朱清麗，譚艷萍，柯紅梅，孫全明，李 寧

(安康市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，安康 725000)

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HPLC法考察肌苷等4種對照品溶液的穩(wěn)定性及不確定度分析

朱清麗，譚艷萍，柯紅梅，孫全明，李 寧

(安康市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，安康 725000)

目的 考察被測對照品溶液的穩(wěn)定性。方法 用高效液相色譜法對肌苷、吡拉西坦、甲硝唑及曲安奈德4種對照品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性考察，并采用不確定度對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 肌苷對照品溶液使用期限為15d；吡拉西坦對照品溶液穩(wěn)定性最好，使用期限為60d；甲硝唑?qū)φ掌啡芤狠^為穩(wěn)定，使用期限為21d；曲安奈德對照品溶液穩(wěn)定性較差，使用期限為7d。結(jié)論 根據(jù)穩(wěn)定性考察結(jié)果，為建立有效的質(zhì)量控制方法提供參考。

HPLC；對照品溶液；穩(wěn)定性；不確定度

《中國藥典》[1]中沒有規(guī)定對照品溶液的有效期限，為了節(jié)約工作成本、提高工作效率，本文根據(jù)《藥品GMP指南》[2]相關(guān)技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)[3]，并參考有關(guān)文獻(xiàn)[5-9]，結(jié)合日常檢驗(yàn)工作的使用率，挑選肌苷、吡拉西坦、甲硝唑及曲安奈德4種對照品溶液，按照《中國藥典》方法，通過所測的含量來考察對照品溶液的穩(wěn)定性[5]以及采用不確定度對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，為建立有效的質(zhì)量控制方法提供參考，從而規(guī)定內(nèi)部使用的有效期限、規(guī)范對照品溶液的管理。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1200型高效液相色譜儀，G1314B檢測器，Agilent1200 色譜工作站(美國安捷倫公司)；Nexpower1000純水超純水器(北京普析通用儀器公司)；TG332A分析天平，KQ-250DE超聲波清洗器(湘儀天平儀器廠)；TCLBCD-165KF3型冰箱(TCL集團(tuán)有限公司)。

1.2 試藥 甲硝唑?qū)φ掌?批號100191-200606，99.9%，中國食品藥品檢定研究院)；肌苷對照品(批號140669-201104，99.1%，中國食品藥品檢定研究院)；吡拉西坦對照品(批號100386-200702，中國食品藥品檢定研究院)；曲安奈德對照品(批號：100055-201103，中國食品藥品檢定研究院)；水為超純水(自制)；甲醇為色譜純(Sigma-Aldrich公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：AgilentC18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水；柱溫：30 ℃；流速：1.0mL·min-1。見表1[1]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 肌苷：取肌苷對照品10mg，精密稱定，置于50mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取溶液5mL，置于50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得[1]。

表1 色譜條件

Tab.1Chromatographicconditions

品名甲醇-水檢測波長/nm進(jìn)樣量/μL肌苷10∶9024820吡拉西坦10∶9021010甲硝唑20∶8032010曲安奈德53∶4724020

吡拉西坦:取吡拉西坦對照品10mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

甲硝唑:取甲硝唑?qū)φ掌?2.5mg，精密稱定，置于50mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

曲安奈德:取曲安奈德對照品7.5mg，精密稱定，置于25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取溶液5mL，置于50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

將配制的供試品溶液置于棕色量瓶中存放，貯存在2～8 ℃冰箱內(nèi)(量瓶一定要密塞且溶液取用后立即放入冰箱中保存[6])。檢測前取出部分裝入液相小瓶，放至室溫。

2.2.2 對照品溶液的制備 同2.2.1項(xiàng)下各供試品溶液的制備。

2.3 測定 按照各品種項(xiàng)下要求進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)，滿足實(shí)驗(yàn)要求后進(jìn)行測定。結(jié)果見圖1。

圖1HPLC圖

A.肌苷；B.吡拉西坦；C.甲硝唑；D.曲安奈德

Fig.1HPLCchromatograms

A.inosine；B.derbyoflevetiracetam；C.metronidazole；D.triamcinoloneacetonide

2.4 計(jì)算 按照外標(biāo)法計(jì)算其測定含量，代入量瓶及移液管的校正值，所有計(jì)算結(jié)果均保留小數(shù)點(diǎn)后2位。

2.5 各供試品溶液的測定結(jié)果 見表2～5。

表2 肌苷供試品溶液的測定結(jié)果

Tab.2Thedeterminationresultsofinosinetestsolution

時間點(diǎn)/d供試品溶液Ⅰ/%供試品溶液Ⅱ/%平均值/%RSD/%與0點(diǎn)的絕對值差0100.00100.00100.00100.00100.000.000.00798.7598.8299.0199.3898.990.281.011598.4298.2998.1698.2798.280.111.722197.9497.7797.9498.0497.920.112.083094.3794.2594.0194.0794.180.185.82

表3 吡拉西坦供試品溶液的測定結(jié)果

Tab.3Thedeterminationresultsofthepiracetamsamplesolution

時間點(diǎn)/d供試品溶液Ⅰ/%供試品溶液Ⅱ/%平均值/%RSD/%與0點(diǎn)的絕對值差0100.00100.00100.00100.00100.000.000.007100.82100.75100.98100.97100.880.110.8815101.14101.18101.03100.86101.050.141.0521100.83100.76100.79100.78100.790.030.7930100.42100.34100.46100.22100.360.110.3645100.12100.08100.10100.06100.090.030.096099.8299.87100.02100.1999.980.170.02

表4 甲硝唑供試品溶液的測定結(jié)果

Tab.4Thedeterminationresultsofthemetronidazoletestsolution

時間點(diǎn)/d供試品溶液Ⅰ/%供試品溶液Ⅱ/%平均值/%RSD/%與0點(diǎn)的絕對值差0100.00100.00100.00100.00100.000.000.007100.28100.28100.99100.93100.620.390.6215101.07100.76101.00100.90100.930.130.9321101.80101.85101.56101.59101.700.141.7030102.99103.03102.42102.45102.720.322.72

表5 曲安奈德供試品溶液的測定結(jié)果

Tab.5Thedeterminationresultsofthetriamcinoloneacetonidetestsolution

時間點(diǎn)/d供試品溶液Ⅰ/%供試品溶液Ⅱ/%平均值/%RSD/%與0點(diǎn)的絕對值差0100.00100.00100.00100.00100.000.000.007100.9399.91100.31101.16100.580.570.5815104.68104.58103.88104.13104.320.364.32

根據(jù)GMP[2]中要求，在0時間點(diǎn)，每份對照品溶液互相復(fù)核的結(jié)果不得超過2.0；在每個分析測試點(diǎn)，對照品溶液活性成分的含量與0點(diǎn)的差異不得超過2.0。

3 不確定度的評定及對測量結(jié)果的評價

對測量結(jié)果進(jìn)行不確定的評定，從而進(jìn)一步驗(yàn)證測定結(jié)果的有效性。

用趨勢分析法和方差分析法來評估不穩(wěn)定性引入的不確定度分量，用趨勢分析法判斷對照品是否穩(wěn)定，用方差分析法計(jì)算不穩(wěn)定性引入的不確定度。

3.1 數(shù)學(xué)模型

式中，W為供試品溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；As為供試品溶液的峰面積；ms為供試品溶液的稱樣量(g)；Vs為供試品溶液的稀釋體積(mL)；mt為對照品溶液的稱樣量(mg)；At為對照品溶液平行進(jìn)樣5次的峰面積平均值；Vt為對照品溶液的稀釋體積(mL)；P為對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3.2 不確定度的主要來源分析 見圖2[6]。圖2中各種隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度分量，采用測量重復(fù)性進(jìn)行評定。

圖2 按照屬性分類的不確定來源

Fig.2Thesourceofuncertaintyintheclassificationofattributes

3.3 不確定度分量計(jì)算

3.3.1 測量重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 對重復(fù)性條件下同一批次的多個對照品溶液進(jìn)行測量，得到的校正因子數(shù)值見表6。

測量的重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，按照貝賽爾公式計(jì)算：

表6 4種對照品溶液的校正因子數(shù)值

Tab.6Correctionfactorvaluesofthe4controlsolutions

對照品序號肌苷(×10-5)吡拉西坦(×10-5)甲硝唑(×10-5)曲安奈德(×10-5)11.92248.71703.27092.320021.92478.68803.24542.311331.93928.72673.28082.340441.91188.72103.29772.322251.96978.73503.29612.327261.94068.44423.34262.330771.94188.69823.3082—81.96698.77753.3294—91.97038.78193.3329—101.93478.84253.3273—11—8.8301——12—8.7638——平均值1.94128.73553.30312.3353

注：—表示未進(jìn)行測定計(jì)算。

通常測量校正因子2次，取平均值進(jìn)行計(jì)算，測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

結(jié)果見表7。

表7 4種對照品溶液測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果

Tab.7Therelativestandarduncertaintyofthemeasurementrepeatabilityofthefourreferencesolutions

項(xiàng)目肌苷吡拉西坦甲硝唑曲安奈德 s(f)1.7012×10-7 7.7458×10-7 3.1079×10-7 9.945×10-8 urel(frep)6.20×10-3 6.27×10-3 6.65×10-3 3.02×10-3

當(dāng)稱樣量為10.00mg時，urel(mt)=urel(mt)=0.0173/10=1.73×10-3。

3.3.3 稀釋體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vs)和urel(Vt)

校準(zhǔn)溫度為20 ℃，實(shí)驗(yàn)室溫度在20±5 ℃之間變動，水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4·℃-1，按照均勻分布，則

=8.39×10-4

(2)5mL單標(biāo)線移液管帶入的不確定度

同50mL量瓶的評定，則

urel(V5)=1.84×10-3

(3)25mL量瓶帶入的不確定度

同50mL量瓶的評定，則

urel(V25)=9.21×10-4

(4)100mL量瓶帶入的不確定度

同50mL量瓶的評定，則

urel(V100)=5.47×10-4

3.3.4 對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)帶來的不確定度，現(xiàn)無法得知其不確定度的參考數(shù)值及相關(guān)信息，故此項(xiàng)忽略[7]。

3.3.5 不確定度分量匯總 見表8。

表8 各種不確定度分量匯總

Tab.8Thetotaluncertaintysummary

分量肌苷吡拉西坦甲硝唑曲安奈德重復(fù)性6.20×10-36.27×10-36.65×10-33.02×10-3ms1.76×10-31.71×10-31.39×10-32.47×10-3mt1.76×10-31.71×10-31.39×10-32.47×10-3Vs2.19×10-35.47×10-48.39×10-49.21×10-4Vt2.19×10-35.47×10-48.39×10-49.21×10-4

3.3.6 合成不確定度及擴(kuò)展不確定度計(jì)算 根據(jù)表7相對不確定分量合成計(jì)算：

uc(W)=W×urel(W)

擴(kuò)展不確定度的計(jì)算：

取包含因子為k=2，置信水平為95%， U=2×uc(w),結(jié)果見表9。

表9 合成不確定度及擴(kuò)展不確定度

Tab.9Theuncertaintysummary

品名合成不確定度擴(kuò)展不確定度(k=2)/%肌苷7.32×10-31.45吡拉西坦6.76×10-31.35甲硝唑7.03×10-31.41曲安奈德5.11×10-31.02

3.4 用不確定度評價測量結(jié)果的可接受性 由于使用相同的方法測量同一被測物品，2次測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度相同。所以，當(dāng)測量結(jié)果的差值滿足下式的要求則可認(rèn)為2次測量結(jié)果無顯著性差異[8]。

x1為第1次測量結(jié)果；x2為第2次測量結(jié)果；U1為第1次測量結(jié)果x1的擴(kuò)展不確定度，置信概率為95%；U2為第2次測量結(jié)果x1的擴(kuò)展不確定度，置信概率為95%。

取測試結(jié)果中含量差異未超過2.0的最大值或最小值計(jì)算En，結(jié)果：肌苷En=0.83；吡拉西坦En=0.55；甲硝唑En=0.85；曲安奈德En=0.40。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對肌苷、吡拉西坦、甲硝唑及曲安奈德4種對照品溶液的穩(wěn)定性考察研究結(jié)論：肌苷對照品溶液使用期限為15d；吡拉西坦對照品溶液穩(wěn)定性最好，使用期限為60d；甲硝唑?qū)φ掌啡芤狠^為穩(wěn)定，使用期限為21d；曲安奈德對照品溶液穩(wěn)定性較差，使用期限為7d。

以上結(jié)論為實(shí)驗(yàn)室對照品溶液管理提供數(shù)據(jù)參考，為完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供科學(xué)保障。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:899.

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證管理中心.藥品GMP指南-質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料系統(tǒng)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2011:8.

[3]JJF1059.1-2012，測量不確定度評定與表示[S].全國法制計(jì)量管理計(jì)量技術(shù)委員會，2012.

[4] 何悅，張紅飛.含0.1%苯甲酸鈉的17氨基酸對照品水溶液的穩(wěn)定性考察[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2008，9(6):447-450.

[5] 段萍，談大川，孫蓉，等.對中國藥典“復(fù)方磺胺甲噁唑片”含量測定所用對照品溶液穩(wěn)定性的研究 [J].河北職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，18(4):1-2.

[6] 朱清麗，柯紅梅，譚艷萍，等.HPLC測定維生素B6片含量的不確定度分析[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29(5):466-469.[7] 柯紅梅，肖娟，曾曉黎，等.HPLC測定阿莫西林膠囊含量的不確定度分析[J].西北藥學(xué)雜志，2009，24(5):347-349.

[8]CNAS-CL01:2006，檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則[S].中國合格評定國家認(rèn)可委員會，2006.

Study on the stability of control solutions of inosine， piracetam， metronidazole and triamcinolone acetonide by HPLC

ZHUQingli，TANYanping，KEHongmei，SUNQuanming，LINing

(AnkangInstituteforFoodandDrugControl，Ankang725000，China)

ObjectiveToinvestigatethestabilityof4kindsofcontrolsolutions.MethodsHighperformanceliquidchromatographywasusedtostudythestabilityandtheaccuracyuncertaintyofinosine，derbyoflevetiracetam，metronidazoleandtriamcinoloneacetonidecontrolsolutions，weinvestigatedthestability.ResultsInosinecontrolsolutioncouldbeusedforaperiodof15days;piracetamforaperiodof60days;metronidazolereferencesolutionwasstable,andcouldbeusedforaperiodof21days;triamcinoloneacetonidereferencesolutionstabilitywaspoor,couldbeusedforaperiodof7days.ConclusionTheresultsofthestabilitystudysuppliedareferenceforeffectivequalitycontrol.

HPLC；referencesolution；stability；uncertaintydegree

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.013

R

A

2016-01-21)