趙永烈，胡 坤，岳廣欣

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芎芷地龍湯對偏頭痛模型三叉頸復合體PKCγ、NMDAR1作用的研究

趙永烈1，2，胡 坤2，岳廣欣3

目的 研究芎芷地龍湯對偏頭痛動物模型三叉頸復合體內(nèi)PKCγ、NMDAR1的影響。方法 將健康雄性SD大鼠隨機分為生理鹽水對照組、偏頭痛模型組、芎芷地龍湯組、舒馬普坦組，每組8只。給藥干預后，皮下注射硝酸甘油注射劑10 mg/kg制作偏頭痛動物模型，在皮下注射藥物后4 h后采集標本，用Western印跡分析法測定三叉頸復合體內(nèi)NMDAR1、PKCγ、pNMDAR1(Ser896)、pPKCγ (Thr514) 蛋白表達水平。結(jié)果 偏頭痛模型組三叉神經(jīng)脊束核PKCγ、NMDARl含量與生理鹽水對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而pPKCγ(Thr514)、pNMDAR1(Ser896)含量較生理鹽水對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，給予藥物干預后，芎芷地龍湯組和舒馬普坦組PKCγ、NMDARl含量與偏頭痛模型組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而pPKCγ(Thr514)、p NMDAR1(Ser896)含量較偏頭痛模型組顯著降低，芎芷地龍湯組、舒馬普坦組與偏頭痛模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論 偏頭痛傷害性信號的傳導與三叉頸復合體內(nèi)PKCγ和NMDARl磷酸化蛋白表達增多有關(guān)，芎芷地龍湯和舒馬普坦均可抑制三叉頸復合體PKCγ和NMDARl磷酸化蛋白表達。

偏頭痛；芎芷地龍湯；蛋白激酶Cγ；N-甲基-D-天冬氨酸受體1

研究表明：在偏頭痛發(fā)生過程中，傷害性信息匯聚到由頸脊髓背角的C1和C2和三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)部(TNC)組成的三叉頸復合體(TCC)，然后進一步上升到腦干不同的腦區(qū)和較高的腦結(jié)構(gòu)(下丘腦和丘腦)、大腦皮層，從而產(chǎn)生多種臨床癥狀。在傷害性信息感受過程中，有多種信號轉(zhuǎn)導通路，其中蛋白激酶C(PKC)是重要的細胞內(nèi)信號傳導分子，是作為第二信使通路與c-fos(即早基因蛋白表達)偶聯(lián)，被廣泛應(yīng)用作為神經(jīng)元和痛覺激活的標志?；罨腜KC 可取消Mg2+對NMDAR的阻斷，增強受體通道的開放；此外，PKC可通過磷酸化NR1亞基胞質(zhì) C-末端的S-890、S-896 等多個絲氨酸位點，明顯增強 NMDA 受體的功能[1-2]。因此，PKC、NMDAR信號通路可能在偏頭痛的病理生理過程中發(fā)揮了重要的作用。

前期我們觀察了芎芷地龍湯對偏頭痛模型有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用[3-4]，為進一步研究其作用機制，本實驗以硝酸甘油誘發(fā)偏頭痛動物模型，觀察三叉頸復合體PKCγ、NMDAR1的蛋白表達及磷酸化表達情況，研究芎芷地龍湯對PKC、NMDAR的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級成年雄性SD大鼠，體重200 g±20 g；由維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 藥品與試劑 芎芷地龍湯(川芎、白芷、生石膏、地龍、元胡)由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院制劑室提取(每毫升含生藥2.0 g)；硝酸甘油注射液(5 mg/mL)， 北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；琥珀酸舒馬普坦片，每片25 mg，海南先聲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；兔抗大鼠NMDAR1抗體；兔抗大鼠PKCγ抗體；兔抗大鼠pNMDAR1(Ser896)抗體；兔抗大鼠pPKC γ (Thr514)抗體；β-actin 抗體，Santa Cruz 公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將SD 大鼠隨機分為4組：生理鹽水對照組、偏頭痛模型組、芎芷地龍湯組、舒馬普坦組。生理鹽水對照組、模型組灌胃生理鹽水；芎芷地龍湯組灌胃芎芷地龍湯10.8 g/kg；舒馬普坦組灌胃舒馬普坦6 mg/kg。

1.2.2 造模及給藥方法 生理鹽水對照組：給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃7 d，普通飼養(yǎng)，灌胃30 min后頸背部皮下注射2 mL/kg 生理鹽水。偏頭痛模型組：給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃7 d，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射10 mg/kg(5 mg/mL)硝酸甘油。芎芷地龍湯組：其他處理同偏頭痛模型組，給予10.8 g/(kg·d) 芎芷地龍湯灌胃7 d，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射10 mg/kg(5 mg/mL)硝酸甘油。舒馬普坦組：其他處理同偏頭痛模型組，給予琥珀酸舒馬普坦6 mg/(kg·d) 灌胃7 d，灌胃30 min后頸背部皮下注射10 mg/kg(5 mg/mL)硝酸甘油。

1.2.3 標本的制備 動物皮下注射硝酸甘油注射劑或生理鹽水后4 h采集標本。在戊巴比妥鈉60 mg/kg 腹腔注射麻醉，斷頭取腦，快速將大鼠頸髓取出，并放入-70 ℃冰箱保存，以備進行Westen-Blot檢測。

1.2.4 Western印跡法檢測NMDAR1、PKCγ、pNMDAR1(Ser896)、pPKCγ(Thr514)蛋白表達

1.2.4.1 蛋白的提取 取凍存的含三叉頸復合體該節(jié)段的腦組織放入Eppendorf管中，加入0.5 mL裂解液，冰浴中機械勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心45 min，吸出上清。采用Folin-酚試劑法進行蛋白定量后，-20 ℃保存待用。

1.2.4.2 Western印跡分析 取腦組織勻漿液20 μL，用10%的SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離膠中的蛋白經(jīng)水浴式電轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜上，經(jīng)10%脫脂奶粉封閉1 h后，分別于兔抗鼠NMDAR1多克隆抗體(1∶300稀釋)、兔抗鼠PKCγ多克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗鼠NMDAR1Ser896位點磷酸化多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗鼠PKCγThr514位點磷酸化多克隆抗體(1∶800稀釋)中孵育過夜。充分沖洗轉(zhuǎn)印膜，將膜放入HRP標記的二抗(1∶1 000稀釋)中室溫孵育2 h。ECL 發(fā)光試劑盒顯像，顯影于感光膠片上，經(jīng)透射掃描儀(SHARP JX330，Janpan)掃描膠片，用phoretix 1D 凝膠分析軟件檢測條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核PKCγ和pPKCγ(Thr514)表達 偏頭痛模型組三叉神經(jīng)脊束核PKCγ含量較生理鹽水對照組有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而pPKCγ(Thr514)含量較生理鹽水對照組升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，給予藥物干預后，芎芷地龍湯組和舒馬普坦組PKCγ含量較偏頭痛模型組有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而pPKCγ(Thr514)含量較偏頭痛模型組降低明顯，芎芷地龍湯組、舒馬普坦組與偏頭痛模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見圖1。

注：與生理鹽水組比較，##P<0.01；與偏頭痛模型組比較，**P<0.01。

圖1 大鼠TCC內(nèi)PKCγ、pPKCγ(Thr514) 蛋白表達及芎芷地龍湯的干預作用

2.2 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核NMDAR1和pNMDAR1(Ser896)表達 偏頭痛模型組三叉神經(jīng)脊束核NMDAR1含量較生理鹽水對照組有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而pNMDAR1(Ser896)含量較生理鹽水對照組升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，給予藥物干預后，芎芷地龍湯組和舒馬普坦組PKCγ含量較偏頭痛模型組有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而pNMDAR1(Ser896)含量較偏頭痛模型組降低明顯，芎芷地龍湯組、舒馬普坦組與偏頭痛模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見圖2。

注：與生理鹽水組比較，##P<0.01；與偏頭痛模型組比較，**P<0.01。

圖2 大鼠頸髓組織內(nèi)NMDAR1、pNMDAR1(Ser896)蛋白的表達及芎芷地龍湯的干預作用

3 討 論

大量的證據(jù)表明：偏頭痛的發(fā)生和發(fā)展取決于支配腦組織(主要是腦膜及大血管)的三叉神經(jīng)感覺傳入神經(jīng)纖維的激活和敏化[5-7]。在不同亞型和不同程度的偏頭痛中，軟腦膜、硬腦膜或顱外動脈周圍感覺傳入神經(jīng)都會參與偏頭痛的發(fā)病過程。對于大鼠，腦血管周圍纖維具有相似的中心投射，這些投射纖維終止在由頸脊髓背角的C1和C2和三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)部組成的三叉頸復合體。TCC直接與腦干不同的腦區(qū)和較高的腦結(jié)構(gòu)(下丘腦和丘腦)相連接，然后進一步上升與大腦皮層相連接[8-11]。TCC不僅接受來自腦血管周圍纖維的中心投射，還接收來自皮質(zhì)、腦干和下丘腦傷害性痛覺調(diào)節(jié)神經(jīng)核的下行投射[9]，在神經(jīng)信號傳導和痛覺的傳遞起著承上啟下的作用。

在神經(jīng)系統(tǒng)的傷害性感受過程中，有多種信號轉(zhuǎn)導通路。其中PKC是重要的細胞內(nèi)信號傳導分子，是作為第二信使通路與c-fos(即早基因蛋白表達)偶聯(lián)，被廣泛應(yīng)用作為神經(jīng)元和痛覺激活的標志。在不同的解剖水平(外周神經(jīng)終末，脊髓和脊髓上的部位)，PKC集成了眾多的受體通路進入可增加興奮性信號和減少抑制性信號的最終效應(yīng)器，進而誘發(fā)疼痛的產(chǎn)生[12]在靜息狀態(tài)，細胞中PKC主要存在于細胞漿中，當細胞受到刺激后，PKC從胞漿向胞膜移位，此過程稱之為轉(zhuǎn)位。PKC膜轉(zhuǎn)位是PKC激活的一種表現(xiàn)形式。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，PKC的激活可引起細胞內(nèi)許多底物蛋白的磷酸化，開啟或調(diào)節(jié)著各種神經(jīng)信號通路，進而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[13]。PKC活性增強能減少Mg2+對NMDA受體的阻滯，促進NMDA受體通道的打開，導致痛覺過敏的形成[14]。PKC是一類Serine/Threonine蛋白激酶家族，按其對Ca2+和甘油二酯的依賴性不同，可以分為三個主要的亞家族：經(jīng)典型PKC(α，βⅠ，βⅡ，γ)，新型PKC(δ，ε，η，θ)非經(jīng)典型PKC(ζ，λ/ι)[15]。其中PKCγ亞單位為腦、脊髓所獨有，在疼痛信號處理及中樞敏感化誘導和維持中起重要作用[16-17]。在此實驗中檢測了TCC中PKCγ和磷酸化PKCγ(Thr514) 蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)給予一氧化氮(NO)供體硝酸甘油后，PKCγ的蛋白表達水平與生理鹽水對照組相比并無明顯變化，而磷酸化PKCγ(Thr514) 蛋白表達水平較生理鹽水組明顯升高，提示PKC的激活一方面通過膜轉(zhuǎn)位(蛋白表達量無變化)，另一方面通過磷酸化(蛋白表達量有變化)進而引起傷害性信號的傳導。

NMDAR廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，不僅對神經(jīng)信號的傳遞和基因表達的調(diào)控起著主要作用，而且還影響大腦的認知功能和腦細胞的生長。過度激活的NMDAR是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病因，末梢組織或神經(jīng)損傷引起的疼痛與NMDAR的激活有關(guān)。目前已鑒定的NMDARs的亞基有NR1、NR2 (A-D )和NR3(A-B)，其中NR1是該受體復合物的功能亞單位，對NMDAR的功能構(gòu)成起著至關(guān)重要的作用[18]?，F(xiàn)已知NMDA受體的突觸表達受一系列蛋白激酶的調(diào)控。資料顯示：活化的PKC可取消Mg2+對NMDA受體的阻斷，增強受體通道的開放[19]；此外，PKC也可通過磷酸化NR1亞基胞質(zhì)C-末端的S-890，S-896等多個絲氨酸位點[1，20]，明顯增強NMDA受體的功能。近年來的研究表明：谷氨酸其受體NMDAR參與了CSD、三叉血管系統(tǒng)激活及中樞敏感化等與偏頭痛密切相關(guān)的病理生理過程[21]。Dohrn等[22]研究發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核淺層大多數(shù)含一氧化氮合酶的神經(jīng)元表達NMDAR1mRNA，提示NMDAR1可能調(diào)節(jié)大部分一氧化氮的活動，谷氨酸由三叉血管系統(tǒng)初級傳入，釋放激活三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核內(nèi)的NMDAR，NMDAR的激活反過來引起一氧化氮的釋放。莊志業(yè)等[23]用免疫組織化學染色技術(shù)研究表明：NMDAR1陽性胞體和纖維主要分布在三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核淺層，N-甲基-D-天冬氨酸型受體1和2A/B亞單位免疫陽性胞體和纖維密集分布于大鼠三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核的淺層(Ⅰ，Ⅱ?qū)?，磷酸激活的谷胺酰胺酶和谷氨酸免疫陽性胞體分布于三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核各層，尤以淺層密集，磷酸激活的谷氨酰胺酶和谷氨酸陽性纖維及終末樣結(jié)構(gòu)主要分布于三叉神經(jīng)尾側(cè)亞核淺層。本研究檢測了TCC中NMDAR1和磷酸化NMDAR1(Ser896)蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)給予NO供體硝酸甘油后，NMDAR1的蛋白表達水平與生理鹽水對照組相比并無明顯變化，而磷酸化NMDAR1(Ser896) 蛋白表達水平較生理鹽水對照組明顯升高，提示NMDAR是通過磷酸化激活的變化參與偏頭痛傷害性信號的傳導過程。

本研究結(jié)果表明：偏頭痛傷害性信號的傳導與三叉頸復合體內(nèi)PKCγ磷酸化和NMDAR1 serine-896位點磷酸化蛋白表達增多有關(guān)，說明PKC、NMDAR的激活在頭痛發(fā)病中具有重要作用，芎芷地龍湯和舒馬普坦均可抑制三叉頸復合體pPKCγ(Thr514)和NMDAR1 serine-896位點磷酸化蛋白表達，說明芎芷地龍湯治療偏頭痛的靶點可能位于這一通路。

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(本文編輯郭懷印)

Research of Xiongzhi Dilong Decoction on PKCγ，NMDAR1 in the Trigeminocervical Complex in Migraine Animal

Zhao Yonglie，Hu Kun，Yue Guangxin

Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China；The Third Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Objective To study the effects of Xiongzhi Dilong decoction (XDD) on PKCγ，NMDAR1 in the trigeminocervical complex in migraine animal.Methods Healthy male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups：saline group，migraine model group，sumatriptan group and XDD group，8 rats in each group.The migraine animal model was made by subcutaneous injection of nitroglycerin (NTG).After administered with corresponding drug，specimens was collected after 4 hours of NTG subcutaneous injection.The protein expression levels of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor-1(NMDAR1)，protein kinase C (PKC)γ，pNMDAR1(Ser896)，pPKCγ (Thr514) in the trigeminocervical complex of migraine animal were assayed by western blot analysis.Results The protein expression level of pPKCγ(Thr514)，pNMDAR1(Ser896) in migraine model group were higher than that in saline group(P<0.01).After administration，the protein expression levels of pPKCγ(Thr514)，pNMDAR1(Ser896) were significantly decreased in XDD group and sumatriptan group compared with the migraine model group(P<0.01).Conclusion The conduction of pain signal in migraine is related to the expression of pPKCγ and pNMDAR1 in trigeminocervical complex.XDD and sumatriptan can inhibit the protein expression levels of pPKCγ and pNMDAR1 in trigeminocervical complex.

migraine；Xiongzhi Dilong decoction；protein kinase C γ；N-methyl-D-aspartate receptor-1

國家自然科學基金資助項目(No.81373591)；北京中醫(yī)藥大學自主選題(No.2013-JYBZZ-JS-096)

1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院(北京 100078)，E-mail：yongy3@126.com；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院；3.中國中醫(yī)科學院

引用信息：趙永烈，胡坤，岳廣欣.芎芷地龍湯對偏頭痛模型三叉頸復合體PKCγ、NMDAR1作用的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(19)：2248-2251.

R742.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.19.013

1672-1349(2016)19-2248-04

2016-04-01)