王 洋 王 濱 李鵬輝 郎尉雅

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物遺傳教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組胚教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

延靈丹方對(duì)卵巢早衰小鼠激素水平及凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2/Bax表達(dá)的影響

王 洋1王 濱1李鵬輝2郎尉雅3

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物遺傳教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組胚教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

目的探討延靈丹方對(duì)小鼠卵巢早衰（POF）模型激素水平及凋亡調(diào)節(jié)基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（Bc1-2）、Bc1-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達(dá)的影響。方法將40只SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為4組，包括空白組、模型組、延靈丹方組、西藥組。除空白組外，其余各組建立免疫性POF小鼠模型。延靈丹方組給予延靈丹藥液灌胃，西藥組給予戊酸雌二醇灌胃，空白組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，各組均為2次/d，連續(xù)15 d。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）水平；Western b1ot法檢測(cè)卵巢組織Bc1-2、Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果與空白組比較，模型組小鼠血清E2水平降低，血清FSH水平升高（P＜0.01），血清LH水平有一定程度升高（P＜0.05）；與模型組比較，延靈丹方組及西藥組小鼠血清E2水平均升高，F(xiàn)SH、LH水平均降低（P＜0.01）。與空白組比較，模型組小鼠卵巢Bc1-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增加（P＜0.01），且Bc1-2/Bax下降（P＜0.01）；與模型組比較，延靈丹方組及西藥組小鼠卵巢Bc1-2蛋白表達(dá)顯著增加，Bax蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），Bc1-2/Bax明顯上升（P＜0.01）。結(jié)論延靈丹方通過下調(diào)卵泡及卵巢間質(zhì)Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bc1-2蛋白的表達(dá)，抑制卵巢顆粒細(xì)胞的過度凋亡，調(diào)節(jié)卵巢激素水平，改善卵巢功能。

延靈丹方；卵巢早衰；性激素；Bcl-2；Bax；顆粒細(xì)胞；凋亡

月經(jīng)初潮年齡正?；蚯啻浩谘舆t，第二性征發(fā)育正常的女性，在40歲之前閉經(jīng)伴血清促性腺激素水平升高和雌激素水平下降則為卵巢早衰（premature ovarian fai1ure）。該病可出現(xiàn)圍絕經(jīng)期綜合征癥狀、不孕癥，增加罹患骨質(zhì)疏松和抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)，并可導(dǎo)致不同程度的認(rèn)知功能障礙及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，近年來其發(fā)病率逐年上升［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，各種原因?qū)е碌穆殉苍缢ゴ蠖及殡S著卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，因此卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡可能成為卵巢早衰發(fā)病的始動(dòng)因素［3-4］。中藥復(fù)方制劑——延靈丹在治療卵巢早衰排卵障礙和生殖內(nèi)分泌紊亂方面取得了良好的臨床療效［5］。但是關(guān)于延靈丹對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響尚鮮見報(bào)道。本課題擬觀察延靈丹方對(duì)卵巢早衰模型小鼠激素水平的調(diào)節(jié)及對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控Bc1-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討延靈丹方對(duì)免疫性卵巢早衰模型小鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

40只7～8周SPF級(jí)健康雌性BALB/c小鼠，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［合格證號(hào)SCXK（黑）2015-0004］，飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫維持在25℃，濕度60%～70%，通風(fēng)良好。

1.2 試劑

中藥飲片購自齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院中藥局；戊酸雌二醇片購自德國拜耳醫(yī)藥有限公司，批號(hào)J20150012；小鼠透明帶多肽溶液購自天津森潤生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P00102；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自上海偉進(jìn)生物科技有限公司，批號(hào)F5884、F5502；小鼠血清雌二醇（E2）、小鼠促黃體生成激素（LH）和小鼠促卵泡生成激素（FSH）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司，批號(hào)20150624。

1.3 儀器

MP-120-2型電子天平（上海第二天平儀器廠）；BX53光學(xué)顯微鏡（日本奧林帕斯公司）；RM2235冰凍切片機(jī)（德國Lecai公司）；Mu1tiskan MK3酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司）。

1.4 藥物配制

1.4.1 中藥配制水煎地黃12 g、菟絲子12 g、杜仲12 g、山芋12 g、山藥12 g、黨參6 g、黃芪6 g、首烏6 g、黑蟻6 g、枸杞子6 g、牡蠣6 g、丹參6 g、香附6 g、甘草3 g，并濃縮至2倍臨床等效劑量1.08 g/mL的無菌藥液，4℃冰箱保存。

1.4.2 西藥配制三蒸水溶解戊酸雌二醇片，濃度為0.006 mg/mL。

1.5 動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)分組

取6 mg ZP3透明多肽粉末，加入6 mL雙蒸水配成溶液，與弗氏完全佐劑按1∶1配制成免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按1∶1配成免疫強(qiáng)化試劑。每日上午9：00，每只小鼠給予0.15 mL免疫試劑注射雙后腳掌處及腹腔皮下，14 d后以免疫強(qiáng)化試劑0.15 mL再次注射雙后腳掌處及腹腔皮下加強(qiáng)免疫，建立免疫性卵巢早衰模型［6］。

將40只SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、延靈丹方組、西藥組，每組10只。除空白組外，其余各組建立免疫性卵巢早衰小鼠模型，空白組造模時(shí)每只小鼠予0.15 mL生理鹽水注射雙后腳掌及腹腔皮下。延靈丹方組給予2倍臨床等效劑量（1.08 mL/20 g）延靈丹方藥液灌胃，西藥組給予0.4 mL/ 20 g戊酸雌二醇進(jìn)行灌胃，空白組、模型組給予等量生理鹽水進(jìn)行灌胃。各組均為2次/d，連續(xù)15 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 小鼠臟器指數(shù)及卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察各組小鼠于灌胃結(jié)束后第2天，摘取眼球取血后處死，計(jì)算卵巢的臟器指數(shù)=臟器重量/體重。隨后將1/2卵巢組織迅速用液氮保存用于Western b1ot等實(shí)驗(yàn)。另外1/2卵巢以4%多聚甲醛固定4～6 h，石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.2 血清學(xué)檢測(cè)小鼠眼球取血，離心4000 r/min，10 min，分離血清，采用ELISA法，按照試劑盒使用說明操作檢測(cè)血清中E2、FSH、LH的含量。

1.6.3 Western blot檢測(cè)卵巢中Bcl-2堯Bax蛋白表達(dá)取每組小鼠卵巢組織20 g，冰上提取蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后確定蛋白上樣量，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，以3%脫脂奶粉封閉1 h，再分別添加兔抗小鼠Bc1-2抗體（1∶500），兔抗小鼠Bax抗體（1∶100）和兔抗小鼠β-actin抗體（1∶300），37℃孵育2 h，洗膜后，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶500），37℃孵育1 h。2 h后用超敏發(fā)光液顯影、定影，Image-Pro P1us6.0.1軟件測(cè)定各組蛋白條帶吸光度值，以β-actin作為內(nèi)參照，將各組條帶與β-actin的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠卵巢大體解剖及染色光鏡下組織形態(tài)觀察

大體觀察小鼠卵巢組織，空白組卵巢形態(tài)正常，顏色潤澤；模型組小鼠雙側(cè)卵巢不同程度萎縮，色蒼白。HE染色發(fā)現(xiàn)，空白組卵巢內(nèi)見各級(jí)發(fā)育卵泡及其黃體組織，且卵母細(xì)胞體積較大，顆粒細(xì)胞數(shù)量多，閉鎖卵泡較少；模型組卵巢內(nèi)幾乎不見成熟卵泡，閉鎖卵泡數(shù)量增加，顆粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少。西藥組和延靈丹方組卵巢組織間質(zhì)少，黃體較多，可見大量原始卵泡和初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及接近成熟的卵泡，顆粒細(xì)胞數(shù)量較模型組增多。見圖1。

圖1 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)病理切片（HE染色，100×）

2.2 各組小鼠血清性激素水平及臟器指數(shù)變化情況

與空白組比較，模型組小鼠血清E2水平降低，血清FSH水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），血清LH水平有一定程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示造模成功；與模型組比較，西藥組、延靈丹方組小鼠血清E2水平有所上升，F(xiàn)SH、LH水平均有所下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與空白組比較，模型組的卵巢指數(shù)顯著降低（P＜0.01），提示小鼠卵巢萎縮；與模型組比較，西藥組及延靈丹方組卵巢指數(shù)有所上升（P＜0.05），提示藥物使小鼠卵巢質(zhì)量得到改善。見表1。

表1 各組小鼠血清E2、FSH、LH含量測(cè)定及卵巢指數(shù)比較（，n=10）

表1 各組小鼠血清E2、FSH、LH含量測(cè)定及卵巢指數(shù)比較（，n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；E2：雌二醇；FSH：卵泡刺激素；LH：促黃體生成素

組別卵巢指數(shù)E2（Pg/mL）FSH（mU/mL）LH（mU/mL）空白組模型組西藥組延靈丹方組F值P值0.081±0.011 0.052±0.007**0.064±0.013#0.066±0.012#10.85＜0.01 119.60±21.60 61.20±10.35**96.45±20.78##104.11±20.96##16.91＜0.01 3.89±1.43 5.82±1.08**4.20±0.85##3.90±1.19##6.37＜0.01 3.85±1.11 5.52±1.08*4.14±1.06##3.93±1.01##5.40＜0.01

2.3 各組小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

與空白組比較，模型組小鼠卵巢組織Bc1-2蛋白表達(dá)減少，而Bax蛋白表達(dá)增加（P＜0.01），且模型組小鼠卵巢Bc1-2/Bax顯著下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；提示卵巢Bax蛋白上調(diào)，Bc1-2蛋白下調(diào)可能加速卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖，發(fā)生卵巢早衰。與模型組比較，延靈丹方組及西藥組小鼠卵巢Bc1-2蛋白表達(dá)顯著增加，Bax蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），且Bc1-2/Bax明顯上升，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2、圖2～3。

表2 各組小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)（，n=10）

表2 各組小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)（，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別Bc1-2BaxBc1-2/Bax空白組模型組西藥組延靈丹方組F值P值0.46±0.01 0.30±0.02**0.43±0.02##0.44±0.03##117.59＜0.01 0.27±0.02 0.47±0.01**0.29±0.03##0.30±0.03##148.84＜0.01 1.78±0.23 0.61±0.09**1.69±0.07##1.63±0.10##136.12＜0.01

圖2 小鼠卵巢Bcl-2蛋白的表達(dá)

圖3 小鼠卵巢Bax蛋白的表達(dá)

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為卵巢早衰屬“閉經(jīng)”“血枯”“不孕癥”“血隔”的范疇。中醫(yī)學(xué)卵巢早衰病因病機(jī)主要是腎陰虧虛［7］，延靈丹方以補(bǔ)腎填精、養(yǎng)血益氣、調(diào)理沖任為立方大法。方中用地黃、菟絲子、山芋、山藥、杜仲、首烏、枸杞子養(yǎng)陰生水填精，為方中主藥。地黃可“補(bǔ)腎水真陰不足”；菟絲子為治療女子腎精虧虛的要藥；枸杞能“補(bǔ)肝經(jīng)之陰，益腎水之陽”，所謂補(bǔ)陰稍佐以補(bǔ)陽之藥，陽中求陰；首烏與諸藥相配，固澀精氣，使腎氣得固，精有所藏。在補(bǔ)腎填精的同時(shí)，方中又以黑蟻、丹參、黨參、黃芪等養(yǎng)血益氣；香附養(yǎng)氣以行血；牡蠣“為肝腎血分之要藥”［8-9］。縱觀全方配伍，以補(bǔ)腎滋水為主，使精足而天癸充盛，再養(yǎng)血行氣使精充血足，經(jīng)血有其物質(zhì)基礎(chǔ)，營血充盛，陰可制陽，五志七情調(diào)暢，諸證可解。

女性的卵母細(xì)胞儲(chǔ)備數(shù)量從出生開始就已確定，在女性整個(gè)生命周期中只有400～500個(gè)卵泡可發(fā)育成熟并排卵［10］。在早期卵泡閉鎖過程中，卵母細(xì)胞首先開始凋亡，卵泡細(xì)胞顆粒由內(nèi)層向外層逐漸凋亡；而對(duì)于生長晚期的卵泡，則是顆粒細(xì)胞首先凋亡，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞凋亡，觸發(fā)卵泡閉鎖［11-12］。卵巢的顆粒細(xì)胞分泌的雌激素對(duì)維持女性生理活動(dòng)有重要作用，故顆粒細(xì)胞凋亡誘發(fā)卵巢早衰，已成為目前公認(rèn)的首要發(fā)病因素。凋亡是由相關(guān)性基因調(diào)控完成的細(xì)胞主動(dòng)性死亡的過程，眾多研究認(rèn)為，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡起主要作用的基因有Bc1-2、Bax。Bc1-2是人體的長壽基因之一，也是目前研究較多的一種抑制細(xì)胞凋亡的基因［13］。Bc1-2基因可抑制顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其分裂，降低卵泡的閉鎖率［14］；若卵巢中缺少Bc1-2基因，則有效卵泡減少，乃至出現(xiàn)無卵母細(xì)胞的卵泡［15］。Bax基因與Bc1-2基因同源且相互拮抗，研究顯示Bax蛋白過度表達(dá)是卵子細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素［16］。若Bc1-2＜Bax，則細(xì)胞趨向凋亡；若Bc1-2＞Bax，則細(xì)胞趨向成活［17-18］。

透明帶抗原免疫可使卵巢閉鎖卵泡增加，局部免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡加速，分泌雌激素能力下降，發(fā)生卵巢功能早衰［19-20］。本研究在通過透明帶多抗為免疫原建立卵巢早衰模型小鼠基礎(chǔ)上，觀察中藥復(fù)方延靈丹對(duì)卵巢早衰模型小鼠血清激素水平的影響，證實(shí)了延靈丹方的治療效果；進(jìn)一步觀察結(jié)果顯示，延靈丹方和戊酸雌二酮均能夠上調(diào)Bc1-2蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而使Bc1-2/ Bax比例升高，抑制卵巢顆粒細(xì)胞的過度凋亡，減少卵泡閉鎖，改善卵巢功能，促進(jìn)卵巢早衰的逆轉(zhuǎn)。由于中藥復(fù)方制劑屬于多靶點(diǎn)藥物，是否存在其他作用機(jī)制，在今后的研究中需進(jìn)一步探索。

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Influence of Yanlingdan PrescriPtion on the levels of sex hormone and ex-Pression of aPoPtosis adjusted Protein Bcl-2/Bax in mice with Premature ovarian failure

WANG Yang1WANG Bin1LI Penghui2LANG Weiya3
1.Staff Room of Physio1ogy，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China；2.Staff Room of Biogenetics，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China；3.Staff Room of Histoembryo1ogy，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China

Objective To investigate the effect of Yan1ingdan Prescription on the 1eve1s of sex hormone and expression of B-ce11 1ymphoma/1eukemia-2（Bc1-2）and Bc1-2 associated X protein（Bax）in mice mode1 with premature ovarian fai1ure（POF）.Methods Forty SPF BALB/c fema1e mice were random1y divided into b1ank group，mode1 group，Yan-1ingdan Prescription group and western medicine group.Autoimmune POF mice mode1 were set up except b1ank group. Yan1ingdan Prescription group was given Yan1ingdan Prescription by gavage，western medicine group was given estradio1 va1erate by gavage，b1ank group and mode1 group were given equiva1ent norma1 sa1ine by gavage，twice a day for 15 days.The serum 1eve1s of estradio1（E2），fo11ic1e-stimu1ating（FSH），1utropin（LH）were detected by the enzyme-1inked immunosorbent assay（ELISA）method.The expression of Bc1-2 and Bax protein in mice ovarian tissue was detected by Western b1ot method.Results Compared with the b1ank group，the serum 1eve1 of E2was decreased，F(xiàn)SH was increased in mode1 group，with high1y statistica11y significant differences（P＜0.01），meanwhi1e，the 1eve1 of LH was increased to a certain extent，with statistica11y significant difference（P＜0.05）；compared with the mode1 group，the serum 1eve1s of E2in western medicine group and Yan1ingdan Prescription group were increased，the 1eve1s of FSH and LH were decreased significant1y（P＜0.01）.Compared with the b1ank group，the expression of Bc1-2 protein in mode1 group was decreased significant1y，and the expression of Bax protein was increased significant1y（P＜0.01），and Bc1-2/ Bax ratio of mode1 group was decreased significant1y（P＜0.01）；compared with the mode1 group，the expression ofBc1-2 protein in Yan1ingdan Prescription group and western medicine group were increased obvious1y，the expression of Bax protein were decreased（P＜0.01），and the Bc1-2/Bax ratio was increased significant1y（P＜0.01）.Conclusion Through down-regu1ating the expression of Bax in fo11ic1e and ovarian stroma and up-regu1ating the expression of Bc1-2，Yan-1ingdan Prescription can inhibit the excessive apoptosis of granu1ar ce11s，regu1ate the sex hormone 1eve1s，and improve the function of ovaries.

Yan1ingdan Prescription；Premature ovarian fai1ure；Sex hormone；Bc1-2；Bax；Granu1ar ce11；Apoptosis

R711.75

A

1673-7210（2016）07（c）-0042-04

2016-03-25本文編輯：張瑜杰）

黑龍江省齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（SFGG-201510、SFGG-201565）。

王洋（1983.8-），女，碩士研究生；研究方向：生殖與內(nèi)分泌。