翁小東 王 磊 劉修恒 王 敏

武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢430060

胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽I缺血再灌注損傷后腎細(xì)胞凋亡反應(yīng)的保護(hù)作用

翁小東 王 磊 劉修恒 王 敏

武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢430060

目的觀察胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽I缺血再灌注損傷后腎細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法建立腎缺血再灌注損傷大鼠模型，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組、缺血再灌注組和胡黃連苷Ⅱ組，每組10只。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）濃度，光鏡觀察病理組織變化，免疫組化檢測(cè)Caspase-3表達(dá)，Rea1-time PCR及Western b1ot檢測(cè)Bax、Bc1-2和PARP-1表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組Cr、BUN水平均明顯增高；光鏡病理組織可見腎小管損傷明顯；免疫組化示Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)；Rea1-time PCR及Western b1ot檢測(cè)Bax、PARP-1表達(dá)增強(qiáng)，而Bc1-2表達(dá)減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胡黃連苷Ⅱ組與缺血再灌注組比較，腎功能指標(biāo)明顯減低，腎小管上皮細(xì)胞損傷減輕，Caspase-3表達(dá)顯著減弱，Bax與PARP-1的活性明顯下降；Bc1-2表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論胡黃連苷Ⅱ在腎臟缺血再灌注損傷時(shí)能有效地保護(hù)腎功能，其作用機(jī)制可能與增加Bc1-2表達(dá)，降低Bax、PARP-1、Caspase-3等凋亡基因的表達(dá)有關(guān)。

缺血再灌注損傷；胡黃連苷Ⅱ；凋亡

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是臨床上常見的危重病癥，由多種病因?qū)е拢?］。AKI因其較高的死亡率而具有重要的臨床意義，至今仍然有30%～ 70%不等［2］。腎臟缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是導(dǎo)致AKI的重要因素之一，常發(fā)生在腎移植、保留腎單位手術(shù)、腎動(dòng)脈狹窄、腎積水、主動(dòng)脈搭橋手術(shù)、體外循環(huán)、栓塞性疾病、意外或醫(yī)源性損傷中等。目前，用于減輕腎IRI的措施主要分為三類：藥物干預(yù)、外科或機(jī)械性干預(yù)和基因治療等，而尋求一種有效、廉價(jià)的措施，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。胡黃連根提取物含有多種萜類化合物和糖苷［3］，胡黃連苷Ⅱ是提取物的主要活性成分之一。許多研究表明，胡黃連苷Ⅱ有大量的藥理作用，包括神經(jīng)保護(hù)、肝臟保護(hù)、抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等作用［4-5］，對(duì)心、腦和肢體IRI均有保護(hù)作用［6-9］。然而，其在腎IRI中的作用研究缺乏，因此筆者欲研究胡黃連苷Ⅱ在腎IRI中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 模型的建立與分組

健康雄性SD大鼠30只，8～10周齡，購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：42009800001176），體重為250～300 g，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水、進(jìn)食。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為以下3組：①假手術(shù)組（n=10）：腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉（40 mg/kg），麻醉大鼠，然后游離雙側(cè)腎臟，切除右腎后縫合腹壁；②缺血再灌注組（n=10）：手術(shù)步驟與假手術(shù)組相同，但在游離雙側(cè)腎臟及切除右腎后，用無創(chuàng)傷血管夾夾閉左腎動(dòng)、靜脈45 min進(jìn)行缺血，然后開放血管夾進(jìn)行再灌注24 h（既往文獻(xiàn)研究表明再灌注24 h是研究腎臟缺血再灌注急性損傷的最佳時(shí)間點(diǎn)），腎臟由暗紅變色鮮紅色代表再灌注成功。③胡黃連苷Ⅱ組（n=10）：手術(shù)步驟與缺血再灌注組相同，但在缺血45 min后、再灌注之初腹腔注射（關(guān)于胡黃連苷Ⅱ?qū)ζ鞴偃毖俟嘧p傷的文獻(xiàn)報(bào)道均采用的是腹腔注射）PicrosideⅡ（10 mg/kg），而假手術(shù)組和缺血再灌注組注射等量的1 mo1/L的PBS。

1.2 試劑

胡黃連苷Ⅱ購于天津奎青醫(yī)藥公司，TLR4抗體購自Santa Cruz公司，NF-κB抗體購Santa Cruz公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 樣本采集和處理

1.3.1 標(biāo)本采集分別于缺血/再灌注損傷24 h后采集大鼠下腔腹腔靜脈血待測(cè)，處死各組大鼠獲取腎臟組織，一部分迅速置于-80℃中保存，另一部分用固定液固定后，常規(guī)石蠟包埋。

1.3.2 血清尿素氮淵BUN冤和肌酐淵Cr冤的檢測(cè)將采集的大鼠血液標(biāo)本常溫離心3000 r/min，離心10 min后，使用O1ympus全自動(dòng)生化分析儀（Au2700）測(cè)定血清Cr和BUN水平。

1.3.3 腎組織病理學(xué)檢查取大鼠腎組織，用多聚甲醛固定后，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，脫蠟，HE染色，后在200倍光鏡下觀察其病理改變。

在接下來的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)評(píng)環(huán)節(jié)，63名選民代表參加了投票。“優(yōu)秀票57票，稱職票5票，基本稱職票1票，不稱職票0票，總體評(píng)價(jià)為優(yōu)秀?！辨?zhèn)人大主席宣布測(cè)評(píng)結(jié)果的話音剛落，會(huì)場(chǎng)響起了熱烈的掌聲，李興軍緊張的神情才稍稍放松了下來。

1.3.4 免疫組化測(cè)定Caspase-3的表達(dá)情況腎組織石蠟切片，厚4 μm，按SP法免疫組化試劑盒進(jìn)行操作，加入Caspase-3（1∶100）抗體及相應(yīng)二抗，DAB顯色5 min后封片。細(xì)胞漿或細(xì)胞核有棕黃色表達(dá)者為陽性細(xì)胞。

1.3.5 Real-time PCR檢測(cè)Bax堯Bcl-2和PARP-1常規(guī)Trizo1試劑抽提總RNA，核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA濃度后，取總RNA 1 μg，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。Bax上游引物：5′-TGAACTGGACAACAACATGGAG-3′，下游引物：5′-AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACC-3′；Bc1-2上游引物：5′-TTTGATTTCTCCTGGCTGTCT-3′，下游引物：5′-CTGATTTGACCATTTGCCTG-3′；PARP-1上游引物：5′-TCTCCAATCGCTTCTACACC CT-3′，下游引物：5′-TACTGCTGTCATCAGACCCACC-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，下游引物：5′-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。PCR反應(yīng)條件均為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后1次為72℃延伸7 min。結(jié)果以目的基因與β-actin的比值表示。

1.3.6 蛋白免疫印跡法淵Western blot冤檢測(cè)Bax堯Bcl-2和PARP-1從-80℃冰箱中取出保存后的腎組織，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取40 μg蛋白上樣，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，后加入1∶1000稀釋的Bax、Bc1-2和PARP-1抗體，4℃下?lián)u床過夜。之后與辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗大鼠抗體（1∶2000稀釋）結(jié)合，洗膜后ECL法顯色、照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清Cr和BUN水平的比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和胡黃連苷Ⅱ組的Cr和BUN明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胡黃連苷Ⅱ組的Cr和BUN水平較缺血再灌注組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果

2.3各組大鼠Caspase-3免疫組化染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腎臟組織中Caspase-3很少表達(dá)，缺血再灌注損傷組強(qiáng)陽性表達(dá)，而PicrosideⅡ組為陽性表達(dá)，相比缺血再灌注損傷組明顯減弱。見圖3（封三）。

2.4 各組大鼠Real-time PCR結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和PicrosideⅡ組Bax和PARP-1的mRNA水平顯著增高，Bc1-2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PicrosideⅡ組的Bax、PARP-1的mRNA水平與缺血再灌注組比較明顯減低，Bc1-2水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組大鼠腎組織Bax、Bcl-2和PARP-1表達(dá)的比較

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和PicrosideⅡ組Bax和PARP-1的蛋白表達(dá)水平顯著增高，Bc1-2表達(dá)明顯降低。PicrosideⅡ組Bax、PARP-1的蛋白水平與缺血再灌注組比較明顯減低，Bc1-2的表達(dá)顯著升高。見圖5。

圖1 各組大鼠血清Cr和BUN水平的比較

圖2 各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果（200×）

圖4 各組大鼠Real-time PCR結(jié)果

圖5 各組大鼠Western blot結(jié)果

3 討論

腎IRI可以導(dǎo)致AKI、慢性腎衰和終末期腎病［1-2］，并且是影響移植腎存活率的主要原因之一［10-11］。近年來研究證實(shí)，腎IRI通過影響免疫機(jī)制導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）的發(fā)生［12］。并且，隨著免疫抑制劑的成熟運(yùn)用，IRI作為最重要的非抗原依賴因素，可直接導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)（chronic rejection，CR），移植腎失功能［13］。因此，努力尋求一種減輕腎臟IRI有效、廉價(jià)的措施，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

腎臟IRI損傷的機(jī)制至今尚未完全闡明，主要學(xué)說包括氧自由基作用、白細(xì)胞作用、鈣超載、活性因子作用等方面。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，移植腎臟缺血再灌注后引起的腎細(xì)胞凋亡是IRI的重要原因［14］。Bc1-2家族是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，既可以促進(jìn)細(xì)胞成活如Bc1-2，也可以使細(xì)胞死亡如Bax［15］。Bc1-2水平的升高可以促進(jìn)細(xì)胞存活并且有證據(jù)表明具有防止凋亡的效果［16］。然而，Bax啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，是一種凋亡蛋白，由激活的Caspases啟動(dòng)。Bc1-2與Bax的比率決定細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性［17-18］。本研究中，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組的Bax和PARP-1的表達(dá)水平顯著增高，Bc1-2水平明顯降低。胡黃連苷Ⅱ組Bax、PARP-1的表達(dá)水平與缺血再灌注組比較明顯減低，Bc1-2水平顯著升高。這表明，胡黃連苷Ⅱ可以有效抑制細(xì)胞的Bax/Bc1-2比率，進(jìn)而抑制腎IRI導(dǎo)致的腎組織損傷。

研究表明，Caspase能促進(jìn)和實(shí)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡，Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)瀑布中最關(guān)鍵的下游凋亡蛋白酶［19］。一些細(xì)胞外信號(hào)通過Fas受體途徑激活Caspase-8，激活的Caspase-8促進(jìn)Caspase活化，水解細(xì)胞特異性蛋白和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP），從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［20］。在本研究中，與缺血再灌注組比較，胡黃連苷Ⅱ組的腎組織損傷明顯減輕，Caspase-3表達(dá)水平明顯減低。胡黃連苷Ⅱ組PARP-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯減低。這表明胡黃連苷Ⅱ可以有效抑制細(xì)胞的Caspase凋亡通路。

胡黃連苷Ⅱ可作為一種有效、廉價(jià)的治療措施，在減輕缺血再灌注對(duì)腎臟組織的損傷、改善腎功能方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Protective effects of PicrosideⅡon aPoPtosis after renal ischemia-rePerfusion injury in rats

WENG XiaodongWANG LeiLIU XiuhengWANG Min
Department of Uro1ogy，Renmin Hospita1 of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

Objective To observe the effects of picrosideⅡon apoptosis of tubu1ar epithe1ia1 ce11s after rena1 ischemia-reperfusion injury in rats.Methods Estab1ishing rena1 ischemia-reperfusion injury rat mode1，the experiment rats were random1y divided into 3 groups：the sham group，ischemia and reperfusion group and picrosideⅡgroup.Each group had 10 rats.The concentrations of serum creatinine（Cr），b1ood urea nitrogen（BUN）in rats were determined by auto-biochemica1 ana1yzer，the rena1 histopatho1ogic changes were observed under the 1ight microscope，the expression of Caspase-3 were detected by immunohistochemistry，the expression of Bax，Bc1-2 and PARP-1 were detected by Rea1-time PCR and the Western b1ot.Results Compared with the sham group，the 1eve1s of Cr，BUN in the ischemia and reperfusion group were significant1y increased；the patho1ogica1 tissue under the 1ight microscope showed obvious rena1 tubu1e 1esion；the immunohistochemistry showed that the expression of Caspase-3 was enhanced；Rea1-time PCR and Western b1ot showed that the expression of Bax and PARP-1 was increased significant1y，and the expression of Bc1-2 was reduced significant1y，the differences were statistica11y significant（P＜0.05）.Compared with ischemia and reperfusion group，picrosideⅡgroup cou1d significant1y reduce rena1 function，mitigate rena1 tubu1ar epithe1ia1 ce11 injury，weaken the expression of Caspase-3，decrease the expression of Bax and PARP-1，but the expression of Bc1-2 was significant1y reinforced，the differences were statistica11y significant（P＜0.05）.Conclusion PicrosideⅡcan protect rena1 function from ischemia-repedusion injury and its mechanism may be through inhibiting the expression of Bax，PARP-1 and Caspase-3，and promoting the expression of Bc1-2.

Ischemia-reperfusion injury；PicrosideⅡ；Apoptosis

R285.5

A

1673-7210（2016）07（c）-0021-04

2016-03-26本文編輯：張瑜杰）

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012FFA096）；湖北省武漢市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015060101010049）。