物與宿主之間相互作用的機理提供了新的線索.

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Mycobacterium tuberculosis ClpX Interacts with Human UBC9 and Inhibits the Proliferation of Host Cell

WANG Yaqian， SHI Chao， HUO Keke

(State Key Laboratory of Genetic Engineering， School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China)

ClpXP serine protease is well conserved in prokaryotes， consists of ClpX and ClpP. ClpX with ATP binding and hydrolysis activity， involved in regulation of cell cycle and the stress response， is essential for the pathogenicity in a variety of microorganisms includingMycobacteriumtuberculosis. However， little was known about the underlying molecular basis. In order to reveal the mechanisms of howMycobacteriumtuberculosisworking in the infected host cells through ClpX， we performed a yeast two hybrid screening from human lymphocytes cDNA library to explore new proteins interacting with ClpX. An ubiquitin ligase E2 protein， UBC9 was identified and its specific protein interaction with ClpX was confirmed by GST pull-down and co-IP assay. We next demonstrated that cell proliferation was inhibited in HEK293T cells with overexpressed ClpX protein or silenced UBC9 protein， whilst an overexpressed UBC9 could eliminate the negative regulation of cell proliferation.

Mycobacteriumtuberculosis； ClpX； UBC9； protein interaction； cell proliferation

0427-7104(2016)05-0587-09

2016-02-29

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2013CB531603)；國家科技重大專項(62008ZX10003-006)

王亞倩(1985—)，女，碩士研究生；霍克克，男，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail：kkhuo@fudan.edu.cn

Q 752

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