付雪斐，李靖，孫鳳仙，袁小涌，王超，徐淑梅

（天津醫(yī)科大學生理學教研室，天津300070）

論著

β片層阻斷肽對AD模型小鼠學習記憶及PI3K/AKT信號通路的影響

付雪斐，李靖，孫鳳仙，袁小涌，王超，徐淑梅

（天津醫(yī)科大學生理學教研室，天津300070）

目的：觀察β片層阻斷肽H102對阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠學習記憶的影響，探討其是否通過PI3K/AKT參與Aβ代謝。方法：（1）將APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型組和H102給藥組，設同月齡同背景的C57BL/6J為正常對照組。H102給藥組采用鼻腔給藥，5 μL/d。通過Morris水迷宮檢測不同組小鼠的空間記憶能力的改變。（2）采用免疫組化、RT-PCR及Western blot技術檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白P85、pAKT的表達。結果：（1）Morris水迷宮檢測顯示H102給藥組在定位航行實驗以及空間探索實驗均優(yōu)于模型組，且具有統(tǒng)計學意義。（2）PI3K的mRNA在模型組中顯著降低，在H102給藥組水平顯著增高；ITGB5的mRNA水平在模型組升高，在H102給藥組中明顯下調(diào)，在H102給藥組和模型組之間有顯著差異。（3）與模型組比較H102給藥組PI3K（P85）與pAKT的表達量有明顯升高。（4）PI3K和AKT免疫組化染色顯示H102給藥組的陽性細胞在大腦皮層和海馬較模型組有顯著增加。結論：H102通過激活PI3K/AKT信號通路，使胰島素降解酶表達增加，進而加強了Aβ的降解，達到治療AD的作用。

β片層阻斷肽；APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠；Morris水迷宮；PI3K/AKT信號通路；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病（AD）是一種引起癡呆的神經(jīng)變性疾病。AD發(fā)病機制尚未明確，目前主要有3種假說，膽堿能假說，Tau蛋白假說和淀粉樣蛋白假說。在這幾種假說中淀粉樣蛋白假說被越來越多的學者所認可［1］。該假說認為淀粉樣斑塊的沉積和聚集形成的病理級聯(lián)是AD重要致病因素［2］。PI3K/AKT通路廣泛存在于細胞中，參與細胞生長、增殖、分化，調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導途徑。磷酸肌醇3-激酶（PI3K）是受G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)的脂質(zhì)激酶，參與炎性反應和過敏反應［3］。PI3K由催化亞基P110和調(diào)節(jié)亞基p85構成，p85氨基末端包含SH3結構域和能夠結合到所述SH3結構域果糖富集區(qū)。PI3K的P110亞基有同源性的蛋白激酶，還具有磷脂激酶活性。胰島素降解酶（IDE）是一個中性鋅金屬肽鏈內(nèi)切酶，有研究證明，IDE基因突變會影響Aβ降解，增加AD的患病風險［4］。遺傳連鎖研究已發(fā)現(xiàn)，血漿中Aβ1-42的水平與染色體10q相關，而IDE基因正是位于這段區(qū)域［5］。有研究表明AD患者中IDE的表達［6］和催化活性［7］均受到抑制，然而IDE的調(diào)節(jié)方式的研究相對鮮見報道。課題組前期的研究表明：β片層阻斷肽在細胞和小鼠模型中，對Tau蛋白磷酸化有明顯的抑制作用［8］，同時還可提高Aβ的降解酶IDE、NEP的表達［9］。本研究旨在觀察β片層阻斷肽H102鼻腔給藥對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)PI3K/AKT信號通路的影響，探討H102提高IDE表達的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠40只（25.5～30.5 g），同背景的C57BL/6J小鼠20只（23.2～28.61 g），所有小鼠均為24周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學動物中心SPF級動物房，溫度為（24±1）℃，12：12 h光/暗周期（6：00 Am）開始給予光照。

1.2藥物及材料H102采用Fmoc固相合成并用高效液相色譜純化，質(zhì)譜鑒定純度達95%（上海吉爾生化有限公司）。Anti-pAKT，Anti-AKT，Anti-PI3K購自Abcam公司，USA；即用型SABC免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.3動物分組與給藥方法APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠隨機分為2組：模型組和H102給藥組，C57BL /6J小鼠為正常對照組，每組17～20只。采用鼻腔給藥方法，H102給藥組用自制給藥器給予33 mg/mL藥液5 μL/d；正常對照組和模型組鼻腔給予等體積輔料溶液（取0.5 g殼聚糖及0.1 g BSA溶于100 mL雙蒸水中，搖勻，即為輔料溶液），連續(xù)5周。

1.4 Morris水迷宮測試測試主要包括定位航行實驗和空間探索實驗2個部分。實驗前1 d將小鼠置于水迷宮中預游泳2 min，使其適應水迷宮環(huán)境。正式實驗時，置平臺于水迷宮第三象限中環(huán)內(nèi)，每日相同時段每只小鼠游泳2次（每次90 s），歷時5 d。記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期。如果小鼠在90 s內(nèi)未找到平臺，則將其引至平臺停留20 s，逃避潛伏期記為90 s，此為定位航行實驗。于實驗第6日撤去平臺進行空間探索實驗，相同時間段，任選一個入水點將小鼠放入水中，每只小鼠游泳1次（每次90 s），記錄小鼠的游泳軌跡，考察對平臺的記憶。選取定位航行實驗的平均逃避潛伏期和空間探索實驗的跨平臺次數(shù)及入水朝向角作為衡量其空間學習記憶的主要指標。

1.5腦組織處理腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉小鼠，將麻醉的動物仰臥于冰盤上，伸展固定四肢，迅速剪開胸腹并充分暴露心臟和肝臟。從左側(cè)心尖部迅速插管經(jīng)左心室至升主動脈弓處并固定，同時剪開右心耳，快速灌注0.01 mol/L PBS 60 mL直至右心室流出澄清液體小鼠肝臟完全變白，冰盤上快速取腦，一側(cè)腦組織分離海馬和皮層投入液氮后迅速放于-80℃凍存?zhèn)溆谩Ａ硪粋?cè)將腦組織放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24 h以上，待腦組織下沉后，行蠟塊包埋，小鼠腦組織行矢狀切面切片，待海馬CA1區(qū)出現(xiàn)后連續(xù)切片，切片厚度5 μm。

1.6 Western blot分析從-80℃冰箱取出組織，根據(jù)組織質(zhì)量加入1：10（m：v）的蛋白裂解液勻漿。低溫高速離心，12 000 r/min，5 min，取上清，即為總蛋白提取液。BCA法測定各組織蛋白濃度，并用裂解液將各組織的蛋白濃度調(diào)至等濃度，充分混勻后按4∶1加入5×上樣緩沖液，混勻，煮沸5 min，即可直接上樣。

1.7免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水沖洗；3%H2O2室溫避光孵育10 min，蒸餾水浸泡，2 min×3次；加入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中微波沸騰抗原修復，沸騰后間隔10 min，再沸騰，取出冷卻至室溫，PBS浸泡，2 min×3次；滴加5%BSA封閉，室溫避光孵育15 min，傾去，勿洗；滴加稀釋好的一抗：PI3K（1∶200）、AKT（1∶100）4℃過夜，PBS沖洗，2 min×3次；滴加生物素標記的羊抗鼠通用二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗，3 min×3次；滴加SABC液，避光室溫孵育20 min，PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色劑顯色：EP管中加入1 mL雙蒸水，A、B、C液各滴1滴，混勻，鏡下控制染色程度，去離子水終止顯色反應后充分沖洗；蘇木素復染，雙蒸水充分沖洗，鹽酸酒精分化，梯度酒精常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。

1.8 Real-time PCR Trizol一步法提取總RNA，測定總RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。20 μL的RT-PCR反應體系含：10 μL的2×SYBR Green PCR Master Mix、5 μL的RNase Free Water、上、下游引物（0.05 μg/μL）各0.5 μL和4 μL的cDNA。反應條件：預熱變性，95℃，5 min；變性，95℃，30 s；退火，59℃，30 s；延伸，72℃，30 s；共進行40個循環(huán)的擴增，72℃延伸8 min。

2　結果

2.1行為學測試結果

2.1.1定位航行實驗與正常對照組相比較模型組逃避潛伏期的時間明顯延長，其差異具有顯著性（P＜0.05）；H102給藥組與模型組相比較，從第二天開始，時間明顯縮短，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表1。

表1　小鼠逃避潛伏期（n=20，±s±s）Tab 1 Comparison of average escape latency in navigation test（n=20，±s±s）

表1　小鼠逃避潛伏期（n=20，±s±s）Tab 1 Comparison of average escape latency in navigation test（n=20，±s±s）

與正常對照組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05

組別1 d 2 d 3 d 4 d 5 d正常對照組58.991±10.80 50.443±6.370 42.215±0.940 31.201±0.433 22.186±1.618模型組87.494±5.570#88.514±4.642#89.872±0.044#89.860±0.066#89.833±0.921#H102給藥組88.197±1.530 61.719±3.660*43.201±0.941*33.356±1.390*26.163±0.543*

2.1.2空間探索實驗與正常對照組小鼠比較，模型組跨越隱匿平臺次數(shù)明顯減少，具有顯著性差異（P＜0.05）；H102給藥組與模型組比較跨越隱匿平臺次數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組小鼠的朝向角，與正常對照組比較，明顯偏大，具有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，H102給藥組朝向角明顯偏小，具有顯著性差異（P＜0.05），見表2。

表2　跨越隱匿平臺次數(shù)及朝向角（n=20，±s±s）Tab 2 Com parison of frequency span hidden platform and the corner into water in space exploration experim en（n=20，±s±s）

表2　跨越隱匿平臺次數(shù)及朝向角（n=20，±s±s）Tab 2 Com parison of frequency span hidden platform and the corner into water in space exploration experim en（n=20，±s±s）

與正常對照組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05

組別跨越隱匿平臺次數(shù)/次朝向角/度正常對照組1.60±0.821 38.334±21.264模型組0.00±0.000#129.062±37.672#H102給藥組1.20±0.867*45.027±23.936*

2.2 PI3K/AKT信號通路相關蛋白免疫組化實驗結果（1）PI3K存在于包漿中，染色呈棕色，H102給藥組包漿著色明顯，蛋白表達較模型、正常對照組高（均P＜0.05），見圖1及表3。（2）AKT存在于胞漿中，經(jīng)過免疫組化染色和細胞計數(shù)結果顯示在海馬的CA1區(qū)及大腦皮層，正常對照組陽性細胞率較模型組高，包漿著色明顯深，AKT表達增強；模型組較正常對照組陽性細胞率低，包漿著色淺（P＜0.05），模型組較H102給藥組陽性細胞率較低，包漿著色淺（P＜0.05），見圖2及表4。

圖1　H102對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)中PI3K表達的影響（IHC，×400）Fig 1 Expressions of PI3K protein in m ouse brain detected by imm unohistochem istry（IHC，×400）

表3　皮層及海馬CA1區(qū)各組小鼠PI3K的比較（n=20，±s±s）Tab 3 Exp ressions of PI3K detected by immunohistochem istry（n=20，±s±s）

表3　皮層及海馬CA1區(qū)各組小鼠PI3K的比較（n=20，±s±s）Tab 3 Exp ressions of PI3K detected by immunohistochem istry（n=20，±s±s）

與正常對照組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05

組別陽性細胞計數(shù)皮層海馬CA1區(qū)正常對照組76.00±4.93 78.00±4.24模型組25.00±7.67#37.00±17.57#H102給藥組61.00±7.66*63.00±3.57*

圖2　H102對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)AKT表達的影響（IHC，×400）Fig 2 Expressions of AKT protein in mouse brain detected by immunohistochem istry（IHC，×400）

表4　各組小鼠皮層及海馬CA1區(qū)AKT的比較（n=20，±s±s）Tab 4 Expressions of AKT detected by immunohistochem istry（n=20，±s±s）

表4　各組小鼠皮層及海馬CA1區(qū)AKT的比較（n=20，±s±s）Tab 4 Expressions of AKT detected by immunohistochem istry（n=20，±s±s）

與正常對照組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05

組別陽性細胞計數(shù)皮層海馬CA1區(qū)正常對照組58.00±0.084 70.00±0.005模型組25.00±0.008#43.00±0.001#H102給藥組76.00±0.012*64.00±0.002*

2.3 PI3K/AKT信號通路相關蛋白Western blot結果（1）PI3K模型組蛋白表達量低于對照組（均P＜0.05）。與模型組比較H102給藥組PI3K表達量顯著增加。見圖3及表5。（2）AKT、p-AKT模型組腦內(nèi)AKT及p-AKT蛋白表達水平低于正常對照組，而H102給藥組高于模型組以及正常對照組（P＜0.05），見圖4及表5。

圖3　各組小鼠腦內(nèi)PI3K蛋白的表達Fig 3 PI3K protein expression in mouse brain by Western blotassay

圖4　各組小鼠腦內(nèi)P-AKT蛋白的表達Fig 4 p-AKT protein expression in mouse brain by W estern blotassay

表5　各組小鼠腦組織中PI3K，AKT和p-AKT蛋白的比較（n=20，±s±s）Tab 5 Expressionsofpurposeprotein detected by W estern blotassay（n=20，±s±s）

表5　各組小鼠腦組織中PI3K，AKT和p-AKT蛋白的比較（n=20，±s±s）Tab 5 Expressionsofpurposeprotein detected by W estern blotassay（n=20，±s±s）

與正常對照組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05

組別灰度分析值PI3K AKT p-AKT正常對照組0.91±0.084 0.39±0.006 0.37±0.071模型組0.39±0.006#0.09±0.001#0.03±0.004#H102給藥組0.79±0.013*0.32±0.006*0.36±0.093*

2.4 ITGB5，PI3K的mRNA表達影響（1）模型組ITGB5的mRNA表達量明顯高于正常組，H102給藥組與模型組相比ITGB5 mRNA表達量明顯減少（均P＜0.05）。（2）模型組PI3K的mRNA表達量明顯低于正常組，H102給藥組與模型組相比PI3K的mRNA表達量明顯升高（均P＜0.05），見表6。

表6　H 102對AD小鼠腦中ITGB5和PI3Km RNA表達的影響（n=20，±s±s）Tab 6 Expressions of mRNA detected by Real-time PCR（n=20，±s±s）

表6　H 102對AD小鼠腦中ITGB5和PI3Km RNA表達的影響（n=20，±s±s）Tab 6 Expressions of mRNA detected by Real-time PCR（n=20，±s±s）

與正常對照組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05

組別2-ΔtΔtPI3K ITGB5正常對照組1 1模型組0.46#2.12#H102給藥組1.2*1.32*

3　討論

Aβ的積累和沉積引起的病理級聯(lián)是引起AD的基本原因之一［10］。淀粉樣蛋白假說認為胞外不可溶的Aβ具有毒性，然而最新的研究認為胞內(nèi)可溶Aβ的形成才是引起病理級聯(lián)的關鍵［11］。以往的很多研究著眼點在Aβ的形成，并且發(fā)現(xiàn)家族性AD患者相關基因（P S1，PS2和APP等）的突變導致Aβ的累積或致病性Aβ42的積累導致了異常的聚集；關于Aβ的降解過程的研究相對較少。近幾年的研究表明，對于90%的散發(fā)型AD患者，Aβ降解失衡可能是導致Aβ增多引發(fā)AD的基本原因，因此本研究討論H102對Aβ的降解和清除過程的影響，探討相關信號通路在Aβ降解過程中的重要作用。

PI3K/AKT信號通路與細胞內(nèi)多種調(diào)節(jié)相關，是細胞周期調(diào)控和細胞凋亡的關鍵通路之一，該通路通過激活PI3K下游的AKT來發(fā)揮作用。許多細胞的生存和繁殖受到PI3K/AKT信號通路的調(diào)控，通過配體與受體之間的相互作用使下游信號級聯(lián)介質(zhì)激活［12-13］。體外研究表明，erythropoietin可以通過PI3K/AKT信號通路對PC12細胞進行保護作用，防止Aβ誘導細胞凋亡［14］，PI3K/AKT信號通路在AD的發(fā)生、發(fā)展乃至治療中起著重要的作用。

IDE基因位于染色體10q，對于AD的發(fā)生產(chǎn)生一定的影響［15-16］，對Aβ42具有遺傳相關性［17］。研究表明IDE表達的增加［6］以及催化活性的增加［7］會導致遺傳性AD的降低。還有研究表明，IDE可能是胰島素信號傳導途徑的下游目標的調(diào)節(jié)器。調(diào)節(jié)胰島素信號通路，可以對IDE產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，增加IDE表達［18］。在以往的實驗中，我們已經(jīng)證明雙轉(zhuǎn)基因小鼠中Aβ的mRNA和蛋白水平明顯高于正常；H102實驗組則有明顯的降低，然而IDE的表達量卻有所升高［9-19］，表明H102以某種方式負向調(diào)節(jié)Aβ。

ITGB5是整合素家族的成員，有兩條不同的鏈，整合素對于信號通路的調(diào)節(jié)具有重要作用，可以通過調(diào)節(jié)細胞信號的跨膜蛋白激酶如受體酪氨酸激酶（RTK）來發(fā)揮作用，通過基因芯片技術，我們發(fā)現(xiàn)：ITGB5的表達在AD模型組明顯高于對照組，而H102組明顯降低且與正常對照組無顯著差異。而PI3K是細胞存活的一個啟動子作用在ITGB5下游，ITGB5可能負調(diào)節(jié)PI3K。

本研究通過Morris水迷宮測試發(fā)現(xiàn)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學習記憶能力較C57BL/6J小鼠明顯減弱，H102給藥組相較于模型組，其學習記憶能力有明顯提高，Real-time PCR的結果顯示模型組PI3K的mRNA水平均低于對照組和給藥組，模型組ITGB5的mRNA水平均高于對照組和給藥組；免疫組化的結果顯示模型組腦內(nèi)PI3K和AKT蛋白表達低于對照組和給藥組；Western blot的結果顯示模型組腦內(nèi)的PI3K、p-AKT蛋白表達均低于對照組和給藥組。實驗結果表明APP/PS1小鼠的PI3K/ AKT信號通路受到了抑制，β片層阻斷肽H102可以降低ITGB5的表達，增強PI3K、AKT、p-AKT的表達，可能經(jīng)由ITGB5，影響PI3K/AKT信號傳導途徑，使IDE活性增加，促進Aβ的降解清除，進而提高AD模型小鼠的學習記憶能力。

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（2016-03-03收稿）

Effect of β-sheet breaker peptide on learning and mem ory and PI3K/AKT signaling pathway in AD model m ice

FU Xue-fei，LI Jing，SUN Feng-xian，YUAN Xiao-yong，WANG Chao，XU Shu-mei
（Department of Physiology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

Objective：To observe the effects of H102 on the learming and memory ability in Alzheimer's disease mice and to explore the mechanism of H102 participating in Aβ metabolism.M ethods：（1）The mice were random ly divided into normal group，model group and H102 group，and were treated with intranasal administrated，5 μL/d.Morris water maze test was used to record different changes in spatial memory of mice.（2）Immunohistochemistry was used to detect a specific protein，and RT-PCR and western blot to detect the expression of P85 and pAKT.Results：（1）Morris water maze test showed the H102 group in place navigation and spatial probe test was superior to the model group，with statistical significance.（2）The level of PI3K mRNA decreased significantly in the model group，with H102 group significantly higher；ITGB5 mRNA levels were significantly lower in H102 group，and there were significant differences between the model and the H102 group.（3）Expression of PI3K（P85）and pAKT in H102 group had significantly increased as compare to the model group.（4）PI3K and AKT immunohistochemistry showed that positive staining cells in the cerebral cortex and hippocampus of H102 group were significantly increased compared with the model group.Conclusion：H102 through the PI3K/AKT pathway of the insulin signaling pathway could increase the expression of IDE，which may further promote the endocytosis and degradation of Aβ in the brain，thus accelerating Aβ degradation，and enhancing therapeutic effect of AD treatment.

β-sheet breaker peptide；APP/PS1 transgene mice；morris water maze；PI3K/AKT signaling pathway；Alzheimer's disease

R338

A

1006-8147（2016）05-0391-05

付雪斐（1990-），女，碩士在讀，研究方向：生理學；通信作者：徐淑梅：E-mail： xushm@tijmu.edu.cn。