王 喆 李 偉 李菁媛 李 琳 李乃靜

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院干診科，遼寧沈陽(yáng)110016；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥物分析教研室，遼寧沈陽(yáng)110016

黑水纈草提取物對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠治療作用的代謝組學(xué)研究

王 喆1李 偉2李菁媛1李 琳1李乃靜1

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院干診科，遼寧沈陽(yáng)110016；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥物分析教研室，遼寧沈陽(yáng)110016

目的運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS）探討黑水纈草提取物對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）的治療機(jī)制。方法將雄性昆明小鼠分為3組，分別為對(duì)照組（2%吐溫80）、AD模型組（2%吐溫80）和治療組（95%黑水纈草粗提物2 g/kg），灌胃給藥30 d。運(yùn)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和UPLC-MS技術(shù)對(duì)小鼠進(jìn)行研究。結(jié)果Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，AD模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），治療組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。空間探索實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，AD模型組小鼠單位時(shí)間目標(biāo)象限停留時(shí)間短，穿臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.05），治療組小鼠單位時(shí)間內(nèi)目標(biāo)象限停留時(shí)間長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)增加（P＜0.05）。通過(guò)UPLC-MS/MS技術(shù)，確定了10種AD的血漿生物標(biāo)志物，分別為組氨酸、溶血磷脂酰膽堿C16∶0、溶血磷脂酰膽堿C18∶2、溶血磷脂酰膽堿C18∶1、溶血磷脂酰膽堿C20∶4、溶血磷脂酰膽堿C22∶6、十六碳鞘磷脂、二氫神經(jīng)鞘氨醇、4-羥雙氫（神經(jīng)）鞘氨醇C18、4-羥雙氫（神經(jīng)）鞘氨醇C20，與對(duì)照組比較，AD模型組小鼠血漿中10種標(biāo)志物的含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。治療組小鼠血漿中10種標(biāo)志物的含量均明顯上升（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論黑水纈草提取物可提高AD小鼠的認(rèn)知功能，其作用機(jī)制與氨基酸、磷脂和鞘脂代謝等相關(guān)代謝通路有關(guān)。

阿爾茨海默病；黑水纈草；代謝組學(xué)；生物標(biāo)志物

阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損性疾病，是最常見(jiàn)的癡呆類型［1］。隨著人口老齡化，AD已成為致老年人死亡的第四大疾病［2］。黑水纈草（Valeriana amurensis）為敗醬科纈草屬植物，具有鎮(zhèn)靜、抗抑郁及抗心血管疾病等作用［3］，有研究表明黑水纈草具有治療AD的功效［4］。本研究運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究黑水纈草提取物對(duì)AD的調(diào)控機(jī)制，為AD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

黑水纈草由安國(guó)市瑞泰堂藥材行提供；Aβ25～35由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；色譜乙腈、色譜甲醇，購(gòu)于美國(guó)J.T.Baker公司；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司，離心腔直徑250 mm）；儀器為液相系統(tǒng)Waters AcquityTMU1tra Performance Liquid Chromatography（UPLC）System，質(zhì)譜儀Micromass Quattro microTMAPI三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12周雄性KM小鼠24只，體重18～22 g，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)［SCXK（遼）2010-0001］。置于室溫（25±2）℃，12/12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由攝食、飲水。

1.3 黑水纈草提取物制備

將500 g干燥的黑水纈草根及根莖粉碎成粗粉，以10倍體積的95%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，濾過(guò)，回收乙醇液，減壓濃縮，得150 g乙醇提取物，即黑水纈草95%粗提物。

1.4 AD模型制備

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，運(yùn)用完全隨機(jī)方法，分為對(duì)照組、AD模型組和治療組，每組8只。采用小鼠雙側(cè)側(cè)腦室注射Aβ25～35蛋白的方法制備AD模型。小鼠麻醉后，雙側(cè)側(cè)腦室（以前囟為起點(diǎn)，沿矢狀縫后移0.5 mm，然后側(cè)移1.1 mm，垂直進(jìn)針3.0 mm）各緩慢注射3 μL聚合態(tài)Aβ25～35溶液，對(duì)照組雙側(cè)側(cè)腦室注射等量生理鹽水。

1.5 給藥方法

造模后第3天開(kāi)始灌胃，治療組小鼠給予95%黑水纈草粗提物（用2%吐溫80溶液做溶劑配成0.1 g/mL溶液）2 g/kg，AD模型組和對(duì)照組給予等量的2%吐溫80溶液。每日1次，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30 d。

1.6 Morris水迷宮

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6 d，期間小鼠正常灌胃給藥。前5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每日2次，觀察小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，若60 s內(nèi)小鼠未尋到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)致平臺(tái)，并在上面停留10 s。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去水中平臺(tái)，觀察并記錄小鼠60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)及在此象限的停留時(shí)間。

1.7 樣品的采集與預(yù)處理

小鼠乙醚麻醉，去眼球取血置于1.5 mL離心管（EP內(nèi)涂肝素），離心10 min（4℃，12 000 r/min），取上清液，置于-80℃冰箱保存。預(yù)處理：取100 μL樣品加入200 μL乙腈，渦旋，離心，取上清后，于氮?dú)庀麓蹈?，?00 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶，再次渦旋，離心，取上清，重復(fù)2次，后取5 μL進(jìn)入液相色譜系統(tǒng)。

1.8 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLCRBEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm Waters，Made in Ire1and），流動(dòng)相A1為0.1%甲酸水，B1為0.1%甲酸乙腈，流速0.25 mL/min。梯度洗脫：0 min，80%A1；0～1 min，50%～80%A1；1.0～4.5 min，35%～50%A1；4.5～12.0 min，0%～35%A1；12～13 min，0～80%A1；13～14 min，80%A1。進(jìn)樣量5.0 μL，柱溫30℃。

質(zhì)譜條件：采用正離子全掃描方式，掃描范圍m/z 100～1000。ESI為離子源，毛細(xì)管電壓3.2 V，錐孔電壓30 V；脫溶劑氣為氮?dú)?，流?00 L/h，溫度350℃。同時(shí)進(jìn)行MS/MS二級(jí)掃描獲得多級(jí)質(zhì)譜碎片信息。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

水迷宮數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，三組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用Tukey檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用K-W檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)：運(yùn)用MassLynx V4.1對(duì)數(shù)據(jù)分析，經(jīng)主成分分析（PCA）得到得分圖及載荷圖，再根據(jù)載荷圖上對(duì)各組分組起重要作用的點(diǎn)進(jìn)行二級(jí)掃描，根據(jù)二級(jí)圖譜，查找相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB http：//www.hmdb.ca/和LIPID MAPS http：//www.1ipidmaps.org/等），從而得出AD的潛在生物標(biāo)志物。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，與對(duì)照組小鼠比較，AD模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，且其在目標(biāo)象限內(nèi)停留時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AD模型組小鼠比較，治療組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，在目標(biāo)象限內(nèi)停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 小鼠血漿UPLC-MS分析

2.2.1 血漿代謝組學(xué)分析PCA得分圖分析，對(duì)照組和AD模型組完全分開(kāi)，界限明顯，治療組處于對(duì)照組和AD模型組之間，證明黑水纈草提取物干預(yù)后AD小鼠血漿代謝物發(fā)生明顯變化。見(jiàn)圖1。

表1 黑水纈草提取物對(duì)AD模型小鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)的影響（）

表1 黑水纈草提取物對(duì)AD模型小鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)的影響（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與AD模型相，**P＜0.05；AD：阿爾茨海默病

組別只數(shù)目標(biāo)象限停留時(shí)間（s）逃避潛伏期（s）第1天第2天第3天第4天第5天穿越平臺(tái)次數(shù)（次）對(duì)照組AD模型組治療組8 8 8 58.90±0.05 59.92±0.07 59.90±0.05 42.76±10.50 57.45±5.26 54.40±9.55**34.08±10.34 50.53±5.34*43.10±10.40**29.65±9.49 43.02±9.65*35.19±3.35**22.42±6.25 40.25±6.64*32.81±4.33**19.07±6.08 11.84±4.69*15.68±4.54**5.00±1.05 2.00±0.82*3.90±1.52**

圖1 三組主成分分析后得到的得分圖

2.2.2 潛在生物標(biāo)志物鑒定經(jīng)PCA分析，確定了10種生物標(biāo)志物。標(biāo)志物的峰強(qiáng)度及黑水纈草作用后峰強(qiáng)度的變化見(jiàn)圖2。

圖2 三組潛在生物標(biāo)志物的峰強(qiáng)度

3 討論

AD病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚缺乏有效的治療藥物。中藥及其提取物質(zhì)具有多靶點(diǎn)、多途徑、多方式等作用特點(diǎn)，已成為人們研究的熱點(diǎn)。

本研究通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，AD小鼠學(xué)習(xí)記憶及空間探索能力明顯下降，黑水纈草提取物干預(yù)后，小鼠學(xué)習(xí)記憶及空間探索能力明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明黑水纈草提取物可改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能。以上實(shí)驗(yàn)表明Aβ小鼠造模成功，具備AD的典型行為學(xué)改變，同時(shí)說(shuō)明了黑水纈草對(duì)AD具有治療作用。

本研究運(yùn)用UPLC-MS技術(shù)研究AD小鼠血漿代謝物的變化。確定了10種AD血漿生物標(biāo)志物，經(jīng)黑水纈草作用后，AD小鼠血漿中的10種標(biāo)志物的含量均明顯增加，表明黑水纈草對(duì)AD有治療作用，其作用與氨基酸、磷脂和鞘脂代謝等某些代謝特定通路的調(diào)控作用有關(guān)。

組氨酸是一種重要的氨基酸，同時(shí)它是許多生物活性物質(zhì)的前體物質(zhì)，如組胺。有大量研究顯示，組胺能神經(jīng)元系統(tǒng)與精神和神經(jīng)退行性疾?。ˋD、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥）有關(guān)［5-7］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，AD患者血中組胺濃度升高，其有可能是疾病初期機(jī)體的代償機(jī)制所致，或是因攜帶載脂蛋白E4等位基因的AD患者血腦屏障被破壞所致［8］。本研究發(fā)現(xiàn)AD小鼠血漿組氨酸含量明顯下降，黑水纈草提取物干預(yù)后，組氨酸含量呈上升趨勢(shì)，從代謝水平上證明了黑水纈草對(duì)AD有治療作用。以上研究表明組胺能神經(jīng)系統(tǒng)受損與AD關(guān)系密切，可能是AD的發(fā)病機(jī)制之一，組氨酸是AD的潛在生物標(biāo)志物。

磷脂代謝異常是AD的特征性病理學(xué)變化之一［9］。溶血卵磷脂（LPC）是細(xì)胞膜磷脂的降解產(chǎn)物，在維持膜的穩(wěn)定性中起重要作用，同時(shí)它也是重要的生物活性物質(zhì)，參與細(xì)胞多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。有研究表明LPC能引起神經(jīng)元鞘脫髓鞘、軸突變性和神經(jīng)元凋亡等［10］。LPC是磷脂酶A2（PLA2）的催化產(chǎn)物，其生成后迅速被乙酰輔酶A乙?；纬删S持神經(jīng)元細(xì)胞膜的重要成分。有研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)頂部及顳葉部乙酰輔酶A活性增強(qiáng)［11］，同時(shí)又有研究發(fā)現(xiàn)多種血漿LPC對(duì)PLA2活性具有抑制作用［12］。多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)AD患者血漿中LPC含量下降［13-16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黑水纈草通過(guò)調(diào)控LPC的代謝，改善AD的癥狀。

鞘氨醇是復(fù)雜神經(jīng)鞘脂類合成的前體物質(zhì)［17］，而鞘脂類是一類重要的信號(hào)分子，參與多種生理功能調(diào)節(jié)，例如神經(jīng)元生長(zhǎng)、細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［18］。有研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織和血漿中神經(jīng)酰胺含量升高［19-20］。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AD小鼠血漿中鞘脂類含量下降［13］。在本研究中，AD小鼠血漿中十六碳鞘磷脂、二氫神經(jīng)鞘氨醇、4-羥雙氫（神經(jīng)）鞘氨醇（C18、C20）含量顯著下降，其均屬于神經(jīng)鞘脂類，在細(xì)胞功能的維持中起著一系列至關(guān)重要作用。而黑水纈草提取物治療后四者含量均明顯上升，證明黑水纈草提取物通過(guò)干預(yù)AD小鼠的脂質(zhì)代謝，從而起到抗AD作用。

本研究運(yùn)用UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)黑水纈草提取物干預(yù)的Aβ23～35小鼠模型血漿代謝物譜進(jìn)行分析，確定了10種AD的生物標(biāo)志物，并發(fā)現(xiàn)黑水纈草提取物是通過(guò)干預(yù)氨基酸、磷脂、鞘脂等相關(guān)代謝通路治療AD。

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Metabonomics study on the effect of Valeriana amurensis extractive for model mice with Alzheimer disease

WANG Zhe1LI Wei2LI Jingyuan1LI Lin1LI Naijing1
1.Department of Cadre Ward，Shengjing Hospita1 of China Medica1 University，Liaoning Province，Shenyang110016，China；2.Teaching and Research Office of Pharmaceutica1 Ana1ysis，Shenyang Pharmaceutica1 University，Liaoning Province，Shenyang110016，China

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Valeriana amurensis extractive for A1zheimer disease（AD）by u1tra-performance 1iquid chromatography-mass spectrometry（UPLC-MS）.Methods KM ma1e mice were divided into three groups：contro1 group（2%Tween-80 so1vent），AD mode1 group（2%Tween-80 so1vent），treatment group（95%EtOH extract of Valeriana amurensis 2 g/kg），a11 mice were given drugs by gavage for 30 days.Morris water maze and UPLC-MS/MS technique were conducted in the experiment.Results In the p1ace navigation test，mice in the AD group took much more time to reach the p1atform on the 1ast three training days compared to the contro1 group（P＜0.05）.The treatment group reduced escape 1atency compared to the AD group on 1ast 4 days（P＜0.05）.In the spatia1 exp1oration test，the tota1 time spent in the target quadrant and the number of mice that exact1y crossed the previous position of the p1atform in AD mode1 group were c1ear1y shorter and 1ower than those of the contro1 group（P＜0.05）.However，mice in the treatment group showed 1onger time spent in the target quadrant and higher frequencies of p1atform crossings compared to the AD group（P＜0.05）.By means of UPLC-MS，a tota1 of ten kinds of ana1ytes were identified，which were L-Histidine，C18 PHS，Hexadecasphinganine，LPC C22∶6，LPC C18∶2，LPC C16∶0，LPC C20∶4，LPC C18∶1，dihydrosphingosine and C20 PHS.When compared to contro1 group，the 1eve1s of ten kinds of markers in AD mode1 group were significant1y reduced（P＜0.05 or P＜0.01）.But the contents of ten kinds of markers in mice p1asma in the treatment group were obvious1y increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Valeriana amurensis extract can improve the cognitive function of AD mice，its mechanism is c1ose1y re1ated to amino acids，phospho-1ipids and sheath 1ipid metabo1ism as we11 as re1ated metabo1ic pathways.

A1zheimer disease；Valeriana amurensis；Metabo1omics；Biomarkers

R749.16

A

1673-7210（2016）07（c）-0004-04

2016-02-29本文編輯：張瑜杰）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81203002）。

王喆（1989-），女，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院2014級(jí)老年醫(yī)學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：老年醫(yī)學(xué)。

李乃靜（1972-），女，博士，教授；研究方向：老年醫(yī)學(xué)。