楊瑞薛，趙明鏡，雷 環(huán)，常 宏，趙一舟，吳愛明，楊 濤，韓小婉，王 蕾，李 彤

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

益氣活血解毒方對血管損傷后外膜早期炎癥和血管重構(gòu)的影響

楊瑞薛，趙明鏡，雷 環(huán)，常 宏，趙一舟，吳愛明，楊 濤，韓小婉，王 蕾，李 彤

目的 觀察球囊損傷血管內(nèi)膜后外膜早期炎癥和血管重構(gòu)的變化及益氣活血解毒方對其的影響。方法 實(shí)驗(yàn)采用球囊導(dǎo)管拉傷大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)膜模型，造模動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組、血府逐瘀組和益氣活血解毒組，另以假手術(shù)組作對照。灌胃給藥7 d后取材，行HE染色，觀察血管壁各層面積和厚度的變化，免疫組織化學(xué)染色，觀察血管壁各層單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)及巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD68表達(dá)的變化。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組血管內(nèi)膜面積明顯增大(P<0.01)，外膜變厚(P<0.05)，管腔變化不明顯，CD68的含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，益氣活血解毒方明顯減少血管內(nèi)膜的面積(P<0.05)，降低CD68的含量(P<0.01)。與血府逐瘀組相比，益氣活血解毒組外膜厚度明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 球囊損傷大鼠頸總動(dòng)脈早期，血管以正性重構(gòu)為主，外膜增厚和炎癥反應(yīng)明顯；益氣活血解毒方能有效改善血管重構(gòu)，可能與其能降低巨噬細(xì)胞浸潤，抑制外膜炎癥反應(yīng)有關(guān)。

血管重構(gòu)；球囊損傷；炎癥反應(yīng)；益氣活血解毒方

血管重構(gòu)性疾病，包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等，嚴(yán)重威脅著人類健康，是僅次于腫瘤的第二大致死因素。雖然這些疾病的病因有所不同，但血管重構(gòu)為它們共同的病理改變。炎癥參與血管重構(gòu)的早期反應(yīng)[1]，在血管成形術(shù)后再狹窄、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中發(fā)揮重要作用[2-4]，而炎癥因子如單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)及巨噬細(xì)胞(CD68為其特異性標(biāo)志物)促進(jìn)血管重構(gòu)性疾病的發(fā)生發(fā)展[5-6]，尤其在血管內(nèi)膜損傷的早期，外膜炎癥促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞的活化、增殖和遷移。本研究采用球囊損傷大鼠頸總動(dòng)脈模型，致血管內(nèi)皮損傷，觀察損傷術(shù)后7 d，血管內(nèi)中外膜面積和厚度的變化及各層MCP-1、CD68含量的變化，以探討益氣活血解毒方是否通過抑制球囊損傷后早期炎性反應(yīng)防治血管重構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠80只，體重380 g～420 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]，在北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 藥物 益氣活血解毒方：由黃芪、丹參、金銀花等組成，制成藥物濃度為1.2 g生藥/mL的水煎劑；血府逐瘀膠囊：天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，每粒0.4 g，批號：國藥準(zhǔn)字Z12020223；阿托伐他汀鈣片(立普妥)：輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，每片20 mg，批號：國藥準(zhǔn)字J20070061；低分子肝素鈉(吉派林)：杭州九源基因工程有限公司，每瓶0.3 mL，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H19990035；戊巴比妥鈉：北京化學(xué)試劑公司，進(jìn)口分裝，批號：020919；青霉素鈉：華北制藥股份有限公司，每瓶8×105U，批號：D0801320。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 CD68抗體(小鼠來源、單克隆抗體，標(biāo)記巨噬細(xì)胞)：Santa Cruz Biotechnology Inc.，100 μg/mL ，貨號：sc-59103；MCP-1抗體(兔來源、多克隆抗體)：Abcam公司，50 μg，貨號：ab7202；免疫組化試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器 自動(dòng)脫水、透明、浸蠟機(jī)：德國Leica公司，型號：ASP300；包埋機(jī)：德國Leica公司，型號：EG1140H；病理切片機(jī)：德國Leica公司，型號：RM2135；攤片機(jī)：德國Leica公司，型號：HI1210；烘片機(jī)：德國Leica公司，型號：HI1220；顯微鏡：日本OLYMPUS公司，BX60型顯微鏡；SPOT software V3.0 Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)：美國DIAGNOSTIC INSTRUMENTS公司。

1.5 球囊導(dǎo)管 美國Medtronic公司，規(guī)格：2 mm×20 mm。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 球囊損傷大鼠頸總動(dòng)脈造模方法 每只大鼠術(shù)前1 h按500 U/kg于背部皮下深部注射吉派林，1 h后1%戊巴比妥鈉40 mg/kg體重腹腔注射麻醉，仰臥位

頸部備皮消毒，結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，暫時(shí)阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈，夾閉左頸總動(dòng)脈，從左頸外動(dòng)脈切口插入球囊導(dǎo)管至頸總動(dòng)脈近心端，插入約4 cm后，以生理鹽水充盈球囊(壓力0.5 atm～0.7 atm)，緩慢向遠(yuǎn)心端回拉，球囊至頸總動(dòng)脈分叉處泄壓至0 atm，重新插入球囊導(dǎo)管至相同部位，如此反復(fù)操作3次。撤除球囊導(dǎo)管，結(jié)扎左頸外動(dòng)脈近心端，開通頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈血流，縫合傷口。以上手術(shù)過程均為無菌操作。術(shù)后每只大鼠腹腔注射青霉素4×105U/d ，共3 d，皮下深部注射吉派林500 U/kg，共2 d。假手術(shù)組不插入球囊導(dǎo)管做拉傷處理，其余步驟相同。

1.6.2 動(dòng)物分組及給藥 造模動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組、血府逐瘀組和益氣活血解毒組，以假手術(shù)組作為對照。術(shù)后第2天開始給藥，連續(xù)灌藥7 d。阿托伐他汀組大鼠按13.33 mg/kg給藥，血府逐瘀組按0.8 g/kg給藥，益氣活血解毒組藥物按12 g/kg生藥/mL給藥，均相當(dāng)于人臨床用量10倍，各組動(dòng)物給藥體積均為10.0 mL/(kg·d)。假手術(shù)組和模型組給等體積生理鹽水。

1.6.3 取材及標(biāo)本制作 術(shù)后第7天，常規(guī)腹腔麻醉大鼠，經(jīng)心臟灌流固定組織，取損傷左側(cè)頸總動(dòng)脈(從手術(shù)動(dòng)脈夾損傷外的近心端到鎖骨之間的頸總動(dòng)脈)，置于4%多聚甲醛固定48 h。常規(guī)制備蠟塊和病理切片。

1.6.4 HE染色及分析 病理切片經(jīng)脫蠟、乙醇水化、蘇木素-伊紅染色、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片等步驟制成HE染色標(biāo)本。通過圖像拍攝系統(tǒng)獲取照片(10×)后，使用圖像分析軟件(Image pro-Plus 6.0)計(jì)算形態(tài)學(xué)指標(biāo)：管腔面積、管壁面積(血管總面積-管腔面積)、血管總面積[(血管外周長/2π)2×π]、內(nèi)膜面積(內(nèi)彈性膜圍繞面積-管腔面積)、中膜面積(外彈性膜圍繞面積-內(nèi)彈性膜圍繞面積)、中膜厚度(外彈性膜周長/2π-內(nèi)彈性膜周長/2π)、外膜厚度(血管外周長/2π-外彈性膜周長/2π)。

1.6.5 免疫組織化學(xué)染色及分析 病理石蠟切片經(jīng)脫蠟、乙醇水化、抗原修復(fù)、3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶、一抗4 ℃過夜(MCP-1濃度1∶100，CD68濃度1∶50，PBS稀釋)、二抗37 ℃孵育、DAB顯色、乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片等步驟，制成免疫組化標(biāo)本。使用圖像拍攝系統(tǒng)在40倍鏡下選取3個(gè)最能反映整個(gè)血管全貌的視野，圖像分析軟件測量平均光密度及總光密度(陽性面積百分比×平均光密度)，取3個(gè)視野的平均值作為最終結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 血管壁面積、管腔面積與血管總面積的變化 球囊損傷后7 d，模型組及各藥物組血管壁面積較假手術(shù)組增大，其中模型組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、阿托伐他汀組及血府逐瘀組管腔面積較假手術(shù)組有輕微縮小，益氣活血解毒組與假手術(shù)組相比管腔無明顯縮小，但比血府逐瘀組面積有顯著增大(P<0.05)。其他各組與假手術(shù)組相比，血管總面積有所增大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

表1 各組血管壁面積、管腔面積與血管總面積的變化(±s) mm2

2.2 血管壁各層面積和厚度的變化 球囊損傷后7 d，血管內(nèi)膜不同程度增生。各藥物組內(nèi)膜面積有輕度減小，其中益氣活血解毒組效果顯著，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組血管外膜厚度明顯增加(P<0.05)；其他各組血管中膜的厚度、面積均無明顯變化；阿托伐他汀組與益氣活血解毒組外膜厚度均較血府逐瘀組明顯減小(P<0.05)，外膜增生程度降低。詳見表2。球囊損傷左側(cè)頸總動(dòng)脈后7 d各組HE染色結(jié)果見圖1。

表2 各組血管內(nèi)、中、外膜面積和厚度的變化(±s)

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為阿托伐他汀組；D為血府逐瘀組；E為益氣活血解毒組。

2.3 血管壁各層MCP-1表達(dá)的變化 球囊損傷后7 d，血管內(nèi)、中、外膜MCP-1的表達(dá)與未損傷血管比較均有增加。與模型組相比，各藥物組損傷血管壁MCP-1表達(dá)的總光密度均有不同程度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表3。血管壁各組MCP-1的表達(dá)見圖2。

表3 各組球囊損傷后7 d血管MCP-1總光密度的變化(±s)

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為阿托伐他汀組；D為血府逐瘀組；E為益氣活血解毒組。

2.4 血管壁各層CD68表達(dá)的變化 球囊損傷后7 d，各手術(shù)組的整個(gè)血管壁CD68的表達(dá)均有不同程度增加。模型組內(nèi)膜CD68稍有表達(dá)，中膜表達(dá)顯著(P<0.05)，外膜表達(dá)最為明顯(P<0.01)；與模型組比較，各藥物組內(nèi)膜、中膜、外膜CD68的表達(dá)均不同程度下降，血府逐瘀組與益氣活血解毒組血管外膜CD68平均光密度明顯低于阿托伐他汀組和模型組(P<0.05或P<0.01)，益氣活血解毒組中膜CD68水平也明顯低于模型組(P<0.01)。詳見表4。各組血管壁CD68的表達(dá)見圖3。

表4 球囊損傷后7 d各組血管CD68平均光密度的變化(±s)

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為阿托伐他汀組；D為血府逐瘀組；E為益氣活血解毒組。

3 討 論

3.1 外膜炎癥反應(yīng)促進(jìn)血管重構(gòu) 血管重構(gòu)是指血管管腔內(nèi)徑的變化或血管壁結(jié)構(gòu)的改變，即血管腔/壁比例和幾何形狀的改變，其分為擴(kuò)張型重構(gòu)(正性重構(gòu))和收縮型重構(gòu)(負(fù)性重構(gòu))[7]。正性重構(gòu)是血管通過代償性擴(kuò)張以防止管腔狹窄，管腔內(nèi)徑變化不明顯；負(fù)性重構(gòu)是指血管代償不足或血管收縮和內(nèi)膜增生導(dǎo)致管腔狹窄，管腔內(nèi)徑變小[8]。血管內(nèi)膜損傷后同時(shí)伴隨外膜的早期炎癥反應(yīng)[9]，炎細(xì)胞浸潤和產(chǎn)生的大量炎性因子。血管外膜炎癥除引起內(nèi)皮功能的失調(diào)和平滑肌細(xì)胞的增生[10]，還促進(jìn)外膜成纖維細(xì)胞活化成肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞大量增殖，造成球囊損傷早期外膜增厚，炎癥反應(yīng)還同時(shí)促使成纖維細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移，共同參與血管重構(gòu)[11]。本研究通過建立球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈模型，觀察術(shù)后早期(7 d)血管重構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組血管壁面積明顯增大、內(nèi)膜輕度增厚、外膜增生明顯，而管腔面積無明顯變化，表明球囊損傷后早期的血管重構(gòu)主要為正性重構(gòu)。

血管內(nèi)膜損傷后伴隨外膜的早期炎癥反應(yīng)，外膜中有大量的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤及炎性介質(zhì)的釋放[12]。MCP-1屬于趨化細(xì)胞因子家族成員之一，可趨化和激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，這些聚集的細(xì)胞又進(jìn)一步促進(jìn)MCP-1的產(chǎn)生。 MCP-1使單核細(xì)胞趨化并聚集于內(nèi)膜下，刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，是血管成形術(shù)后血管重構(gòu)過程中重要的炎性因子之一[13]。成纖維細(xì)胞是外膜的主要細(xì)胞成分，是血管壁炎癥反應(yīng)的重要參與者，可分泌大量炎癥因子，尤其是MCP-1。MCP-1促進(jìn)單核細(xì)胞趨化至外膜，與外膜成纖維細(xì)胞相互作用后，促使成纖維細(xì)胞大量增殖[14]，導(dǎo)致外膜增厚，進(jìn)一步促進(jìn)血管重構(gòu)發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)：球囊損傷血管后7 d，模型組管壁內(nèi)膜、中膜、外膜MCP-1的表達(dá)均增加，以外膜增加最為明顯，且外膜濃度明顯高于中膜和內(nèi)膜，說明球囊損傷術(shù)后，血管各層細(xì)胞分泌MCP-1增加，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，外膜尤為明顯。巨噬細(xì)胞作為重要的炎癥細(xì)胞于術(shù)后1 d～7 d大量浸潤至血管壁，外膜的巨噬細(xì)胞含量高于中膜和內(nèi)膜，這就進(jìn)一步加重了外膜的炎癥反映。

3.2 益氣活血解毒方的作用 中醫(yī)對血管損傷后再狹窄等血管重構(gòu)性疾病進(jìn)行了長期的探索，活血化瘀是防治該病的基本中醫(yī)治則，并對血府逐瘀湯及芎芍膠囊進(jìn)行了大量的臨床和基礎(chǔ)研究，取得了明顯的研究效果[15-16]。研究證實(shí)：血府逐瘀湯有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，達(dá)到防治動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄的目的[17]。我國第一代著名中西醫(yī)結(jié)合心血管病專家廖家楨教授認(rèn)為：再狹窄的中醫(yī)病因病機(jī)除血瘀外，還有全身和血管損傷部位的氣虛，同時(shí)血管成形術(shù)可導(dǎo)致局部氣血凝滯、經(jīng)絡(luò)阻塞，毒邪壅遏，病變部位可出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤、滲出及增生等，成為中醫(yī)學(xué)中的“內(nèi)生之毒”。這些內(nèi)生之毒蘊(yùn)積局部及全身，導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生。所以提出益氣活血解毒的治則及其方藥，益氣活血解毒方在活血化瘀的基礎(chǔ)上加用補(bǔ)氣和解毒藥，該方由黃芪、丹參、金銀花等組成，黃芪補(bǔ)氣，丹參活血祛瘀通脈，金銀花清熱解毒，體現(xiàn)了益氣活血解毒這一基本治法。現(xiàn)代藥理學(xué)證明：黃芪多糖具有抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用[18]；丹參具有抗纖維化作用，可抑制成纖維細(xì)胞活化和分泌[19]；金銀花有效成分綠原酸能清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化，以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[20]，同時(shí)還具有抗炎作用。這些藥物綜合作用在防治血管重構(gòu)性疾病中發(fā)揮作用。前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：益氣活血解毒方可減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[21]；降低血脂水平，抑制新生內(nèi)膜的增殖，減少增生內(nèi)膜中膠原沉積[22]，對血管外膜有較好的作用[23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：益氣活血解毒組能明顯減少內(nèi)膜面積(P<0.05)，表明對抑制新生內(nèi)膜生成有較好療效，且有一定的抑制外膜增厚的趨勢。同時(shí)，益氣活血解毒組可明顯降低巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD68的表達(dá)，尤其抑制中膜和外膜中巨噬細(xì)胞浸潤的效果明顯。益氣活血解毒組在增加管腔面積和減少外膜厚度方面優(yōu)于血府逐瘀組；在減少巨噬細(xì)胞中膜和外膜浸潤方面優(yōu)于阿托伐他汀組。血府逐瘀組有較好的抑制外膜CD68作用，而阿托伐他汀組無此作用。3組藥物對MCP-1總光密度均無影響。

綜上所述，球囊損傷血管內(nèi)膜早期，血管發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，外膜最為顯著，血管主要為正性重構(gòu)，外膜明顯增厚。益氣活血解毒方能顯著降低球囊損傷后大鼠血管壁各層尤其是外膜細(xì)胞中MCP-1和CD68的含量，從而抑制外膜炎癥，推測可能進(jìn)一步抑制外膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而抑制新生內(nèi)膜的增生。本研究還有待于從細(xì)胞層面進(jìn)一步探討益氣活血解毒方對外膜的作用機(jī)制。

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(本文編輯郭懷印)

The Infcuence of Yiqi Huoxue Jiedu Formula on Early Adventitial Inflammation and Vascular Remodeling after Vascular Injury

Yang Ruixue，Zhao Mingjing，Lei Huan，Chang Hong，Zhao Yizhou，Wu Aiming，Yang Tao，Han Xiaowan，Wang Lei，Li Tong

Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education，Dongzhimen Hospital Attached to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China Corresponding Author：Zhao Mingjing

Objective This study aims to observe early adventitial inflammation and vascular remodeling after balloon injury of vascular intima and the effect of Yiqihuoxuejiedu Formula.Methods The model of left common carotid artery balloon injury with rats was used，and model rats were randomly divided into model group，atorvastatin group，Xuefuzhuyu group and Yiqihuoxuejiedu group with sham group as the control. Seven days after dosing，the area and the thickness of the vascular wall were observeded by HE staining. The levels of monocyte chemoattractant protein1(MCP-1) and the macrophage marker CD68 were assessed by immunohistochemical staining. Results Compared with sham group，the intima area increased(P<0.01)，adventitia thickening grew(P<0.05)and the concentrations of CD68added significantly (P<0.05)，but the lumen area and integrated optical density of MC-1 did not significantly change in the model group. Compared with model group，Yiqihuoxuejiedu Formula could obviously reduce the intimal area (P<0.05) and lower CD68 level remarkably(P<0.01). Compared with Xuefuzhuyu group，Yiqihuoxuejiedu Formula could reduce adventitial thickness obviously. Conclusion The vessel wall mainly presents positive remodeling withadventitia thickening and inflammatory reaction in the early stage of common carotid artery balloon injury. Yiqihuoxuejiedu Formula can improve vascular remodeling effectivelyby the reduction of macrophage infiltration and inhibition of adventitial inflammation.

vascular remodeling；balloon injury；inflammation；Yiqihuoxuejiedu Formula

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81173234)

北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家中醫(yī)藥管理局心脈病證益氣活血重點(diǎn)研究室(北京100700)

趙明鏡，E-mail：mjgx2004@163.com

R331 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.19.008

1672-1349(2016)19-2230-06

2016-02-08)

引用信息：楊瑞薛，趙明鏡，雷環(huán)，等.益氣活血解毒方對血管損傷后外膜早期炎癥和血管重構(gòu)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(19)：2230-2235.