王麗寧，范曉東，孫二琳，李娜，盧炳新，雷銘德，丁娜，孫巖，韓瑞發(fā)

（天津市泌尿外科研究所，天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津300211）

論著

重組hIFN-α-2b-BCG抗腫瘤效應(yīng)的體外研究

王麗寧，范曉東，孫二琳，李娜，盧炳新，雷銘德，丁娜，孫巖，韓瑞發(fā)

（天津市泌尿外科研究所，天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津300211）

目的：了解重組hIFN-α-2b-BCG（rBCG）體外抗腫瘤的作用效果和作用機(jī)制。方法：體外共培養(yǎng)后，透射電鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)rBCG對(duì)人膀胱腫瘤EJ細(xì)胞的影響。吖啶橙染色觀察各組腫瘤細(xì)胞形態(tài)。MTT法檢測(cè)rBCG對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。ELISA檢測(cè)rBCG作用后淋巴細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子水平。LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)rBCG激活的淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。結(jié)果：BCG和rBCG作用后的腫瘤細(xì)胞在透射電鏡下和吖啶橙染色后均有顯著變化。MTT顯示rBCG的生長(zhǎng)抑制率顯著高于BCG和BCG+IFN-α-2b組。rBCG對(duì)淋巴細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子有影響，同時(shí)rBCG激活的淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。結(jié)論：重組BCG在體外有優(yōu)于BCG的免疫調(diào)節(jié)特性、抗腫瘤作用和直接細(xì)胞毒作用。

重組BCG；IFN-α-2b；膀胱腫瘤；免疫療法

膀胱癌是最常見的泌尿系惡性腫瘤［1］。在我國(guó)，膀胱癌居泌尿系惡性腫瘤發(fā)病第1位，近年來(lái)發(fā)病率及死亡率有增高的趨勢(shì)［2］?？ń槊纾˙CG）膀胱腔內(nèi)灌注用于預(yù)防和治療淺表膀胱癌，是膀胱腫瘤最有效的生物治療法之一［3］，同時(shí)與膀胱化療相比BCG在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)上有明顯的優(yōu)勢(shì)［4-5］。但因BCG的毒副作用和大約40%的患者對(duì)BCG的耐藥［6］，限制了其廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，干擾素-α（IFN-α）作為二線藥物用于膀胱灌注治療膀胱腫瘤，對(duì)BCG無(wú)反應(yīng)的部分患者有效，且局部和全身毒性較?。?］。INF-α除了單獨(dú)應(yīng)用或與BCG聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)中均已得到證實(shí)的優(yōu)點(diǎn)外，也存在費(fèi)用昂貴、半衰期短、水溶性易隨尿液流失等缺點(diǎn)［8］。因此，能夠合成具有持續(xù)表達(dá)分泌IFN-α功能的重組BCG即可克服上述缺點(diǎn)。重組BCG是應(yīng)用基因工程技術(shù)，將BCG改造成具有攜帶和表達(dá)外源基因的能力。前期筆者已經(jīng)構(gòu)建一種重組hIFN-α-2b-BCG（rBCG），以期能夠發(fā)揮二者優(yōu)勢(shì)，同時(shí)去除聯(lián)合應(yīng)用中的一些不利因素。本文將重組hIFN-α-2b-BCG和人膀胱癌株EJ在體外共同培養(yǎng)，采用透射電鏡、熒光染色和流式細(xì)胞儀等方法，了解其體外抗腫瘤的作用效果和作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料丹麥2株BCG D2BP302來(lái)自北京生物制品研究所；重組hIFN-α-2b-BCG為本所自行構(gòu)建保存［9］；人膀胱癌細(xì)胞為EJ細(xì)胞系傳代培養(yǎng)，本所保存。主要試劑：胰蛋白酶，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；青霉素100 U/μL+鏈霉素100 μg/μL；吖啶橙，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；乳酸脫氫酶試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；MTT試劑，Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)BCG的培養(yǎng)：7H9培養(yǎng)基50 mL加入1 mL rBCG或BCG，37℃，飽和濕度，150 r/min搖床內(nèi)連續(xù)震蕩培養(yǎng)；7 d左右傳一代，根據(jù)需要選取不同時(shí)期的菌液，洗滌后溶于PBS，測(cè)定A600值1.0（約2.7×107CFU）用于實(shí)驗(yàn)。

外周血淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)：采集健康成人志愿者新鮮外周血；密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱靜置4 h，收集非附壁細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染液檢查所分離的細(xì)胞活性：計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，活性在95%以上。

膀胱癌株EJ的培養(yǎng)：按常規(guī)方法培養(yǎng)（含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基+雙抗），實(shí)驗(yàn)前兩天換用不含抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，以消除雙抗對(duì)BCG活性的影響。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)完全貼壁后，以實(shí)驗(yàn)終濃度0.01OD分別加入rBCG和BCG，于37℃，5%CO2，飽和濕度孵箱中培養(yǎng)24、48和72 h。以加PBS的細(xì)胞作為空白對(duì)照，分別在透射電鏡和熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2透射電鏡形態(tài)學(xué)觀測(cè)倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)重組BCG對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的影響。透射電鏡觀察：制備單細(xì)胞懸液，離心收集沉淀，2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定過夜，0.2 mol/L蔗糖磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸后固定，脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片后醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM-2000EX透射電鏡下觀察。

1.2.3熒光染色細(xì)胞爬片吖啶橙染色：蓋玻片置6孔板中，加腫瘤細(xì)胞懸液，待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加3 mL RPMI-1640液，過夜，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)完全正常后，加入0.01OD重組BCG或野生BCG，培養(yǎng)環(huán)境同上。4%多聚甲醛常溫固定20 min，（1）吖啶橙染色3～5 min，PBS漂洗；（2）1%鹽酸泡5 s，PBS漂洗；（3）CaCl2脫色3～5 min；（4）熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 MTT法檢測(cè)重組BCG對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（1）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EJ膀胱腫瘤細(xì)胞1×105/mL密度接種于96孔板中，培養(yǎng)6 h完全貼壁后分別加入rBCG、BCG、BCG加干擾素的混合成分（外源性IFN-α-2b按照rBCG上清液中干擾素的相當(dāng)量加入），濃度為0.01OD，設(shè)只加培養(yǎng)基的腫瘤細(xì)胞為空白對(duì)照組，于37℃，5%CO2中培養(yǎng)24、48和72 h。（2）每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加DMSO充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔570 nm光吸收值，取每組6的均值。（3）細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組MTT值-處理組MTT值）/對(duì)照組MTT值×100%。

1.2.5 ELISA檢測(cè)rBCG對(duì)PBMC分泌Th1型細(xì)胞因子的作用從健康受試者新鮮血液中提取PBMC，rBCG、BCG和BCG+IFN-α-2b分別在24孔板中與PBMC共培養(yǎng)。最終菌濃度為1.4×106CFU/ mL，細(xì)胞濃度為1.0×105cells/mL。僅包含PBMC樣品的作為空白對(duì)照。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在12、24、48和72 h分別收集上清液并儲(chǔ)存在-70℃。用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-12。

1.2.6 LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)BCG激活的淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)（1）分離淋巴細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)2 h，調(diào)整濃度至4×105/mL；和重組BCG及野生型BCG共同培養(yǎng)（濃度同上），37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)72 h。（2）乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞為激活的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組淋巴細(xì)胞，靶細(xì)胞為EJ膀胱癌細(xì)胞，效靶比例為50∶1。（3）取增殖淋巴細(xì)胞與EJ細(xì)胞各0.1 mL混勻，37℃、5%CO2孵育4 h；（4）上清37℃預(yù)溫10 min，加新配的底物液，紫外分光儀在340 nm波長(zhǎng)下讀取30 s，1 min，2 min，3 min的A值。（5）殺傷活性（%）=實(shí)驗(yàn)組LDH-L-自然釋放LDH-L/最大釋放LDH-L-自然釋放LDH-L×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用one way-ANOVA法分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異有極顯著意義。

2　結(jié)果

2.1光鏡下重組BCG影響EJ細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化空白對(duì)照組：光鏡下，傳代培養(yǎng)后，EJ細(xì)胞逐漸貼壁生長(zhǎng)，12 h后細(xì)胞陸續(xù)有突起伸出，細(xì)胞核變大同時(shí)核漿比例變大，染色質(zhì)不均勻，可見核分裂相。rBCG或BCG與之共培養(yǎng)組：細(xì)胞折光性逐漸降低，胞漿內(nèi)顆粒狀物質(zhì)、胞突逐步消失而細(xì)胞逐漸變粗變短，核漿比例變小。48 h后細(xì)胞明顯變小且變圓，胞突消失，部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)并聚集成團(tuán)狀，可見其周圍有菌群包繞。72 h變化明顯，胞漿可見大量顆粒狀物質(zhì)和空泡，細(xì)胞分布稀疏，部分細(xì)胞有溶解壞死表現(xiàn)（圖1）。

圖1　光鏡下EJ細(xì)胞的形態(tài)Fig 1 Cellu lar m orphology under invert m icroscope

2.2透射電鏡下腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化正常EJ細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形，表面有大量的微絨毛，胞漿內(nèi)有豐富線粒體，可見發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞核大且有清晰的核仁，有的可見多個(gè)核仁（圖2A）。BCG或rBCG作用后48 h可見細(xì)胞表面微絨毛減少（圖2B），72 h可見細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體腫脹，出現(xiàn)空泡樣變性，細(xì)胞核染色質(zhì)溶解，細(xì)胞質(zhì)壞死，細(xì)胞表面微絨毛減少（圖2C）。

2.3熒光染色的結(jié)果觀察正常細(xì)胞體積較小，胞核呈黃綠色熒光，有核分裂相出現(xiàn)，胞質(zhì)呈橘紅色熒光，核漿比例大，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。rBCG或BCG作用后，24 h變化不明顯，48 h后細(xì)胞增殖減慢，并聚集成團(tuán)狀，胞突逐漸消失而胞體逐漸變短變粗，細(xì)胞核逐漸縮小，核漿比例變小，可見細(xì)胞膜呈泡狀突出。72 h后細(xì)胞逐漸分布稀疏，染色時(shí)極易脫片（圖3）。凋亡細(xì)胞周圍出現(xiàn)典型的花瓣樣結(jié)構(gòu)（圖3D箭頭所示）。

2.4 rBCG對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1示rBCG與BCG相比對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞有明顯的抑瘤效果（P＜0.05），與BCG加干擾素組相比，24和48 h二者無(wú)明顯差異（P均＞0.05）?？梢娚L(zhǎng)抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高，72 h點(diǎn)rBCG的生長(zhǎng)抑制率顯著高于其他各組（P均＜0.05）。

2.5 ELISA檢測(cè)rBCG對(duì)PBMC分泌Th1型細(xì)胞因子的作用與BCG組和BCG+IFN-α-2b組相比，rBCG誘導(dǎo)的PBMC產(chǎn)生的hIFN-γ水平顯著增加（P均=0.00）。各組間12 h和24 h的IL-12水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）；2 d和3 d時(shí)，rBCG組顯著高于其他2組（P均＜0.05）。TNF-α在12 h的表達(dá)量各組均有顯著增加，但無(wú)明顯差異（P＞0.05）；隨后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)rBCG組TNF-α的水平明顯高于其他組（P均＜0.05）。見表2～4。

圖2　透射電子顯微鏡下EJ細(xì)胞的形態(tài)Fig 2 Cellular morphology under transm ission electron m icroscope

圖3　經(jīng)吖啶橙染色后熒光顯微鏡下EJ細(xì)胞的形態(tài)Fig 3 Cellu lar morphology under fluorescence m icroscope by acridine orange staining

表1　膀胱腫瘤細(xì)胞抑制率（%）Tab 1 Inhibition rate of bladder cancer cell（%）

表2　各組誘導(dǎo)的PBMC產(chǎn)生的h IFN-γ的水平（pg/m L）Tab 2 The h IFN-γ secretion from induced PBMC of every group（pg/m L）

表3　各組誘導(dǎo)的PBMC產(chǎn)生的IL-12的水平（pg/m L）Tab 3 The IL-12 secretion from induced PBMC of every group（pg/m L）

表4　各組誘導(dǎo)的PBMC產(chǎn)生的TNF-α的水平（pg/m L）Tab 4 The TNF-α secretion from induced PBMC of every group（pg/m L）

2.6rBCG激活淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的作用rBCG和BCG激活的淋巴細(xì)胞殺傷活性見表5，rBCG激活的淋巴細(xì)胞的殺傷活性是單純淋巴細(xì)胞的2.67～6.74倍，是BCG的1.64～2.45倍，是BCG＋I(xiàn)FN的1.25～1.66倍。單純未經(jīng)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活性較低，對(duì)EJ細(xì)胞的殺傷活性明顯低下（7.60%）；淋巴細(xì)胞經(jīng)過不同濃度BCG刺激培養(yǎng)后被激活，對(duì)EJ細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)（12.38%～20.89%）（P＜0.05）；淋巴細(xì)胞經(jīng)過外源性IFN-α+ BCG作用后，其殺傷活性作用（15.78%～34.72%）又較BCG明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；rBCG殺傷活性為實(shí)驗(yàn)組最高（20.31%～51.22%）（P＜0.05）。各不同成分組都隨著劑量從2.5～10 μL升高BAK殺傷活性也增高，20 μL均降低，10.0 μL組的BAK殺傷活性最高（P＜0.05）。

表5　不同濃度各種成分刺激淋巴細(xì)胞殺傷活性比較（%）Tab 5 Cell killing activity of lymphocyte stimulated by different concentration of each element（%）

3　討論

BCG作為一種活的、減毒分支桿菌，具有很強(qiáng)的免疫佐劑功能，對(duì)膀胱腫瘤有較好的治療效果［10］。BCG被認(rèn)為通過調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用［11］。根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，rBCG或BCG單獨(dú)作用于培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，可以產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，直接殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞，與Rajala等［12］結(jié)論一致。研究表明，BCG具有直接的細(xì)胞毒性作用［13］，可能與BCG影響溶酶體膜蛋白的表達(dá)參與凋亡過程有關(guān)［14］。有研究表明BCG能夠通過影響與侵犯線粒體膜，進(jìn)而影響細(xì)胞呼吸和能量代謝［15］破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境致細(xì)胞死亡。

此外，無(wú)論BCG還是rBCG對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷都體現(xiàn)出時(shí)間依賴性，也就是說，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)BCG對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果逐漸加強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的觀察說明BCG和rBCG直接接觸均對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯破壞作用。以往研究發(fā)現(xiàn)BCG可以附著于靶細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)宿主細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，BCG的細(xì)胞毒能夠破壞腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境［16］。細(xì)胞膜的完整及正常的通透性在維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)中起重要作用，微絨毛是細(xì)胞膜的一部分，其作用是增加細(xì)胞膜表面積，增加細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)及信息的交換。本實(shí)驗(yàn)中，rBCG的細(xì)胞毒造成細(xì)胞膜微絨毛脫落減少、細(xì)胞膜表面出泡，影響了細(xì)胞正常的代謝，結(jié)果就是細(xì)胞死亡和細(xì)胞數(shù)量的減少。這同膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率MTT測(cè)定結(jié)果一致，膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不同程度的被抑制。與BCG相比，rBCG對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞有更明顯的抑瘤效果，與BCG加干擾素對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率一致，但隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，rBCG的膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于其他兩組。在刺激PBMC分泌Th1型細(xì)胞因子方面rBCG遠(yuǎn)大于BCG和BCG加干擾素組。同時(shí)rBCG在激活淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的殺傷作用上也明顯高于其他兩組。研究提示多種細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-18等本身對(duì)癌細(xì)胞也起抗增殖作用［11］，可經(jīng)由多種信號(hào)途徑誘發(fā)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡。故此提示，分泌人IFN-α-2b的rBCG可能有更強(qiáng)的抗腫瘤免疫作用。

上述一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，該重組BCG對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞有明顯的抗瘤效果，不但自身表現(xiàn)出抗瘤活性，還可以提高免疫細(xì)胞抗腫瘤免疫的能力。重組BCG的發(fā)展前景令人鼓舞，需要對(duì)其作用和機(jī)制等問題進(jìn)行更深入的研究。

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（2016-03-08收稿）

Study on antitumor effect of recombinant h IFN-α-2b-BCG in vitro

WANG Li-ning，F(xiàn)AN Xiao-dong，SUN Er-lin，LI Na，LU Bing-xin，LEI Ming-de，DING Na，SUN Yan，HAN Rui-fa
（Tianjin Institute of Urology，Department of Urology，The Second Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China）

O bjective：To study antitumor effect and mechanism of action on recombinant IFN-α-2b-BCG（rBCG）in vitro.

M ethods：Effect of rBCG on bladder tumor cells was observed through transmission electro microscopy and microscope.Acridine orange staining was used to observe the tumor cellsmorphology by fluorescence microscope.Growth inhibition rate on tumor cell was detected by MTT assay.Effect of rBCG cultures on secretion of Th1-type cytokines was detected by ELISA assay.LDH release assay was applied to determine the lethal effect of active lymphocyte which was stimulated by BCG on tumor cells.Results：The rBCG group showed significant changes.MTT showed rBCG inhibited the proliferation of bladder cancer cell，and more active other groups.RBCG cultures affected the section of Th1 cytokines.And rBCG could enhanced the lethal effect of lymphocyte on tumor cells.Conclusion：The rBCG may have more immunomodulatory properties，anti-tumor effects and cytotoxicity in vitro.

recombinant BCG；IFN-α-2b；bladder tumor；immunotherapy

論著

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81402095）；天津市科委抗癌重大科技專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（12zcdzsy16900）；天津市衛(wèi)計(jì)委科技基金資助項(xiàng)目（2014KZ104）

王麗寧（1989-），女，研究實(shí)習(xí)員，學(xué)士，研究方向；泌尿外科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)；通信作者：孫二琳，E-mail：irene-sunsun@163.com。

R737.14

A

1006-8147（2016）05-0377-04